Técnicas de Extracción y Purificación de Proteínas y Ácidos Nucleicos

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UT.4 TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1. INTRODUCCIÓN 2. TECNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MÉTODOS DE RUPTURA CELULAR Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS. MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS PARA LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS. SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS. 3. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS PREPARACIÓN DEL ADN GENÓMICO. PREPARACIÓN DE ADN DE PLÁSMIDOS. PREPARACIÓN DEL ARN. CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. 1.

INTRODUCCIÓN EL ADN, el ARN y las proteínas son la materia prima del trabajo en biotecnología, y estas macromoléculas tienen diferentes propiedades que es bueno tener muy en cuenta en el momento de trabajar con cada una de ellas. o ADN, es una molécula cargada negativamente. Hay un gran número de electrones alrededor de los numerosos átomos de oxígeno. Es una molécula bastante robusta, tal vez la más fácil de trabajar, ya que no tiene demasiados problemas de degradación. o ARN, es bastante similar al ADN, aunque más flexible químicamente y de tamaño más corto.

o Proteínas, es más complicado trabajar con ellas porque los aminoácidos presentan diversas propiedades, cargas eléctricas, características bioquímicas y tamaños moleculares, de manera que el comportamiento químico de las proteínas es muy diverso. La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requiere la purificación, al menos parcial de las sustancias objeto de estudio. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más usuales empleadas para la purificación de proteínas y ácidos nucleicos. 2 2.

TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Las proteínas necesitan ser tratadas con cuidado, ya que suelen agregarse, degradarse por temperatura o la acción de proteinasas o simplemente pierden su actividad enzimática. MÉTODOS DE RUPTURA CELULAR Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS El primer paso en el aislamiento de una proteína es la ruptura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. La elección del método de ruptura depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización.

Los distintos métodos son: o Lisis celular: Consiste en suspender las células en una solución hipotónica, debido a la diferencia de presión osmótica el agua difunde al interior de la célula causando su hinchamiento y ruptura. Es un método valido para células sin pared celular, como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. o Destrucción mecánica: - Homogeneización: hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que se ajustan casi totalmente. - Molienda: en un mortero con alúmina o arena, con un molino de perlas de vidrio. - French press: se hace pasar a las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio.

- Sonicación: someter las células a vibraciones de ultrasonido. 3 o Congelación-descongelación: la ruptura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperaturas, congelando primero a -196 ºC con nitrógeno líquido y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente, unos 25ºC. Tras la ruptura o durante el proceso de ruptura se utilizan tapones de extracción para solubilizar las proteínas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado celular que contiene una mezcla de moléculas, membranas y células rotas.

Esta preparación se somete a centrifugación diferencial (10.000-15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles del precipitado. En la figura adjunta se describe el proceso de extracción de proteínas: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. Existen diversos métodos que permiten la cuantificación de proteínas, aunque no existe un sistema totalmente satisfactorio para determinar la concentración proteica de una muestra. La elección de un método u otro se basa en la naturaleza de la proteína y en la sensibilidad y precisión requeridos.

Los métodos más usados son: 4 o Método de Lowry (Folin-fenol): basado en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los N de los enlaces peptídicos (reacción de Biuret). Para resaltar el color formado en esta reacción y aumentar la sensibilidad, se añade el reactivo de Folin que al ser reducido por los residuos de aminoácidos aromáticos (Tyr y Trp) da un color azulado. o Método de Bradford o de Coomassie: esta basado en la unión directa del colorante azul de Coomassie a la estructura terciaria de las proteínas y aminoácidos específicos. El colorante cambia de color marrón a azul a unirse a proteínas.

o Método espectrofotométricos: se basa en la propiedad de las proteínas de presentar un máximo de absorción a 280 nm, debido al contenido en los aminoácidos tirosina y triptófano. La variabilidad en estos aminoácidos obliga a añadir un factor de corrección aportado por la absorbancia del enlace peptídico a 205 nm. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias de carga, tamaño o afinidad de las diferentes proteínas. El método más usado es la cromatografía en columna.

La columna esta rellena con un material sólido con las características químicas adecuadas (fase estacionaria) y una solución tamponada se pasar a través de la columna (fase móvil). Se aplica el extracto crudo en la parte superior de la columna. Cada proteína se desplazará a distinta velocidad según sus propiedades intrínsecas.

5 Generalmente, estas cromatografías se realizan de una forma semiautomática, la fase móvil se hace pasar a través de una bomba peristáltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de la columna, Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto volumen, después hay que localizar en que tubo o tubos esta la proteína que se pretende purificar. Según el tipo de relleno sólido que se introduzca en la columna podemos tener: o Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel: la fase estacionaria esta constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad. La separación se basa en el tamaño de las partículas.

Las proteínas más grandes, que no pueden penetrar en los poros de las partículas de la matriz de filtración, son eluidas con más rapidez que las proteínas más pequeñas que penetran por los poros de las partículas. o Cromatografía de intercambio iónico: la columna está rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico). Estos grupos cargados están normalmente neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más tendencia a unirse al polímero. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente.

Para despegar las proteínas unidas a la columna se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (con NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas más débilmente retenidas y al incrementar la concentración de la sal saldrán las proteínas más cargadas. 6 o Cromatografía de afinidad: muchas proteínas tienen la capacidad de unirse específicamente a ciertas moléculas, denominadas ligandos, mediante uniones fuertes pero no covalentes. Cuando el extracto con la mezcla de proteínas se aplica a la columna, la proteína de interés se une al ligando inmovilizando a su vez covalentemente a una matriz inerte. Las demás proteínas se eluyen de la columna con el tampón.

Para eluir las proteínas retenidas, se utiliza el incremento de fuerza iónica o alguna molécula que tiene más afinidad hacia el ligando que la proteína de interés. 7 MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS PARA LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS. La electroforesis de proteínas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida (PAGE). Se trata de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en función de la concentración de acrilamida. Durante la electroforesis, la fuerza de un campo eléctrico provoca la migración de las proteínas, y el gel actúa como un filtro molecular, ralentizando la migración de las mismas en función de su relación masa/carga.

Las muestras de proteínas se disuelven en una pequeña cantidad de una disolución tampón, que contiene glicerol para que la muestra se sitúe en el fondo del pocillo. El tampón de electroforesis cierra el circuito. Las proteínas que se han separado en un gel de poliacrilamida pueden ser detectadas por tinción con azul de Coomassie. Los tipos de electroforesis más usados son: o Electroforesis en SDS-PAGE: Las muestras de proteína son tratadas con un detergente aniónico, el dodecilsulfato sódico (SDS), que se une a todas las proteínas en la misma proporción, dando la misma carga a todas, de manera que estas se van a separar solo en función de su masa.

Por este motivo se puede usar este método para estimar el peso molecular de una proteína por comparación con una serie de patrones de peso molecular conocido. 8 o Geles en gradiente de concentración: se usan geles que tiene un gradiente creciente de concentraiçon de acrilamida + bisacrilamida (3 - 30 %), de manera que el gel tiene un gradiente decreciente de tamaño de poro. En estos casos la proteína migra hasta que alcanza una zona donde el tamaño del poro impide cualquier avance. En este tipo de electroforesis se resuelven mejor las bandas, ya que las concentra en regiones muy estrechas.

o Isoelectroenfoque: esta técnica se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH, Las moléculas anfóteras, como los aminoácidos se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo (+) es ácida y la del cátodo (-) es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su punto isoeléctrico (pI) dentro del rango.

Las sustancias que se encuentren inicialmente en regiones de pH inferiores a su pI estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras que aquellas que se encuentren en medios con pH más alto que su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región donde el pH coincidirá con su pI, tendrán carga neta nula y se detendrán. o Electroforesis bidimensional: se basa en separar las proteínas de una mezcla según dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. En una primera dimensión se usa la separación por isolectroenfoque y en la segunda según peso molecular mediante electroforesis en SDS-PAGE. 9 SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS.

La determinación de la composición de una proteína se suele realizar mediante HPLC, que es un tipo de cromatografía en la que el eluyente atraviesa la columna impulsado por una bomba que genera altas presiones. Como fase estacionaria se utilizan resinas de partículas finamente divididas. Permite obtener separaciones con mucha mayor resolución. La proteína, una vez aislada, se hidroliza con HCl 6 M a 100 ºC y en vacío duran 24-72 h. Se obtiene un hidrolizado formado por los aminoácidos individuales, que se trata con fenilisotiocianato (Phe NCS), de forma que los aminoácidos se transforman en PTC-aminoacidos. Esta mezcla se separa en HPLC en función de la hidrofobicidad de cada aminoácido.

La columna de cromatografía tiene un detector de absorción UV-Vis que cuantifica la cantidad de cada uno de los aminoácidos que sale de la columna. Este método permite determinar la composición de una proteína, pero no su estructura primaria. El método de Edman es una técnica que permite la eliminación secuencial de un solo aminoácido en cada etapa, pudiéndose determinar la secuencia primaria de la proteína de una forma sencilla. La cadena polipeptídica consta de un extremo con un grupo amino libre y otro con un grupo carboxílico. Para identificar los aminoácidos que forman esa cadena se realizan repeticiones cíclicas de los siguientes pasos: 10 1.

Marcar: el aminoácido del extremo aminoterminal reacciona con fenilisocianato (Phe-NCS) y se convierte en feniltiocarbamoil (PTC). Es importante destacar que solo reacciona con este aminoácido, de tal forma que el resto de la cadena polipeptídica queda intacta. 2. Eliminar: añadiendo un segundo reactivo, ácido trifluoroacético anhídrido, y ácido clorhídrico concentrado (6M) se elimina el PTC (aminoácido transformado) y se separa del resto de la cadena. 3. Identificar: una vez que se ha separado el residuo de la cadena polipeptídica, se procede a su identificación.

Este ciclo se repite periódicamente, de tal manera que, al final de ciclo, cuando se ha separado e identificado un aminoácido, se dispone del resto de polipéptido "nuevo extremo" aminoterminal que inicia un nuevo ciclo. En resumen, como la identificación se realiza en el orden en que van apareciendo los aminoácidos, se puede obtener la secuencia de la proteína. Este método es muy útil, pero para poder obtener la secuencia de proteínas de más de 100 aminoácidos es necesario usar una combinación de varias técnicas: 1. Ruptura de puentes disulfuro, que mantienen unidas mediante enlaces covalentes partes 11 internas de la proteína o varias cadenas polipeptidicas.

Para conseguirlo se usa β mercpatoetanol (rompen los enlaces -S-S-) y un agente alquilante como el yodoacetato (bloquea los residuos -SH). 2. Ruptura de la proteína por localizaciones marcadas por ciertos aminoácidos. Se emplean reactivos químicos como bromuro de cianógeno (Met) o enzimas como la tripsina (Lys y Arg) o quimiotripsina (aminoácidos aromáticos). 3. Secuenciación de Edman de los fragmentos obtenidos a partir de las etapas anteriores. 12 3.

TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Es más difícil trabajar con ARN que con ADN, debido a la inestabilidad que presenta y lo hace aun mas complicado la gran cantidad de RNAsas altamente estables presentes habitualmente en cualquier ambiente que lo degradan rápidamente. Las RNAsas, además de estar en todas partes, no requieren de cofactores ni cationes divalentes y no son degradadas a temperaturas de 100º C. Por tal motivo debe trabajarse en condiciones de máxima asepsia y tratar los reactivos y materiales de trabajo con agua libre de RNAsas (mediante tratamiento con dietilpirocarbonato, DEPC).

La aplicación de diferentes técnicas de biología molecular para el análisis de genomas complejos depende en gran medida de la habilidad para preparar un DNA genómico de alta pureza. Por eso es extremadamente importante ser meticuloso al aislar ADN genómico. Recomendaciones generales a tener en cuenta: o Usar siempre guantes. o Mantener en hielo las muestras, enzimas y las soluciones tampón que contengan enzimas a no ser que contengan detergentes o que se especifique una temperatura determinada. o Las cadenas largas de ADN genómico se pueden romper por fricción mecánica, para evitarlo no hacer mezclas demasiado vigorosas, (con vortex o con la pipeta). Mejor ser cuidadoso que tosco.

o Prevenir al máximo posibles contaminaciones. Si la muestra se ha contaminado en un paso, los siguientes pueden verse afectados y en el peor de los casos se puede perder el ADN de una muestra (por posible degradación por nucleasas). Para evitarlo es prudente ser consciente de las diferencias entre las muestras y, por ejemplo, evitar emplear los mismos utensilios para muestras diferentes. 13 ETAPAS BÁSICAS DE LA PURIFICACIÓN DE ADN Cuando se extrae ADN genómico se quiere obtener un conjunto de alto peso molecular del ADN que contiene la célula, virus o muestra de tejido.

La extracción del ADN genómico como materia prima en biotecnología sirve para varios propósitos, como diagnóstico médico, identificación forense, etc. La extracción y purificación del ADN genómico puede dividirse en las siguiente etapas: 1. Ruptura celular 2. Eliminación de otros componentes 3. Concentración Existen diversos protocolos adaptados a las características de cada muestra, ya sea de tejido vegetal, animal o cultivo bacteriano. A continuación describiremos un método general con el fin de visualizar los pasos requeridos y los reactivos que normalmente se utilizan. Ruptura celular. Para obtener el ADN de una célula es preciso romperla antes.

Además, en el caso de que las células formen parte de un tejido, es necesario romper el mismo en partes muy pequeñas para liberar a las células. Este proceso, denominado trituración, se realiza utilizando un mazo y un mortero. Normalmente, el tejido es congelado en nitrógeno líquido antes de triturarlo, por una parte para evitar la degradación enzimática del DNA y por otra para facilitar la trituración del mismo. A continuación, las células liberadas se pueden romper por varios métodos: o Métodos físicos: congelación-descongelación, presión, ultrasonidos, choque osmótico, etc. 14 o Métodos químicos: se usan detergentes (SDS, Triton X-100) que rompen la membrana celular.

o Métodos enzimáticas: usan enzimas (lisozima) que degradan las paredes y las membranas celulares. Eliminación de otros componentes La siguiente etapa consiste en eliminar los restos celulares, lípidos y proteínas y otros ácidos nucleicos que quedan después de la ruptura de las células. Esta purificación se realiza en los siguientes pasos: o Centrifugación: se consigue eliminar los restos celulares (restos de membranas, etc), que quedan en el pellet, mientras que en el sobrenadante encontramos las biomoléculas solubles en agua (ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, etc.).

o Eliminación de lípidos y proteínas: se usan los siguientes procedimientos: Enzimas: se añaden proteasas, enzimas que degradan las proteínas, una de las más empleadas es la Proteinasa K. 15 Extracciones con disolventes orgánicos: algunas biomoléculas son solubles en disolventes orgánicos, por lo que se emplean combinaciones en proporciones adecuadas de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. En la figura se observa que contiene cada fase tras la extracción: Fenol: desnaturaliza proteínas. Cloroformo: solubiliza lípidos y estabiliza la fase orgánica.

Alcohol isoamílico: es antiespumante o Eliminación de otros ácidos nucleicos: el RNA que pueda contaminar la muestra es eliminado por la acción de la enzima RNAsa, que lo degrada. Concentración Para obtener una muestra de DNA con la concentración necesaria se realiza una precipitación con: o Una sal (acetato de amonio, NaCl) que ayuda a neutralizar la carga negativa del DNA, además de nteractuar directamente con el agua reduciendo su poder disolvente, favoreciendo así la precipitación del DNA. o Un alcohol al 100 % (etanol o isopropanol), en alcoholes con concentración superior al 65 % el ADN tiende a permanecer precipitado.

A veces se prefiere el isopropanol porque el ARN permanece disuelto en ese disolvente (precipitación selectiva). 16 A la disolución de ADN purificado se le añade sal y etanol, se mezcla suavemente por inversión y se centrifuga. Después de retirar el sobrenadante, el pellet de ADN se lava con etanol, que después es eliminado. Finalmente el pellet se deja secar al aire y se resuspende en tampón Tris o en agua. Purificación de ADN mediante kits comerciales. También existen Kits comerciales para extracción y purificación de ADN genómico. Algunos utilizan columnas para retener el ADN mediante dilución diferencial y otros se valen de microesferas magnéticas para aislar el ADN en solución.

Generalmente los kits utilizan esferas de silicagel diseñadas para interactuar con las moléculas altamente electrostáticas del ADN. El procedimiento general incluye: o Tratamiento del tejido con una solución de sal caotrópica que modifica la estructura de las moléculas e interactúa fuertemente con el agua reduciendo sus propiedades como solvente. Esto cambia la estructura del DNA al igual que su carga eléctrica, lo que favorece su unión a las esferas de silicagel. o Luego se realiza un lavado con una disolución de etanol y agua para eliminar contaminantes. Si en este paso se usa solo agua, el DNA se disuelve y despega de las esferas de silicagel.

o Por último, se eluye el ADN con agua o un tampón apropiado. 17 PREPARACIÓN DE ADN DE PLÁSMIDOS. El aislamiento de ADN de plásmidos se basa principalmente en la diferencia de tamaños entre el ADN genómico de la bacteria y el plasmídico. Así se emplea un primer paso de desnaturalización seguido por un paso de rápida renaturalización. Como el ADN plasmídico es pequeño tiende a volver a su forma incial mucho más rápidos y queda en disolución, mientras que el ADN genómico, por ser muy grande, y complicado, tarda mucho en renaturalizar y se precipita. Por último una centrifugación aísla el ADN plasmídico en solución del genómico.

Existen dos métodos ampliamente usados para aislar el ADN de plásmidos: o Lisis por calentamiento: se utiliza un tampón y lisozoma y se incuba a 100 ºC durante 40 seg. Se centrifuga para separar los restos celulares de la solución de ADN plasmídico y finalmente se precipita el ADN purificado como en el caso del ADN genómico. o Lisis alcalina: se emplean SDS y NaOH, el cual desnaturaliza todo. Al agregar una sal ácida, para llevar todo a un pH neutro, se favorece el proceso de precipitación del ADN genómico, mientras que el ADN plásmidico ha renaturalizado más rápido y se mantiene en disolución. 18 PREPARACIÓN DE ARN.

El ARN es muy inestable, principalmente por su susceptibilidad a ser degradados por RNAsas, enzimas que necesitan cationes divalentes para realizar su función. En diferentes reacciones donde se emplea ARN se incluyen inhibidores de ARNasas para prevenir la degradación del ARN molde. Los más empleados son el Dietil pirocarbonato (DEPC), cloroformo, SDS y productos comerciales (se suelen usar en la limpieza de equipos de laboratorio).

Un método general para aislar ARN empela las siguientes etapas: o Lisis con detergente y fenol ácido: para desnaturalizar proteínas, eliminar ADN y estabilizar ARN o Centrifugación para eliminar contaminantes, quedando el ADN en la fase acuosa superior o Precipitación y lavado con etanol o Tratamiento con DNAsas. Aislamiento de mRNA El RNA total se compone aproximadamente de un 80 % de rRNA, 15 % de tRNA y menos de un 5 % de mRNA. En el análisis de la expresión de genes el objeto de estudio es el mRNA, de forma que cuanto más puro este, mejores serán los resultados.

Para purificar el RNA del resto de los RNAs se utiliza el hecho de que el mRNA tenga una cola poli A en el extremo 3', que se añade durante el proceso de maduración del mRNA. Se utiliza una cromatografía de afinidad por oligo dT, los cuales se unen a la cola poli A por puentes de de hidrógeno: 19 CUANTIFICACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS Por espectrofotometría. Este método se basa en la absorbancia de la luz ultravioleta (260-280 nm) que presentan las moléculas de ADN y ARN. Este es un método aproximado, ya que hay otras moléculas que también absorben a esa longitud de onda. Las mediciones dependen en gran medida del pH del medio.

Para determinar la pureza de la muestra se calcula en cociente entre los valores de absorbancia a 260 y 280 nm. o Una muestra de ADN de pureza aceptable debe presenta una relación A260/A280 1,8.Para realizar un cálculo estimativo de la cantidad de ADN se emplea la siguiente expresión: A260 · 50 μg/ml · factor de dilución = X μg/ml ADN o En el caso del ARN, una muestra aceptablemente pura debe tener una relación A260/A280 2 y para cuantificar se usa: A260 · 40 μg/ml · factor de dilución = X μg/ml ARN Por comparación con patrones conocidos. Este método se basa en la unión estequiométrica de moléculas fluorescentes como el bromuro de 20 etidio o ciertos tintes.

Se tratan varias muestras de ADN de concentración conocida y del problema y mediante comparación visual se determina la concentración aproximada de la muestra. El bromuro de etidio es altamente cancerígeno y siempre hay que manipularlo con guantes y evitar cualquier contacto con la piel. Es un colorante con un grupo planar que se intercala entre las bases del ADN. MÉTODOS ELECTROFORETICOS DE SEPARACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Las diferentes moléculas de DNA pueden separarse en función de su tamaño por electroforesis en gel de agarosa de forma similar al método visto para proteínas (SDS-PAGE).

En este caso, usamos un gel de agarosa colocado entre dos electrodos y sumergido dentro de una disolución tampón. La muestra se coloca en los pocillos del gel y se someten a un campo eléctrico. Como los ácidos nucleicos están cargados negativamente (debido a los grupos fosfato), migran hacia el electrodo positivo. El gel de agarosa actúa como un tamiz molecular retardando selectivamente el movimiento de las moléculas más grandes, mientras que las moléculas más pequeñas se mueven a través del gel más rápidamente, permitiendo la separación de una mezcla de fragmentos de ácidos nucleicos según su tamaño.

Por último, para visualizar las bandas, se utiliza un colorante fluorescente, generalmente bromuro de etidio, aunque debido a su mutagenicidad se han comercializado otros colorantes menos peligrosos como el SYBR green. También colorantes comerciales que tiñen el ADN de azul, sin 21 necesidad de usar la lámpara UV para visualizarlos. SECUENCIACIÓN DE DNA La secuenciación del ADN es uno de los temas más importantes de la investigación en biotecnología, por este motivo existen varias técnicas que permiten conocer la información de dichas macromoléculas.

Vamos a describir dos de los métodos más utilizados: Método de Sanger Para llevar a cabo este proceso se necesitan los siguientes recursos: o La enzima ADN-polimerasa. o El ADN que se desea descodificar en forma monocatenaria. o Cebador complementario a la cadena de DNA a secuenciar. o Los cuatro nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). o Los cuatro nucleótidos didesoxi (ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP). Un desoxinucleótido es el nucleótido correspondiente modificado de tal forma que ha perdido su grupo hidroxilo en la posición 3'. Para iniciar la secuenciación se deben realizar 4 mezclas. Cada una de ellas debe contener los 4 22 nucleótidos, la ADN-polimerasa y el cebador.

Además, en cada una de las mezclas se debe introducir un nucleótido didesoxi distinto. El proceso que se lleva a cabo se inicia con la adhesión de los cebadores en la parte de la cadena de DNA correspondiente, entonces se inicia la replicación del ADN molde gracias a la acción de la enzima. En el orden en que la cadena molde vaya informando, la enzima añadirá los nucleótidos necesarios para completar la cadena de nueva creación. Este proceso se va realizando simultáneamente en una gran cantidad de moléculas de ADN, por lo que, estadísticamente, cada vez que se deba añadir una nueva base, algunas de esas moléculas no añadirán un nucleótido, sino que añadirán un nucleótido didesoxi.

Estos últimos tienen la particularidad de haber "perdido" el grupo –OH del carbono 3', por lo que, en el momento en que se incorporan en la cadena que se está formando, finalizan la reacción, puesto que no disponen de la capacidad de introducir el siguiente nucleótido. Así pues, la cadena se irá replicando al mismo tiempo en los 4 recipientes, de tal forma que en cada uno van quedando algunas cadenas finalizadas cuando se incorpora un nucleótido correspondiente al didesoxi introducido en ese recipiente. Cada vez que se introduce un nucleótido, existe la probabilidad (y de hecho sucede) de que en alguna de las cadenas, en lugar de X (A, T, C, G), se introduzca ddX (ddA, ddT, ddC, ddG).

A continuación se colocan muestras de los 4 recipientes en 4 carriles distintos del gel y se separan por electroforesis. De esta manera se puede deducir el orden y la composición de la cadena que se ha sintetizado. A su vez, esta es la cadena complementaria de la cadena inicial, por lo que indirectamente se puede determinar la secuencia problema inicial. En la figura siguiente se puede observar el proceso más claramente: 23 Método automático de secuenciación En este método se utiliza fluorescencia para detectar cada nucleótido. Se realizan cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto.

Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación. 24 CUESTIONES y EJERCICIOS 1.

Una mezcla de dos proteínas, A y B, se carga en una columna DEAE-Sepharosa equilibrada con tampón Tris-HCl (pH 8) 20 mM y se eluye con un gradiente lineal de 20 a 250 mM KCl. La proteína A eluye de la columna con una concentración de 75 mM KCl y la proteína B los hace con una concentración 150 mM. ¿Cual de estas dos proteínas está más cargada negativamente? 2. Queremos aislar una proteína A de una mezcla de proteínas por cromatografía en columna. El sustrato de esta enzima ha sido unido covalentemente a la resina de la columna. Cuando aplicamos la mezcla de proteínas solo nuestra proteína A se queda retenida, el resto se eluye. ¿Que tipo de cromatografía hemos llevado a cabo? 3.

Dos proteínas, A y B con 100 aminoácidos cada una tiene una secuencia idéntica en un 85 %. A la concentración de 0,1 mM la proteína A muestra una fuerte absorción a 280 nm, mientras que la proteína B a la misma concentración muestra una débil señal. ¿Como explicarías estas diferencias? 4. Un péptido tiene la siguiente composición de aminoácidos: Ala, Arg, Asp2, Glu2, Gly3, Leu, Val3. Después de una hidrólisis parcial se aislaron estos péptidos y se determinaron sus secuencias: 1. Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala 2. Val-Asp-Val-Asp-Glu 3. Val-Asp-Val 4. Glu-Ala-Leu-Gly-Arg 5. Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg 6. Leu-Gly-Arg ¿Cual es la secuencia de aminoácidos del péptido inicial? 5.

Las bacterias contienen información genética en su cromosoma bacteriano y en los plásmidos. Explica que es un plásmido y como podrías obtener el DNA plasmídico separado del DNA cromosómico. 6. Para conocer que genes está expresando una célula eucariótica es necesario aislar el mRNA que está transcribiendo dicha célula. Describe un proceso por el cual puedes separar dicho mRNA de otros RNAs que pueda haber presentes. 7. Se obtuvo una muestra de DNA a partir de un tejido de un animal. A una alícuota de 10 μl de dicha muestra se le añadieron 90 μl de tampón apropiado, se mezcló cuidadosamente y después se midió la absorbancia a 260 y a 280 nm.

Los resultados obtenidos fueron: A260 = 0,386 A280 = 0,198 Calcula: a. La pureza de la muestra. ¿Es aceptable dicha pureza? Explica tu respuesta. b. La concentración de DNA en la muestra. 25 CUESTIONES TIPO TEST 1. ¿Cual es el primer paso en la extracción y purificación del DNA? a. Neutralización del medio. b. Centrifugación. c. Lisis celular. d. Precipitación con etanol. 2. Indica cual es la función de cada uno de los siguientes reactivos en la extracción y purificación de DNA: a. SDS: b. Lisozima: c. Cloroformo: d. Sal (AcNa o NaCl): 3. Tras la extracción con disolventes orgánicos, el DNA se encuentra en: a. Fase acuosa. b. Fase orgánica. c. Interfase. d. Pellet. 4.

¿Cuál de los siguientes reactivos permite precipitar al DNA? a. Lisozima. b. Etanol. c. Proteínasa K. d. SDS. 5. La electroforesis se basa en el movimiento de moléculas a través de: a. Un campo magnético. b. Un sólido. c. Un campo eléctrico. d. Un líquido. 6. ¿Cuál es el reactivo empleado para realizar un gel de electroforesis para el DNA?: a. Agarosa. b. Poliacrilamida. c. SDS d. Lisozima 7. ¿Qué técnica permite separar fragmentos de DNA por su tamaño? a. Electroforesis en SDS-PAGE. b. Electroforesis en un gel de agarosa. c. Cromatografía de exclusión molecular. d. Cromatografía de afinidad. 8. El método de Sanger de secuenciación del DNA utiliza, entre otros: a. Los cuatro ddNTP b.

Los cuatro dNTP c. DNA polimerasa. d. Todos los anteriores. 26 9. Para obtener las proteínas, una vez rotas las células, el lisado celular es sometido a un proceso de: a. Centrifugación diferencial. b. Cromatografía de afinidad. c. Extracción con disolventes orgánicos. d. Electroforesis en SDS-PAGE. 10. La cromatografía de afinidad separa a las proteínas en función de: a. Su tamaño. b. Su carga iónica neta. c. Su especificidad por un ligando. d. Su punto isoeléctrico. 11. La cromatografía de intercambio iónico separa a las proteínas en función de: a. Su tamaño. b. Su carga iónica neta. c. Su especificidad por un ligando. d. Su punto isoeléctrico. 12.

Una electroforesis en SDS-PAGE separa a las proteínas en función de: a. Su tamaño. b. Su carga iónica neta. c. Su especificidad por un ligando. d. Su punto isoeléctrico. 13. Un isoelectroenfoque separa a las proteínas en función de: a. Su tamaño. b. Su carga iónica neta. c. Su especificidad por un ligando. d. Su punto isoeléctrico. 14. Las proteínas absorben radiación ultravioleta de longitud de onda 280 nm debido a la presencia de: a. Aminoácidos aromáticos como Tyr y Trp. b. Aminoácidos básicos como Arg, His y Lys. c. El enlace peptídico. d. Aminoácidos ácidos como Asp y Glu. 15. El método Edman de secuenciación de proteínas consta de los siguientes pasos: a.

Marcar el último aminoácido con HCl y eliminarlo con CF3COOH. b. Marcar el último aminoácido con Phe-SCN y eliminarlo con HCl. c. Marcar el último aminoácido con CF3COOH y eliminarlo con Phe-SCN. d. Marcar el último aminoácido con Phe-SCN y eliminarlo con CF3COOH y HCl. 27