Introducción a la Microbiología y Control del Crecimiento Microbiano

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¿QUÉ ES LA MICROBIOLOGÍA? La microbiología es una rama de la biología que estudia los microorganismos en su naturaleza, vida y acción. También, estudia la diversidad y la evolución de las células microbianas, cómo surgieron los distintos tipos de microorganismos y por qué. Estudia en qué lugares del planeta habitan los microorganismos, cómo se asocian y cómo cooperan entre sí. Los microorganismos son organismos invisibles para el ojo humano a simple vista (menores a 100 um). El límite de resolución es la menor distancia que tienen dos objetos para ser distinguidos como dos entidades separadas. El límite de resolución del ojo humano es de 100 um.

Como ciencia básica, la microbiología usa las células microbianas para investigar los procesos fundamentales de la vida. Como ciencia aplicada, los microorganismos tienen importancia en avances en la medicina, la veterinaria, la agricultura y la industria. Las ramas de la microbiología son: Bacteriología: Estudia las bacterias, microorganismos procariotas unicelulares. Micología: Estudia los hongos, microorganismos eucariotas. Parasitología: Estudia los parásitos, microorganismos eucariotas que pueden ser unicelulares (protozoarios) o multicelulares (helmintos) Virología: Estudia los virus, parásitos intracelulares obligados.

Un virus es un agente microscópico compuesto por una molécula de ADN o ARN envuelta en una cubierta de proteínas. Carecen de la capacidad de reproducirse por sí mismos, deben infectar a las células y usar componentes de la célula huésped para fabricar copias de sí mismo. Son más pequeños que las células. En algunos casos, la parte externa de los virus tiene proteínas especializadas, llamadas espículas. HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA La microbiología no se desarrolló hasta mediados del siglo XIX. Robert Hooke en 1664 construyó el primer microscopio compuesto y describió a diversos organismos, como los cuerpos fructíferos de los mohos.

Antonie van Leeuwenhoek en 1684 construyó un microscopio simple sobre una placa de cobre y describió organismos procariotas. Ante el descubrimiento de los microorganismos, surgió la teoría de la generación espontánea. Esta teoría postula que algunos microorganismos se originaban en forma espontánea de la materia inerte. El experimento de Francisco Redi consistió en colocar 3 frascos, uno tapado por una gasa, otro descubierto y otro tapado con una tapa de forma hermética. Las moscas solo aparecieron en el frasco descubierto, demostrando que los gusanos (larvas) son depositados por moscas que provienen del exterior.

Sin embargo, John Needham realizó un experimento que consistió en hervir caldo de carne en matraces para destruir microorganismos, pero al sellarlos mal y observar bacterias días después, concluyó erróneamente que la vida surgía por generación espontánea a través de una "fuerza vital" en el aire. El experimento del caldo de Louis Pasteur puso fin a la teoría de la generación espontánea. Se utilizó una matraz de cuello de cisne y se hirvió distintos caldos en ella. El cuello permitió que no ingresen microorganismos al caldo aunque si entraba aire al mismo, pero al rotar la matraz el caldo se contaminaba.

Así surgió la teoría de la biogénesis, que establece que todo ser vivo proviene de otro ser vivo preexistente. Hasta fines del siglo XIX existía una teoría de las "miasmas". Según esta esta teoría los miasmas, que eran el conjunto de emanaciones fétidas de suelos y aguas impuras, eran la causa de las enfermedades transmisibles. La teoría microbiana de las enfermedades propuso la relación entre los microorganismos y las enfermedades. A mediados del siglo XIX, Joseph Lister desarrolló un sistema de cirugía aséptica para evitar que los microorganismos infectaran las heridas, esterilizando con calor los instrumentos quirúrgicos.

Además, Ignac Fulop descubrió que las mujeres ingresadas que daban a luz tenían mucha más fiebre que las que daban a luz en sus hogares debido a la falta de lavado de manos por parte de los médicos. Robert Koch estableció la relación entre el carbunco y el Bacillus Anthracus, y descubrió la causa de la tuberculosis. Planteó los "Postulados de Koch" de la microbiología médica moderna: 1. El agente patógeno debe estar presente en los animales enfermos y ausente en los animales sanos. 2. El agente debe ser cultivado en un cultivo axénico puro aislado del cuerpo del animal. 3. El agente aislado en el cultivo axénico debería causar la enfermedad al ser introducido en un animal sano 4.

El agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en los animales de experimentación y ser exactamente el mismo al aislado originalmente. TAXONOMÍA La taxonomía es una disciplina que busca definir y nombrar grupos de organismos biológicos en base a características compartidas.

Usa una jerarquía de categorías desde el grupo más inclusivo hasta el más reducido: Dominio: Puede ser Eukarya (organismos eucariotas), Bacteria (bacterias) o Archaea (Arqueas) Reino: Animalia (animales), Plantae (vegetal), Fungi (hongos), Protista (algas y protozoos), bacteria y archaea Filo: Clase: Orden: Termina en -ales Familia: Termina en -aceae Género: Primer palabra de la especie Especie: Nombre completo, que incluye al género como primera palabra y al epiteto como segunda palabra. La nomenclatura binomial es una forma científica de nombrar a los seres vivos. Para nombrar a una especie, se utiliza el género como primer palabra y la especie como segunda (se incluyen las dos).

Ejemplo: Thermus aquaticus. Las dos palabras van en cursiva y la primera letra del género siempre va en mayúscula. Se puede encontrar un código de letras y números que se denomina CEPA (no va en cursiva). Una cepa es un grupo de organismos que pertenecen a la misma especie, pero que comparten ciertas características genéticas que no se encuentran en otros miembros de dicha especie. Se le dice spp cuando no conozco a la especie.

DIVERSIDAD La diversidad de los microorganismos se manifiesta a través de: La variación en tamaño y forma celular La adaptación a condiciones ambientales Las estrategias metabólicas El tipo de movilidad Los mecanismos de división celular Los dominios evolutivos tienen ciertas diferencias celulares: Bacteria: Son procariotas, no contienen un núcleo separado por una membrana. No poseen organelas membranosas. Tienen endosporas. Su pared celular tiene peptidoglucano. Son sensibles al cloranfenicol, a la kanamicina, a la estreptomicina y a la penicilina. Pueden crecer en temperaturas desde 70°C hasta 100°C.

Arquea: Aunque no tienen un núcleo separado por una membrana al igual que las bacterias, presentan enlaces éter en los lípidos de la membrana. Pueden crecer en zonas extremas (a partir de los 70 o 100°C). No realizan fotosíntesis. Eukarya: Son eucariotas, su núcleo está rodeado por una membrana y tienen organelas membranosas. No tienen endosporas, ni vesículas de gas, ni Gránulos de almacenamiento de poli-R-bidroxialcanpatos. No pueden fijar nitrógeno ni hacer procesos de nitrificación y desnitrificación. No tienen un metabolismo energético basado en rodopsinal. No crecen por encima de los 70°C.

Su mecanismo flagelar es a tirones Los microorganismos extremófilos son un grupo de seres vivos (arqueas y bacterias en su mayoría) que prosperan en condiciones ambientales extremas, como altas o muy bajas temperaturas, salinidad, acidez y presión. Se esperaría encontrarlas en zonas volcánicas o polares, lagos salinos y profundidades oceánicas. Pueden ser útiles para la humanidad debido a sus enzimas, ya que podrían ayudar en la biorremediación y el desarrollo de fármacos o para la industria. Además, estos organismos tienen propiedades colectivas que definen los límites fisicoquímicos de la vida.

Los microorganismos extremófilos pueden ser: Hipertermófilos: Habitan ambientes con temperaturas muy altas (mínimo 90°C) Psicrófilos: Habitan ambientes con temperaturas muy bajas (mínimo -12°C y máximo 10°C) Ácidofilos: Habitan ambientes con pH muy ácidos Alcalofilos: Habitan ambientes con pH altos Barófilos: Habitan ambientes con altas presiones Halófilos: Habitan ambientes salinos. Los microorganismos pueden ser autótrofos o heterótrofos. Los organismos autótrofos son organismos que producen su propio alimento a partir de sustancias inorgánicas como la luz solar o compuestos químicos.

Los organismos heterótrofos son organismos que se alimentan al tomar materia orgánica de otros seres vivos, y no pueden conseguir alimentos por sí mismos. Un organismo fotosintético es un organismo que puede capturar energía lumínica solar para producir glucosa, oxígeno y agua. Su característica subcelular son los cloroplastos, que contienen pigmentos que permiten captar la energía lumínica. Su característica metabólica es el anabolismo, ya que transforman sustancias simples en compuestos complejos. Las cianobacterias son bacterias que pueden realizar la fotosíntesis y se encuentran en ambientes acuáticos. Las bacterias pueden presentar forma de bacilo (alargados) o cocos (forma circular).

A su vez, pueden agruparse como estreptos (una cadena) o estafilos (agrupación en forma de racimo de uva) LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO El control del crecimiento microbiano tiene como finalidad reducir la carga o el número de microorganismos viables presentes en un material, alimento o en una solución. Este control puede realizarse mediante diversos métodos (químicos o físicos) que permiten la eliminación total del microbio o la inhibición de su crecimiento. Aquellos que provocan la destrucción total de los microorganismos tienen la terminación -cida y -lítico.

Los bactericidas matan a la célula sin romperla, mientras que los bacteriolíticos destruyen la célula (estallan la integridad de la bacteria). Los agentes que terminan en -státicos inhiben el crecimiento, pero al quitar el agente los microorganismos pueden seguir reproduciéndose (proceso reversible). Los diferentes tipos de microorganismos tienen una resistencia intrínseca debido a características propias. Algunos factores que influyen en la resistencia de los organismos son la estructura de la pared celular, la baja permeabilidad de la membrana y el metabolismo del microorganismo. Aquellos que forman esporas van a ser más resistentes a la erradicación.

Para evaluar el tipo de agente que utilizaremos, es importante determinar la concentración mínima (mínima cantidad necesaria del agente para poder observar su efecto). Para ello, se deben realizar diluciones seriadas de 1/10 del agente microbiano. Se cultiva el microorganismo blanco con las diluciones seriadas en diferentes tubos. Transcurrido un tiempo, se observa la cantidad de células viables y analizo donde dejo de ver crecimiento. Términos Esterilización: Uso de procedimientos físicos o químicos para destruir completamente los microorganismos, incluyendo a las endosporas. Completamente irreversible.

Desinfección: Proceso en el que se eliminan los microorganismos reconocidos como patógenos, pero no necesariamente se eliminan todas las formas microbianas. Descontaminación: Procedimiento o tratamiento al que se someten los dispositivos e instrumentos médicos o superficies de trabajo para garantizar su seguridad en la posterior manipulación. Puede requerir esterilización, desinfección o técnicas asépticas como la limpieza con agua y jabón. Antisepsia: Uso de germicidas sobre la piel o el tejido vivo, con el objetivo de inhibir o eliminar los microorganismos.

MÉTODOS DE ELIMINACIÓN DE MICROORGANISMOS Esterilización por calor seco y calor húmedo Tratamientos industriales de esterilización como la Pasteurización y la Tindalización Esterilización por filtración Esterilización por radiación Esterilización por tratamiento químico ESTERILIZACIÓN POR CALOR Es el método más utilizado para la esterilización de microorganismos. Se pueden definir tres temperaturas cardinales para los microorganismos: Temperatura mínima: Por debajo de esta temperatura el microorganismo no es viable, ya que se enlentece su metabolismo o la membrana citoplasmática pierde su estado fluido. Temperatura óptima: El microorganismo puede crecer a una velocidad aceptable.

Temperatura máxima: El microorganismo no vive ya que se inactivan enzimas fundamentales para su crecimiento. A altas temperaturas se puede conseguir la muerte de la mayoría de los microorganismos. Para definir la sensibilidad de un microorganismo al calor, se utilizan dos parámetros: Tiempo de reducción decimal: Es el tiempo en el que el calor consigue una reducción del 90% de la población de microorganismos a una temperatura determinada. Los organismos mesófilos tienen tiempos de reducción mucho menores que los termófilos e hipertermófilos. Tiempo de muerte térmica: Tiempo que tarda en morir toda la población de microorganismos presente en una muestra, que depende de la población inicial.

Esterilización por calor seco Se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. Se usa para materiales termoestables (la temperatura no los deforma ni altera sus propiedades iniciales). No puede usarse para materiales termosensibles. No todos los plásticos son termosensibles. El vidrio pirex es termoresistente. Utiliza un Horno Pasteur. El material sale seco del horno. Para materiales de vidrio del laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición a 160°C. Este método permite eliminar los pirógenos, fragmentos de bacterias gram negativas como LPS que activan células del sistema inmune y liberan citoquinas.

Pueden ser tóxicos para los seres humanos. Esterilización por calor húmedo (Autoclave) Un autoclave es un equipo usado para la esterilización por vapor de agua para materiales estables al calor, humedad y presión. Se utiliza mayormente para esterilizar líquidos. Tiene mayor penetrancia el calor en el material a esterilizar. Tiene bajo costo. El autoclave no puede eliminar los pirógenos. Hay que considerar que el líquido que ingresa en el autoclave entra en ebullición, por lo que se suelen llenar los frascos hasta un 75%. El autoclave mantiene unas condiciones de esterilización con una presión de 1atm por encima de la presión atmosférica y una temperatura de 121°C durante 15 minutos.

Los tiempos de esterilización cambian según el volumen del líquido; conviene manejar los mismos volúmenes para distintos materiales. El autoclave tarda más tiempo de lo que lleva la esterilización, ya que el vapor de agua tarda un poco más en ingresar a la cámara cerrada del autoclave y desplazar el aire. Una vez que toda la cámara está llena de vapor, se cierra una válvula (espita) y comienza a subir la presión. Una vez que alcanza las condiciones estandarizadas de presión y temperatura, comienzo a contar los 15 minutos que lleva la esterilización. Cuando pasan los 15 minutos, se abre la esquita y mediante ella empieza a bajar la presión interna y la temperatura.

Los autoclaves se pueden clasificar en: Verticales (el acceso es desde arriba) y horizontales. La diferencia depende del tamaño del autoclave, si es empotrado o móvil. Pueden ser de laboratorio o industriales (del tamaño de un tanque de nafta) Autoclaves de un acceso (se coloca el material y luego se saca desde el mismo acceso) y de doble acceso (usadas cuando el material sin esterilizar entra desde un ambiente y sale desde otro ambiente) Un autoclave de resistencia sumergida tiene una válvula de control de presión, una válvula de seguridad que deja salir la presión de aire en la primera etapa y en la etapa posterior deja salir el vapor.

En la parte inferior, tiene una resistencia cubierta de agua limpia que genera el vapor y una bandeja sobre la que se deposita el material a esterilizar. El vapor se genera por un calentamiento del volumen de agua. Los autoclaves que generan su propio vapor tienen una bomba de vacío que extrae el aire que está dentro de la recámara, y por fuera del autoclave tiene un dispositivo que le inyecta el vapor. Método más rápido ya que no espero que el vapor desplace al aire. Si hablamos de un autoclave tradicional, primero se cierran las puertas de forma hermética. Se purga el aire el aire interior dejando la válvula de seguridad abierta.

Se introduce en la recámara el vapor de aire y se cierra la válvula. Se controla la temperatura y se controla el tiempo. Cuando llego a los 15 minutos se abre la espita y se deja ingresar aire a la recámara. Luego, se abre la tapa que había sido cerrada herméticamente. Los materiales que se envían al autoclave deben estar previamente acondicionados. Se pueden enviar al autoclave tubos eppendorf. Para acondicionarlos, colocamos los tubos en un frasco de vidrio y ponemos una tapa de vidrio y un casco de papel. El vapor atraviesa el papel y el aluminio. Con las puntas de las micropipetas se puede hacer lo mismo. Se las carga en una caja y se les realiza una envoltura de papel.

Es importante rotular todo antes de esterilizar, poner fecha y un indicador de esterilización. Para acondicionar frascos y tubos de ensayos, se utilizan torundas formadas por gasa y algodón. PASTEURIZACIÓN No es un método de esterilización, sino que reduce o controla la carga de microorganismos presentes en una muestra determinada. Se utiliza con productos que tienen componentes que se estropean o no resisten los tiempos y el proceso del autoclave para su esterilización. En el caso de la leche, permite eliminar las bacterias patógenas que se pueden transmitir a través de la leche infectada, como las que causan la tuberculosis, la brucelosis y la fiebre tifoidea.

Existen tres esquemas para la Pasteurización: Tratamiento LTLT: 62,8°C durante treinta minutos. Tratamiento HTST: 71,7°C durante quince segundos. Proceso UHT: Entre 140-150°C durante 2 a 4 segundos. TINDALIZACIÓN Es una técnica utilizada para esterilizar sustancias que no pueden calentarse por encima de los 100°C. Consiste en ciclos sucesivos de calentamiento e incubación. Permite la destrucción de las esporas. Hace que las esporas germinen y luego se destruyan las células vegetativas. Asesino a la célula vegetativa y hago que las esporas se conviertan en células vegetativas y sean eliminadas.

Se somete a la sustancia a una temperatura de 85°C por 45 minutos, y luego se incuba a 37°C por 24 horas. Se repite una vez más el proceso y se vuelve a someter a la sustancia a 85°C por 45 minutos. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN Se utiliza para eliminar microorganismos en líquidos termosensibles. La muestra se esteriliza a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,45 a 0,2 um. No elimina los virus ya que son organismos más pequeños que los poros. Los tipos de filtros son: De profundidad: Es una lámina fibrosa que tiene una trama no homogénea, en la que no hay un tamaño de poro bien definido. Es utilizada en las cabinas de bioseguridad.

Se usan filtros HEPA compuestos por pliegues de acetato de celulosa que filtran el aire. De membrana: Compuestos por polímeros de acetato de celulosa, con poros bien definidos. Se utiliza para volúmenes pequeños con jeringas o bombas de vacío. Se usan filtros Nucleopore hechos de policarbonato que aíslan espécimenes para microscopía electrónica de barrido. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN Utiliza radiaciones ionizantes (RX y gamma) y no ionizantes (Luz UV). Los efectos dependen de la energía de la radiación y la naturaleza del material que queremos irradiar.

La radiación UV solo puede destruir a los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV. Esta radiación es menos penetrante, y suele encontrarse en las cámaras de bioseguridad. Las radiaciones ionizantes destruyen moléculas vitales de los microorganismos. Presentan una alta capacidad de penetración. Se pueden usar rayos gamma de alta energía (emitidas por ciertos isótopos radiactivos) pero son difíciles de controlar. Además, se pueden usar rayos catódicos para esterilizar material quirúrgico, y el material se puede esterilizar después de ser empaquetado.

ESTERILIZACIÓN POR AGENTES QUÍMICOS Los agentes químicos se utilizan para la esterilización de materiales termosensibles. Los agentes químicos se pueden clasificar en: Agentes esterilizantes: Inactivan de forma total todas las formas de vida microbiana, como el óxido de etileno. Agentes desinfectantes: Matan microorganismos patógenos y suelen ser tóxicos sobre tejidos vivos como el hipoclorito de sodio. Agentes antisépticos: Sustancias químicas microbianas con baja toxicidad hacia los tejidos vivos, como las soluciones de yodo.

Quimioterápicos: compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática que tienen una toxicidad lo suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior como los sulfamidas. Los factores que afectan la potencia de un desinfectante son: Concentración del agente y tiempo de actuación. pH y temperatura, que afecta tanto a la carga microbiana superficial como el grado de ionización del agente. Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población microbiana Presencia de materiales extraños como el suero, la sangre, pus, materia fecal y otras sustancias que pueden inactivar la acción de algunos desinfectantes.

Algunos agentes esterilizantes más usados son: Óxido de etileno (gaseoso): Inactiva enzimas de microorganismos mediante reacciones de alquilación. Tiene alto poder de penetración, por lo que se puede usar en material previamente empaquetado. Glutaraldehido: Efectivo frente a virus, células vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Sirve para esterilizar instrumentos médicos. Se sumerge el material en la solución acuosa al 2% a 25°C durante media hora. Luego, se lava el material con agua hervida. Formaldehído: Se aplica la solución al 18%. CONTROL DE CALIDAD Es importante revisar las cámaras de esterilización y los instrumentos de medición de las variables.

También, se deben revisar los programas de esterilización. Para controlar la esterilización por autoclave, existen cintas de autoclave que pasan de ser verdes a negras si el autoclavado fue realizado de forma correcta. También, existe el control biológico. Se mezclan las esporas de un material con el medio de cultivo, y si hay crecimiento significa que la esterilización fue incorrecta. TÉCNICAS ASÉPTICAS Es un conjunto de procedimientos y actividades que buscan reducir al mínimo las probabilidades de contaminar una muestra, cultivo, herida, etcétera.

Incluyen: Lavado de manos Uso de barreras de alta eficiencia Delimitación de áreas Uso de antisépticos Uso de material esterilizado Manipulación del material en ambientes estériles NIVELES DE BIOSEGURIDAD El riesgo biológico es la amenaza que se genera para la salud humana con la presencia de un organismo o una sustancia derivada del mismo. La bioseguridad es la aplicación de conocimientos, técnicas y equipos para prevenir la exposición a agentes biopeligrosos. Los niveles de bioseguridad se definen según el grupo de riesgo y el equipo de laboratorio. Riesgo 1: Microorganismos con poca posibilidad de causar enfermedades en el ser humano. Ejemplo: E.

coli Riesgo 2: Pueden provocar enfermedades pero tienen pocas posibilidades de ser un riesgo grave. Bajo riesgo de propagación, y hay medidas terapéuticas y preventivas eficaces. Ejemplo: Staphilococus aureus Riesgo 3: Pueden causar enfermedades graves pero tienen bajo riesgo de propagación. Existen medidas preventivas y eficaces. Ejemplo: Mycobacterium tuberculosis Riesgo 4: Agentes patógenos que pueden provocar graves enfermedades en el ser humano y tienen alto riesgo de propagación. Ejemplo: Ébola. CÓMO ESTERILIZAR LOS SIGUIENTES MATERIALES Gasa: Se esteriliza en el autoclave o con radiación ionizante. Se envuelve con papel aluminio para su acondicionamiento.

Solución fisiológica: Puede esterilizarse por filtración (conectada a una bomba de vacío) dependiendo la cantidad de líquido. También se puede esterilizar en el autoclave con una protección de papel aluminio. Botella con agar nutritivo: Se utiliza el autoclave. En condiciones de esterilidad, vierto el contenido en una placa de petri. Vitaminas: Se esteriliza por filtración. No se esteriliza con autoclave porque son termosensibles. Agar con vitaminas: Preparo un medio con agar y lo esterilizo en el autoclave. Espero que baje un poco su temperatura a 40°C y le vierto con técnicas asépticas las vitaminas previamente esterilizadas.

Placa de petri de plástico: Radiación ionizante u óxido de etileno. Placa de Petri de vidrio: Autoclave. Se envuelve en papel. Tips: Autoclave. Se colocan en las cajas, se envuelve con papel la caja y se rotula. También puede esterilizarse por radiación. Tubos de hemólisis: Autoclave. Se acondiciona con un tapón. Pinzas: Autoclave, calor seco o agentes químicos esterilizantes. Matraz: Autoclave, debe realizarse un tapón de aluminio. Polvo de arroz: Calor seco o radiación. Asas de siembra: Calor directo con mechero.