Biotecnologia: Tècniques i Aplicacions

I 36 flashcards i 24 preguntes més al document.

Text del document

Tema 10 BIOTECNOLOGIA 1. LA TECNLOGIA DEL DNA RECOMBINAT La biotecnologia es tracta d'una sèrie de tècniques utilitzades per modificar els éssers vius de cara a obtenir un producte desitjat. Aquesta existeix des de l'antiguitat i s'ha utilitzat per obtenir productes com són el pa, la cervesa, el formatge, el vi, entre molts més (és a dir, aquests no els obtenim de manera natural, passen per uns processos per obtenir els bacteris o altres éssers). L'enginyeria genètica és una branca de la biotecnologia en la que es manipulen directament els gens per tal de controlar la seva expressió genètica 1.

1 APLICACIONS DE L'ENGINYERIA GENÈTICA - Produir noves substàncies beneficioses com en el cas dels fàrmacs (ex. insulina). - L'eliminació de substàncies perilloses de l'ambient. - Curació de malalties 1.2 TÈCNIQUES DE L'ENGINYERIA GENÈTICA ENZIMS DE RESTRICCIÓ I DNA RECOMBINAT Són endonucleases, és a dir, tallen els enllaços fosfodièster del DNA per llocs concrets que són les seqüències curtes de DNA palindròmiques (que vol dir que es llegeixen igual en tant en sentit 5' 3' com en sentit 3' 5').

Aquest tall que produeixen els enzims de restricció, poden ser de dos tipus: - Tall cohesiu: La cèl·lula afegeix nucleòtids en totes dues cadenes fins a formar extrems complementaris / cohesius, d'aquesta manera permetre unir dos DNAs que han estat tallats pel mateix enzim. Després de quedar segellades per la DNA-ligasa, es forma una nova molècula que conté DNA de dos origens diferents a la qual anomenem DNA recombinat. - Tall romb: A diferència del tall cohesiu, en el tall romb els enzims de restricció produeixen talls rectes a través de les dues cadenes de DNA, és a dir, els extrems resultants no són complementaris ni cohesius.

Això fa que no es pugui fer la unió per complementarietat directa de les cadenes. Per unir fragments de DNA amb talls rombs, es necessita generalment un procés addicional per afegir nucleòtids específics o utilitzar l'enzim DNA-ligasa per segellar els enllaços fosfodièster entre les cadenes. 1 · Tipus d'enzims de restricció Quan anomenem un enzim de restricció, les primeres lletres han de ser un indicador de l'abreviatura del bacteri en què es va descobrir, després s'anomena la seva naturalesa (si es de restricció: R) i per últim, se'ls asigna un número en funció de l'ordre en que van ser descoberts.

CLONACIÓ La clonació del DNA és l'obtenció de diverses còpies idèntiques a la molècula original. Els vectors de clonació són agents biològics utilitzats per introduir material genètic dins altres cèl·lules. + L'expressió de gens eucariòtics en cèl·lules procariotes requereix amb freqüència dels vectors d'expressió, vectors de clonació que tenen un promotor procariota molt actiu, situat a prop del lloc de restricció (on està el fen eucariota inserit), d'aquesta manera, la cèl·lula hoste reconeix el promotor i expressa el gen forà. · Tipus de clonació - Plasmidis: Es divideixen de manera coordinada amb la cèl·lula que els conté. Poden transmetre fins a 10 kpb (quilo parells de base) de DNA.

- Virus bacteriòfags: El fag landa té un DNA que pot ser fragmentat amb enzims de restricció i es pot recombinar amb el DNA donant. La infecció fàgica de bacteris és molt ràpida. Poden transportar fins a 15 kpb de DNA. - Cosmidis: Molècules circulars híbrides de fag landa i plasmidis bacterians. S'introdueixen in vitro en fags i penetren en els bacteris per infecció. Poden transmetre fins a 45 kpb de DNA. - Cromosomes bacterians artificials (BAC): Es construeixen a partir de plasmidis F bacterians i poden contenir fins a 500 kpb. - Cromosomes artificials de llevats (YAC): Grossos de mida, s'utilitzen en cèl·lules eucariòtiques i poden transportar fins a 1000 kpb.

2 · Passos de clonació d'ADN · Selecció de gens clonats Mètode directe: Cultivem els bacteris que contenen els gens clonats (plasmidi + gen que ens interessa clonar), ho fem en la placa de petri, conseqüentment creixen en el medi de cultiu, obtenint així moltes còpies del gen. Mètode indirecte: Un fragment de DNA monocatenari, anomenat sonda radioactiva (complementari al DNA) i marcat radioactivament s'hibrida amb aquest (s'uneixen: gen DNA + sonda radioactiva). 3 · Genoteques de DNA complemetari (cDNA) Les genoteques dels gens complets en organismes eucariotes contenen tant introns (no tenen la informació per codificar les proteïnes) com axons (tenen informació per codificar les proteïnes).

Si només volem clonar axons, es creen genoteques a partir de l'RNA cel·lular (ja que mitjançant el seu procés de splicing s'eliminen els introns). Ara bé, hem de passar l'ARNmissatger a ADN i per fer-ho necessitem la transcriptasa inversa (enzim), la retrotranscriptasa. Aquesta sap copiar l'ARN i fer la cadena complementaria (en direcció 5'-3'). Després, un cop s'ha format el nou ARN, s'elimina l'ARNm. Després d'eliminar l'ARNm, l'ADN polimerasa afegeix els nucleòtids necessaris per fer la nova cadena que serà ADN.

A l'ADN complementari se li poden afegir seqüències de restricció en els extrems per permetre que els enzims de restricció els puguin tallar i així poder-les incerir en un vector de clonació. Amb tot això obtenim una genoteca de DNA complementari que conté els gens que s'estaven expressant a l'ARN missatger. PCR La PCR és la reacció en cadena de la polimerasa, una tècnica per amplificar un producte, és a dir, que a partir d'una còpia en fem moltes moltes. Per exemple, si ens interessa amplificar moltes còpies d'un gen que seria una regió del DNA, utilitzem aquesta tècnica. Per fer-ho necessitem els següents elements: - DNA motlle: Genoma sobre el qual volem amplificar una regió concreta.

- Taq polimerasa: Farà les còpies i s'utilitza la polimerasa d'un bacteri que aguanta temperatures elevades, el Thermus aquaticus. 4 - Nucleòtids: A, T, C i G - 2 primers: Els primers s'han d'unir a la seqüència diana, aleshores han de ser complementaris a la regió que volem amplificar, cal que en posem un a cada cantó. · Passos 1. En primer lloc hem de desnaturalitzar l'ADN (separar les dues cadenes) motlle, per fer-ho necessitem aplicar la temperatura de 95ºC. 2. Després hem de baixar la temperatura a 65º, d'aquesta manera permetem que els primers es puguin a unir. 3.

Un cop s'han unit, pujem la temperatura a 72º per fer que la polimerasa del bacteri començi a treballar i fer còpies de la cadena mare. Aquest cicle es va repetint fins a unes 25-30-35 vegades, segons el que s'estigui estudiant. Obtenim així 2² 33 554 432 còpies. · Per què fem una PCR? És la manera que tenim de visualitzar l'ADN, serveix a més a més, per seqüenciar ADNs. Dins la tecnologia de la seqüenciació anem per la tercera generació en la qual podem llegir les molècules sense necessitat d'amplificar-les, sense PCR, tot i així els biotecnòlegs normalment utilitzen la PCR. · Com podem visualitzar aquest ADN amplificat?

S'utilitza un gel d'Agarosa que és una matriu semisòlids (gelatina) en la qual col·loquem l'ADN en un pou i com que té càrrega negativa (per l'àcid fosfòric), apliquem un camp elèctric i l'ADN migrarà cap al pol de càrrega positiva. De manera que els fragments petits aniran més ràpids que els grans. · Aplicacions Una aplicació d'aquesta tècnica és que ens pot servir per detectar mutacions, ho fem mitjançant la separació de fragments d'ADN gràcies a l'electroforesi 5 PCR quantitativa / a temps real: RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) En finalitzar cada cicle, es mesura la quantitat d'ADN present en aquell moment.

Aquesta PCR quantitativa s'utilitza per mesurar la càrrega viral. Per exemple, en el cas de la COVID-19, que és un virus d'ARN, primer s'inactiva el virus i, tot seguit, es realitza una retrotranscripció: a partir de l'ARN viral, s'utilitza la transcriptasa inversa i un primer d'ADN per sintetitzar la segona cadena, formant així ADN complementari (ADNc). Un cop obtingut l'ADN, es poden dur a terme les amplificacions, generant moltes còpies d'ADN de doble cadena. Per quantificar aquest ADN, s'introdueix una molècula fluorescent que s'intercala entre les dues cadenes de l'ADN i emet fluorescència.

Cada nova cadena sintetitzada incorporarà aquesta molècula fluorescent, la qual cosa permetrà mesurar la intensitat de la fluorescència. Així, com més fluorescència es detecti, més ADN de doble cadena hi haurà en la mostra. Com que la mesura es fa en cada cicle, es pot determinar la càrrega viral (quantitat d'ADN) respecte a l'inici. 6 La PCR quantitativa té diversos usos: per una banda, permet quantificar la càrrega vírica; també s'utilitza per determinar el nombre de còpies d'un gen en diferents individus i per analitzar l'expressió gènica. Expressió gènica: Totes les cèl·lules d'un organisme (excepte els gàmetes) tenen la mateixa quantitat d'ADN, és a dir, comparteixen el mateix genoma.

Tot i això, presenten morfologies i funcions diferents perquè no s'expressen els mateixos gens en totes elles. De mitjana, es calcula que hi ha uns 22.000 gens codificants per a proteïnes. Alguns d'aquests gens s'expressen en totes les cèl·lules, mentre que d'altres només s'activen en determinats tipus cel·lulars, fet que dóna lloc a la diferenciació cel·lular. LA SEQÜENCIACIÓ DEL DNA La seqüenciació del DNA pel mètode de terminació de cadena (Sanger) esquema pàg 182 * Seqüenciar és saber la quantitat de bases (nucleòtids) que té, quines són i l'ordre que ocupen en la cadena.

La seqüenciació del genoma * Avui en dia, seqüenciar un genoma és molt fàcil, ja que ho pot fer una sola persona en dos dies i per uns 200 o 300€, però fa més de 15 anys, quan es va fer la primera seqüenciació del genoma humà (2001) costava 1 bilió de dòlars i requeria de moltes persones treballant. 7 Anàlisi de l'expressió gènica * Per analitzar l'expressió gènica aïllem l'ARNm d'un cultiu cel·lular i llavors el tallem en petits fragments per després passar-los a DNAc, per fer-ho necessitem la transcriptasa inversa. Aquests fragments de DNAc se seqüencien, els que són més nombrosos, voldrà dir que són els que es transcriuen més intensament.

Per últim, la seqüència completa dels gens (que s'han expressat en la mostra), permet identificar-los. CLONACIÓ EN ORGANISMES PLURICEL·LULARS: REPROGRAMACIÓ Clonació artificial en plantes Es tracta d'obtenir una planta completa al laboratori a partir d'un fragment d'aquesta. Exemple: Trenquem una pastanaga en petits trossos i cultivem aquests fragments en una placa amb nutrients i hormones que estimulin el creixement. A partir d'aquests trossos, es formen cèl·lules embrionàries que es divideixen per donar lloc a una nova planta, anomenada plàntula, que serà genèticament idèntica a la pastanaga original.

Aquestes cèl·lules embrionàries, capaces de generar tots els teixits adults, reben el nom de cèl·lules totipotents. En els animals, aquest tipus de cèl·lules només es troben en les primeres etapes de l'embrió, com ara el zigot. Clonació artificial en mamífers El primer mamífer que va ser clonat va ser l'ovella Dolly (1997) foto pàg. 184 - S'obté un clon mitjançant aquesta clonació reproductiva. Clonació de cèl·lules mare / troncals Les cèl·lules mare embrionàries són pluripotents i procedeixen d'un embrió, aquests tenen la capacitat de produir cèl·lules especialitzades de totes les línies cel·lulars.

Es poden utilitzar per reparar els teixits malmesos i per això, es coneix com a clonació terapèutica. Els passos de la clonació són: 8 1. Començem fent una transferència nuclear a partir del nucli d'una cèl·lula somàtica aquest és implantat en un òvul en el qual li hem extret el nucli i que es diu enucleat. 2. Aquest òvul enucleat en el que ja hem afegit la informació que ens interesa, es desenvolupa fins la fase blastocist (embrió jove). 3. A partir d'ell, obtenim les cèl·lules embrionàries amb la informació genètica de la cèl·lula somàtica que ens serviran per obtenir les cèl·lules que danyades que necessitàvem.

Gràcies als factors de transcripció, obtindrem les cèl·lules específiques que volem ja que s'expressaran els gens que les caracteritzen. 4. Aquestes cèl·lules tornen a implantar-se a l'organisme danyat. En el cas de les cèl·lules mare adultes, són obtingudes gràcies als teixits desenvolupats, són multipotents. Per exemple, les cèl·lules de la medul·la, podra formar únicament les cèl·lules de la sang. La reprogramació La reprogramació serveix per convertir les cèl·lules adultes especialitzades en cèl·lules mare pluripotents, és a dir, que originaran qualsevol tipus de teixit. Al ser un procés induit, les cèl·lules s'anomenen IPSCs (cèl·lules pluripotents induides).

Aquestes cèl·lules IPS es poden convertir en cèl·lules adultes especialitzades tant in vivo com in vitro un cop transplantades. Un any després es va descobrir la reprogramació in situ, vol dir que dins un animal es poden trasplantar les cèl·les reprogramades sense haver-les d'extreure fora del cos. Actualment, s'està fent la reprogramació in situ però interrompuda, aturant el procés d'especialització, un fet que fa envellir més lentament el cos, més sa, amb menys probabilitat de patir malalties, etc. EDICIÓ GENÈTICA (CRISPR-Cas) Francis J.M. Mojica va descobrir el CRISPR-Cas, un sistema de defensa de bacteris contra bacteriòfags.

Va estudiar el comportament dels bacteris, principalment l'Archaea i el Bacteria en ambients salats. CRISPR: Grup de seqüències palindròmiques curtes que es van repetint al llarg del genoma del bacteri i entre elles hi ha uns espaiadors que provenen del DNA dels fags. Al costat de la regió CRISPR, hi ha uns gens associats que codifiquen les proteïnes CAS (CRISPR ASsociated gens). 9 El sistema de defensa dels fags funciona de la següent manera: 1. Entra l'ADN del fag dins el bacteri 2. Les proteïnes CAS tallen un tros d'aquest ADN i l'integren en el seu genoma. 3.

Tot aquest conjunt CRISPR es transcriu, és a dir, passa d'ADN a ARN i aleshores les regions que eren palindròmiques són complementàries de manera que formen els loops (llaços d'ARN). 4. Cada una d'aquestes seqüències que fa llaços, s'associa a una proteïna CAS-9. 5. Si entra un fag que tingui un fragment de DNA complementari a algun d'aquests ARN madurs, s'hi enganxaran i la CAS-9 tallarà el fragment i impedirà que el bacteri sigui afectat pel virus.

· Aplicacions artificials del CRISPR Hi ha una versió artificial que fem servir per tallar les parts del genoma que volem, per tant, el que fem en biotecnologia és redissenyar les ribonucleoproteïnes CAS-9 amb RNA guia amb unes seqüències determinades així si fem entrar aquella ribonucleoproteïna dins el nostre genoma i existeix aquella posició, la tallarà. Quan tallem el DNA, la cèl·lula ho ha de reparar i hi ha dos sistemes: - HDR: Reparació directa per homologies aquest és l'ideal, perquè quan falta un fragment, la reparació és amb la complementaria, no hi ha errors.

- NHEJ: Unió de seqüències no-homòlogues la cèl·lula normalment tria aquesta, però hi ha errors, afegeix qualsevol base, · Limitacions de la tècnica 1. Off-target effects La sonda que dissenyes per al sistema CRISPR pot unir-se accidentalment a una regió genòmica no desitjada i provocar un tall, ja que hi ha moltes seqüències similars que poden generar confusió. Per evitar aquest risc, s'utilitza una variant anomenada CRISPR-Cas9 morta (dCas9). Aquesta conserva la capacitat de reconèixer la seqüència objectiu gràcies a l'ARN guia, però no talla l'ADN perquè l'enzim ha estat inactivat. 10 1.3.

APLICACIONS DE LA BIOTECNOLOGIA EN LA SALUT / MEDICINA Teràpia gènica: Introducció d'un gen sa en cèl·lules mare adultes, fet que es du a terme gràcies a diferents vectors, com podria ser un virus. Esquema pàg. 188 Per fer la teràpia gènica també podem utilizar el CRISPR-Cas9, però únicament en cèl·lules somàtiques i amb objectius terapèutics (teràpia gènica somàtica), d'aquesta manera no es transmet a la descendència. Per modificar aquelles cèl·lules que ens interessen (de manera que no es transmetin a la descendència), ho podem fer de dos tipus: 1. In vivo: L'objectiu és actuar sobre el teixit d'interès fent arribar el sistema CRISPR a les cèl·lules desitjades.

Per aconseguir-ho, s'utilitzen virus modificats o nanopartícules com a vehicles de transport. Tot i això, aquesta estratègia presenta dos grans reptes; Dirigir-se específicament al teixit desitjat, evitant afectar altres cèl·lules i la durabilitat de l'efecte, és a dir, assegurar que l'edició genètica sigui estable i duradora en el temps. 2. Ex vivo: S'agafen les cèl·lules que ens interessen per aplicar-hi el sistema CRISPR, es fan créixer en una placa i, un cop modificades, es tornen a injectar al pacient. Aquesta tècnica s'ha provat amb èxit en dues malalties: l'anèmia falciforme i la beta-talassèmia.

En el cas de l'anèmia falciforme, la mutació es troba a les cadenes beta de l'hemoglobina, que són les que tenim quan som adults. Quan som nadons, però, utilitzem cadenes gamma, que no presenten la mutació. Per tant, una possible solució és mantenir l'expressió de les cadenes gamma en l'edat adulta. - Amb aquest objectiu, el sistema CRISPR s'utilitza per tallar una regió reguladora del gen que actua com a repressor de les cadenes gamma. D'aquesta manera, s'evita la seva inactivació i es manté la producció de cadenes gamma funcionals, alleujant els símptomes de la malaltia.

Estudi del SNP: Els SNP són polimorfismes d'un sol nucleòtid en diferents persones, tant sols aquesta diferència, pot fer que una persona tingui unes malalties o unes altres (càncer, alzheimer, etc), analitzant-ho, pot prevenir-ho i fer un diagnòstic precoç. 11 PCR: És una amplificació de l'ADN que ens permet obtenir molta més quantitat d'ADN, després fem una seqüenciació de l'ADN, i això ens permetrà fer la diagnosi de diferents malalties genètiques com l'hemofilia, la fibrosi quística, etc. (abans del símptomes). Aquesta s'utilitza a més a més per localitzar agents infecciosos com el COVID o el VIH.

Producció de fàrmacs: S'utilitza per obtenir fàrmacs difícils d'obtenir per altres vies com la insulina, les hormones del creixement, el tractament de l'hemofília, etc. Es fa per clonació de gens humans amb bacteris, però també podem utilitzar animals de granja per clonar i fer que aquest gen produeixi les proteïnes corresponent en la llet (s'expressaran allà). D'altra banda, també és útil en la producció de vacunes, per fer-ho es necessita l'ARN del virus que volem eliminar, en lloc d'utilitzar tot el virus havent-lo matat per calor.

EN ALTRES ÀMBITS Ciència forense: Les persones que han mort per violació o assassinat poden tenir rastres d'ADN (per sang, pell, cabells, etc) de la persona que els ha abusat. A partir d'aquestes mostres podem amplificar el seu DNA i comparar-ho amb les persones sospitoses. En el genoma humà existeixen unes seqüències curtes que es van repetint, els microsatèl·lits, varien d'un individu a un altre (fins i tot dins el mateix individu), això s'utilitza per sabe qui és el culpable d'un delicte. Medi ambient: S'utilitzen microorganismes per descontaminar zones en les quals s'hi ha abocat algun producte contaminant com per exemple el petroli (marees negres) o metalls pesats.

Hi ha microorganismes que absorbeixen aquest contaminant i això rep el nom de bioremediació. Si fem la clonació d'aquests bacteris de creixement ràpid, podem accelerar el procés. 12