Guia d'Estudi de Biotecnologia: Manipulació Genètica i Clonació

I 188 flashcards i 129 preguntes més al document.

Text del document

BIOTECNOLOGIA La Biotecnologia aconsegueix modificar organismes per obtenir productes (fàrmacs, animals, plantes...). Per exemple, s'han pogut obtenir productes com el iogurt, vi, formatge, pa, entrecreuament de varietats animals i vegetals... En l'actualitat l'enginyeria genètica (branca de la biotecnologia), manipula el DNA i crea noves molècules de DNA que no hi ha a la natura. Consisteix en la manipulació del DNA in vitro, difereix de la biotecnologia clàssica, perquè permet modificar gens específics i desplaçar-los entre els diferents organismes. COM S'INTRODUEIX UN GEN D'INTERÈS EN UNA CÈL·LULA PER PODER CLONAR-LO?

Mecanismes biològics (inserint-lo en un vector de clonació) - Plasmidis, virus... Mecanismes no biològics - Electroporació - Microinjecció - Tret de microbales VECTORS DE CLONACIÓ Un vector de clonació és un petit tros d'ADN agafat d'un virus o un plasmidi d'una cèl·lula o d'un organisme superior, que es pot mantenir de manera estable en un organisme, i dins del qual es pot inserir un fragment d'ADN exterior amb intencions d'aconseguir clonació molecular.

MECANISMES BIOLÒGICS PER INTRODUIR UN GÈN D'INTERÈS EN UNA CÈL·LULA PLASMIDIS BACTERIANS Mitjançant el procés de transformació, un bacteri receptor pot adquirir plasmidis (molècules de DNA independents al cromosoma bacterià) que han quedat lliures al medi per la lisi. Alguns plasmidis contenen gens que fan als bacteris tenir resistència als antibiòtics. Així doncs, aquests bacteris receptors poden adquirir les propietats dels gens del plasmidi (vector). Quan això passa, es poden seleccionar aquests bacteris que han estat transformats i són portadors de gens resistents a antibiòtics.

DNA RECOMBINANT I ENZIMS DE RESTRICCIÓ El DNA recombinant és una molècula d'ADN creada artificialment mitjançant la combinació de fragments d'ADN de diferents orígens per tal de modificar genèticament un organisme. Com crear els DNA recombinant? una de les maneres és emprant els enzims de restricció, que són enzims que tallen el DNA per dianes de restriccions, que són unes seqüències específiques palindròmiques (es llegeixen igual en una cadena i en el sentit invers) de dos nucleòtids. Per inserir un gen en un vector cal tallar el DNA del vector i el DNA passatger amb el mateix enzim de restricció perquè després l'enzim DNA-ligasa els uneix-hi.

TIPUS DE DIANES: 1) Dianes que originen un tall situat en una posició diferent de cada cadena (extrems cohesius) 2) Dianes que originen un tall situat en el mateix punt de les dues cadenes (extrems roms) SELECCIÓ DE CLONS El creixement de les cèl·lules que han sigut transformades i han rebut plasmidis amb gens de resistència es pot identificar sobre un mitjà d'agar que contingui l'antibiòtic. Els bacteris que contenen plasmidis recombinats creixen formant clons. Aquests es transfereixen a una membrana, el DNA que contenen es desnaturalitza i es fixa sobre la superfície.

S'hi afegeix una sonda radioactiva (un fragment de DNA complementari) i es permet que tingui lloc la seva hibridació amb el DNA; s'exposa a una pel·lícula sensible a raigs X i així s'identifiquen els clons que continguin DNA recombinat amb l'inserit correcte. ALTRES MECANISMES D'INTRODUCCIÓ DE GENS EXÒGENS Bacteri agrobacterium: La transformació en principi només es dona entre bacteris. Però com a excepció trobem el plasmidi del bacteri Ti d'Agrobacterium tumefaciens, que pot infectar a altres plantes, integrant el plasmidi en els cromosomes de les cèl·lules vegetals, provocant tumors.

Aquest plasmidi Ti és utilitzat pels investigadors com a vector de clonació en plantes (tot i que prèviament cal eliminar els gens que causen el tumor) Virus com a vectors de clonació: Es pot inserir un gen d'interès en el DNA del virus i es deixa que aquest infecti una cèl·lula hoste, de manera que el virus replica material genètic, obtenint així múltiples còpies del gen. MECANISMES NO BIOLÒGICS PER INTRODUIRS UN GÈN D'INTERÈS EN UNA CÈL·LULA ELECTROPORACIÓ Es col·loca la cèl·lula dins d'una solució amb el DNA d'interès i s'hi aplica un impuls elèctric curt i intens. El camp elèctric crea porus temporals a la membrana cel·lular, permetent l'entrada del DNA passatger.

És bastant utilitzat en bacteris, llevats i cèl·lules eucariotes. MICROINJECCIÓ Amb una agulla molt fina (micropipeta), s'injecta directament el DNA dins del nucli de la cèl·lula. Així s'introdueix el material genètic de manera molt precisa. És bastant comú en òvuls o embrions d'animals per generar organismes transgènics. TRET DE MICROBALES Es recobreixen petites partícules d'or o tungstè amb el DNA d'interès i "s'apunten" cap a les cèl·lules. Així les partícules penetren i poden portar el DNA fins al nucli.

PCR - CLONACIÓ DUN GEN SENSE CÈL·LULES La PCR, o "polymerase chain reaction" permet obtenir moltes còpies de DNA a partir d'una mostra petita gràcies a la reacció en cadena de la polimerasa. És una forma de clonació purament enzimàtica sense necessitat de cèl·lules. Mitjançant una molt petita quantitat de molècules d'ADN (mostra) es pot aconseguir milions de còpies Es necessita: - El DNA que es vol clonar - DNA polimerasa resistent al calor (es sol fer servir Taq) - Desoxiribonucleòtids trifosfats (que formen les molècules de ADN) - 2 "primers" o encebadors. Procés: 1. Temp. 95º C: Desnaturalització d'ADN per separar les dues cadenes de DNA a clonar. 2.

Disminució Temp.50º C: Hibridació, on els "primers" s'uneixen al DNA. 3. Augment Temp.80º C: Elongació, on a partir dels "primers" la DNA polimerasa sintetitza les cadenes complementàries del DNA. 4. Repetició de tot procés amb tot el DNA i obtenció de 1 milió de còpies després de 20 cicles. APLICACIONS DE LA PCR - Obtenir moltes còpies DNA per introduir en cèl·lules hostes (teràpia gènica). - En medicina forense per identificar persones a partir de petites mostres de sang, cabell, saliva, semen, pell... - En proves de paternitat - En estudis evolutius i taxonòmics per deduir el grau de parentiu entre espècies.

- En estudis d'història per deduir la proximitat entre poblacions humanes, malalties genètiques, etc. a partir de restes en fòssils, mòmies, roques.. - Detectar material genètic d'un bacteri o virus present en el cos d'un pacient. Ex: COVID STR (SHORT TANDEM REPEAT) = MICROSATÈLITS Hi ha unes zones del DNA que es repeteixen vàries vegades en els cromosomes pròpies de cada individu, i això es coneix com la seva empremta dactilar o el seu DNI. Així doncs, si s'amplifica el DNA amb la PCR, i després es fa una electroforesi es podrà analitzar el DNA (bandes) segons si van més lluny (més DNA) o no (menys DNA). PCR COVID 1. S'extreu una mostra de la mucosa nasal 2. S'extreu el RNA de la mostra 3.

Els RNAs del a mostra s'usen com a motlle per sintetitza DNAs 4. S'amplifiquen determinades seqüències del DNA per qpCR 5. A partir dels 40 cicles s'observen els resultats CRISPR-CAS9 El CRISPR-CAS9 ("Repeticions Palindròmiques Curtes Agrupades i Regularment Interspeials"), és una eina molecular que es fa servir per "editar" o "corregir" el genoma de qualsevol cèl·lula un vitro. Origen: Es van trobar alguns bacteris es defensaven de les infeccions víriques perquè tenen uns enzims capaços de distingir el material genètic del bacteri i del virus i poden destruir el del virus.

En què consisteix: Primer es construeix un ARN guia que pugui reconèixer la part d'ADN que es vol editar, llavors s'introdueix l'ARN guia dins de la cèl·lula mitjançant un virus i s'uneix a les proteïnes Cas. L'ARN guia, dirigeix les proteïnes Cas, que busquen una seqüència específica i la tallen. A continuació es pot silenciar el gen que ens interessa o bé reparar-ho amb un fragment modificar d'ADN.

ORGANISMES MODIFICATS GENÈTICAMENT (OMG) VS ORGANISMES TRANSGÈNICS Un OMG (organisme modificat genèticament) té l'ADN alterat artificialment mitjançant tècniques de biotecnologia, ja sigui per haver introduït el material d'un altre espècie, activat un dels seus gens perquè no es manifesti, potenciat un dels seus gens perquè estigui sempre actiu (epigenètica)... A un organisme transgènic és un tipus d'OMG al qual se li ha introduït ADN d'una altra espècie (no pertany al seu genoma) per donar-li una característica nova. Ex: cultiu del gen Bt per a plantes, que li donen resistència a insectes. - Per tant: Tot organisme transgènic és un OMG (perquè s'ha modificat genèticament).

Però no tots els OMG són transgènics, ja que es poden modificar sense afegir gens externs. FASES PER OBTENIR UN ORGANISME TRANSGÈNIC - CAS DE LES PLANTES 1. Identificació i aïllament: en aquesta etapa s'identifica el problema que es vol solucionar i es determina la característica que solucionaria el problema, així s'ubica el gen d'interès i s'aïlla l'organisme per multiplicar-lo. 2. Transformació: en aquest procés s'insereix el gen d'interès en el genoma de la planta que s'ha de transformar.

En aquest sentit es poden utilitzar dos mètodes: - Opció 1, biolística: petits balis disparats a gran velocitat que penetren al nucli cel·lular i que porten adherits a la seva superfície el material genètic d'interès. - Opció 2, per mitjà de l'Agrobacterium tumefaciens, aquest bacteri té la capacitat de transferir gens a les plantes, funcionant com un vector. Així doncs, se li inserta un plasmidi que conté el gen d'interès i el bacteri la inserta al genoma. 3. Selecció: es detecten les cèl·lules que han sigut transformades amb èxit avaluant el seu creixement mitjançant el seu cultiu en medis que afavoreixin el seu desenvolupament. 4.

Regeneració: s'obté una planta completa a partir d'aquella cèl·lula vegetal transformada 5. Assajos de bioseguretat: després d'obtenir els resultats, es fan assajos per comprovar com es comporta el gen inserit i la planta en diferents condicions. EXEMPLES D'ORGANISMES TRANSGÈNICS A L'AGRICULTURA - Blat de moro: resisteix a les gelades i herbicides, resulta verinós per insectes. - Tomàquet: maduren més lentament perquè el gen que regula la maduració s'ha inserit de forma inversa. Així es disposen de més dies per transportar-lo. - Arròs daurat: està enriquit amb vitamines A - Plantes que poden créixer sense nitrats al sòl: els hi han introduït un gen que assimila el nitrogen als bacteris.

- Plantes resistents a herbicides (ex: soja): així les plantes no moren EXEMPLES D'ORGANISMES TRANSGÈNICS EN LA PRODUCCIÓ ANIMAL Les aplicacions més importants han sigut a peixos, ja que la majoria té fecundació externa, pel que és possible introduir gens en el zigot abans que s'uneixin al l'espermatozoide i l'òvul amb microinjecció o camp elèctric. - Salmons: són modificats amb gens que regulen el creixement, i així creien més de pressa.

EXEMPLES D'ORGANISMES TRANSGÈNICS EN LA MILLORA DEL MEDI AMBIENT O CREACIÓ DE NOUS MATERIALS - Bacteris productors de plàstics biodegradables - Bacteris superdegradadors de taques de petroli - Bacteris productors de biogàs a partir de rebuig orgànic EXEMPLES D'ORGANISMES TRANSGÈNICS EN LA PRODUCCIÓ D'ANIMALS PER A LA INVESTIGACIÓ - Ratolins knockout: serveixen com a model per estudiar malalties genètiques. En els òvuls fecundats d'aquests ratolins s'introdueix una seqüència d'ADN que provoca l'anul·lació d'un gen concret que provoca l'aparició d'una malaltia i així nosaltres la podem estudiar i assajar nous fàrmacs.

- Granotes: Creuant gens de dues espècies, es van crear granotes translúcides, que permeten estudiar l'efecte de químics als seus òrgans. EXEMPLES D'ORGANISMES TRANSGÈNICS EN LA PRODUCCIÓ DE FÀRMACS - PRODUCCIÓ D'INSULINA - Interferó humà: tractament esclerosi múltiple. Certes leucèmies. - Factor VII de coagulació: es produeix a cèl·lules de mamífer i combat l'hemofília. - Hormona del creixement: Abans s'extreia de cadàvers. Ara la produeixen bacteris. - ADN-polimerasa I: tractament fibrosi quística. - Vacuna de l'hepatitis A i B: Es produeix amb llevats. TERÀPIA GÈNICA Consisteix a introduir dins el pacient que té un genoma defectuós, un gen normal.

Aquest gen únicament s'introdueix dins de l'òrgan que no funciona correctament. FORMES DE FER-SE - In vivo: s'introdueix el DNA recombinat dins del pacient a través d'un virus o un liposoma. - Ex vivo: s'extreuen del pacient cèl·lules del òrgan defectuós (mitjançant una biòpsia), aquestes es cultiven in vitro, i s'introdueix el DNA correcte mitjançant un virus. Un cop s'han cultivat suficients cèl·lules correctes es re injecten al pacient. Així doncs, la teràpia gènica pot suposar una solució per corregir malalties genètiques. Però encara hi ha moltes dificultats tècniques en la seva aplicació: els virus que s'introdueixen poden donar lloc a respostes immunològiques mortals o càncer.

CAS DE LA IMMUNODEFICIÈNCIA GREU COMBINADA Aquesta, és una malaltia molt poc freqüent causada per una mutació en un gen del cromosoma X que impedeix la producció de limfòcits. Així doncs, és mortal si no s'aïlla la criatura afectada en "bombolles" estèrils de plàstic des dels primers dies de vida. Tractant en els nens bombolles amb teràpia gènica s'ha aconseguit solució la immunodeficiència, però de cada 10, 2 desenvolupen leucèmia. CLONACIÓ La clonació és el procés mitjançant el qual s'obtenen còpies idèntiques de l'organisme seleccionat. CLONACIÓ ARTIFICIAL EN PLANTES En el laboratori és possible obtenir una planta completa a partir d'un petit fragment d'una altra planta.

Per exemple, a partir d'una arrel de pastanaga. Les cèl·lules d'aquest fragment poden des diferenciar-se, és a dir, tornar a un estat semblant al de les cèl·lules embrionàries. A partir d'aquí: - es divideixen moltes vegades, - formen una massa de cèl·lules anomenada call, - i finalment es diferencien de nou fins a donar lloc a una plàntula i, més endavant, a una planta adulta. Aquest procés és possible perquè aquestes cèl·lules són totipotents, és a dir, tenen la capacitat de generar tots els teixits d'un organisme. En els animals, en canvi, només el zigot i les primeres cèl·lules embrionàries tenen aquesta capacitat.

CLONACIÓ ARTIFICIAL EN MAMÍFERS Clonació de l'ovella Dolly El procediment va ser el següent: 1. Es va extreure el nucli d'una cèl·lula adulta de la mamella d'una ovella, 2. Aquest nucli es va introduir en un òvul al qual prèviament se li havia tret el nucli, 3. Les dues cèl·lules es van fusionar mitjançant una descàrrega elèctrica, 4. L'embrió obtingut es va implantar a l'úter d'una altra ovella. Tot i que es van formar diversos embrions, només un va arribar a desenvolupar-se completament: l'ovella Dolly, que era genèticament idèntica a l'ovella donadora del nucli. Aquest tipus de clonació s'anomena clonació reproductiva.

Actualment s'ha aplicat a diversos animals, però la gran majoria de la comunitat científica rebutja la clonació reproductiva en humans per motius ètics i científics. TIPUS DE CLONACIÓ Clonació de divisió de l'embrió: es dissocien les cèl·lules que formen un embrió i s'obtenen nous embrions idèntics o clònics. EX: Bessons idèntics Clonació per transferència nuclear: EX: Ovella Dolly CÈL·LULES MARE Les cèl·lules mare són cèl·lules no diferenciades (especialitzades), que es poden convertir en altres tipus de teixit: cardíac, pancreàtic, pell... TIPUS Pluripotencials - Embrionàries: procedeixen dels excedents de la fertilització in vitro.

(Comporta un problema ètic.) - Procedents: del cordó umbilical o de la medul·la òssia dels adults. Intuïdes: s'obtenen de cèl·lules de la pell o la sang APLICACIONS DE LES CÈ·LULES MARE - Regeneració d'òrgans i teixits. S'evita el possible rebuig del receptor. Es redueixen els problemes de manca d'òrgans... - Teràpia gènica: afegir gens funcionals a les cèl·lules mares del pacient amb defecte genètic. - Experimentació amb nous medicaments, no calen humans o animals. - Coneixement dels mecanismes d'especialització de les cèl·lules i les seves alteracions com el càncer.