Pràctica 1. Determinació de la Vmàx i Km de la lactat deshidrogenasa (LDH)

Context

La lactat deshidrogenasa (LDH) és una oxidoreductasa que catalitza la reducció reversible del piruvat a lactat amb l'oxidació concomitant de NADH a NAD⁺:

$$\text{Piruvat} + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{LDH}} \text{Lactat} + \text{NAD}^+$$

Aquesta reacció és clau per a la regeneració anaeròbica del NAD⁺ necessari per a mantenir la via glucolítica. A nivell clínic, els nivells sèrics habituals d'aquesta transaminasa oscil·len entre 110 i 220 U/L; danys cel·lulars en el miocardi, fetge, ronyons o processos mieloproliferatius provoquen la seva elevació plasmàtica.

En aquesta pràctica es mesura l'activitat de l'enzim monitorant a 340 nm la disminució d'absorbància deguda al consum de NADH.

1 Apartat 4.A. Preparació dels reactius

A partir dels materials del laboratori, cal preparar les tres dissolucions de treball necessàries per dur a terme l'assaig cinètic. Es disposa de les dades de massa molar següents:

TRIS: $121{,}14\text{ g/mol}$

Piruvat: $88{,}06\text{ g/mol}$

NADH: $663{,}43\text{ g/mol}$

Solució valorant d'àcid clorhídric (HCl): $0{,}5\text{ mol/L}$

a)

Calculeu la massa necessària de TRIS per preparar $250\text{ mL}$ d'una dissolució tampó $100\text{ mmol/L}$ i descriviu el procediment complet d'ajust del pH a $7{,}5$ i enrasat.

b)

Determineu la massa de piruvat sòlid necessària per preparar $100\text{ mL}$ d'una dissolució $2{,}75\text{ mmol/L}$ emprant com a dissolvent el tampó TRIS prèviament preparat.

c)

Calculeu la quantitat de NADH requerida per preparar $100\text{ mL}$ de dissolució a una concentració d'$1{,}55\text{ mmol/L}$ en tampó TRIS i justifiqueu per què aquesta solució s'ha de formular el mateix dia de l'assaig.

Context

La lactat deshidrogenasa (LDH) és una oxidoreductasa que catalitza la reducció reversible del piruvat a lactat amb l'oxidació concomitant de NADH a NAD⁺:

$$\text{Piruvat} + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{LDH}} \text{Lactat} + \text{NAD}^+$$

Aquesta reacció és clau per a la regeneració anaeròbica del NAD⁺ necessari per a mantenir la via glucolítica. A nivell clínic, els nivells sèrics habituals d'aquesta transaminasa oscil·len entre 110 i 220 U/L; danys cel·lulars en el miocardi, fetge, ronyons o processos mieloproliferatius provoquen la seva elevació plasmàtica.

En aquesta pràctica es mesura l'activitat de l'enzim monitorant a 340 nm la disminució d'absorbància deguda al consum de NADH.

2. Apartat 4.B. Protocol experimental i condicions d'assaig de la LDH

Per tal de monitorar l'activitat catalítica de la LDH mitjançant espectrofotometria, es fixen les condicions de treball a una longitud d'ona ($\lambda$) de 340 nm emprant cubetes d'1 cm de pas de llum.

1

2

3

4

PIRUVAT

NADH

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

LDH

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

TRIS

a)

Justifiqueu l'elecció de la longitud d'ona de 340 nm per seguir aquesta reacció enzimàtica i indiqueu com es calibra l'equip abans de començar les mesures.

b)

Expliqueu el procediment de preparació i lectura de les cubetes de reacció (volum final de 2,0 mL) d'acord amb la taula d'addicions, especificant la funció de cadascun dels components i com es distribueixen els volums de piruvat i TRIS entre les diferents cubetes.

c)

Descriviu el procediment temporal d'incubació i registre de lectures d'absorbància un cop s'inicia la reacció.

Context

La lactat deshidrogenasa (LDH) és una oxidoreductasa que catalitza la reducció reversible del piruvat a lactat amb l'oxidació concomitant de NADH a NAD⁺:

$$\text{Piruvat} + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{LDH}} \text{Lactat} + \text{NAD}^+$$

Aquesta reacció és clau per a la regeneració anaeròbica del NAD⁺ necessari per a mantenir la via glucolítica. A nivell clínic, els nivells sèrics habituals d'aquesta transaminasa oscil·len entre 110 i 220 U/L; danys cel·lulars en el miocardi, fetge, ronyons o processos mieloproliferatius provoquen la seva elevació plasmàtica.

En aquesta pràctica es mesura l'activitat de l'enzim monitorant a 340 nm la disminució d'absorbància deguda al consum de NADH.

3. Apartats 5 i 6. Resultats, càlculs i conclusions cinètiques

A partir de les dades d'absorbància obtingudes en les quatre condicions de concentració de substrat, cal organitzar la informació cinètica mitjançant les taules de registre següents:

Taula 1. Gràfica de les velocitats de reacció per diferents concentracions de substrat

TEMPS

(min)

Absorbància a 340 nm

[piruvat] =

[piruvat] =

[piruvat] =

[piruvat] =

Taula 2. Valors per la gràfica Michaelis - Menten

[substrat]

(mmol/L)

Durada resposta

lineal (min)

Abs (final)

Abs (inicial)

Δ Abs

Velocitat (v)

Δ Abs/min

Taula 3. Valors per la gràfica Lineweaver-Burk

[substrat]

(mmol/L)

Velocitat (v)

Δ Abs/min

1/(mmol/L)

1 / [S]

1 / v

a)

Indiqueu com s'ha de calcular la concentració real inicial de piruvat a la cubeta de reacció ($[S]$ en mmol/L) per a cadascun dels 4 assajos.

b)

A partir de les dades de la Taula 1, expliqueu el procediment per omplir la Taula 2: com es determina el rang lineal de la reacció i com es calcula la velocitat inicial ($v = \Delta\text{Abs}/\text{min}$).

c)

Expliqueu com es transformen les dades a la Taula 3 i detalleu com s'obtenen els paràmetres cinètics de la LDH ($V_{\max}$ i $K_m$) a través de la representació directa de Michaelis-Menten i mitjançant la linealització de doble recíproc de Lineweaver-Burk.