Aufgabe Vorschlag C - Aufgabe 8 · Abitur Hessen Biologie LK 2021

Material 7

Adeno-assoziierte Viren (AAV) und Helferviren zur gentherapeutischen Behandlung der Achromatopsie

Adeno-assoziierte Viren (AAV) werden in der Gentherapie als Vektoren genutzt, um therapeutische Gene in menschliche Zellen zu schleusen. Diese sind so gut geeignet, weil durch dieses Vektorsystem keine Krankheiten ausgelöst werden können. Sie gehören zu den kleinsten bisher bekannten Viren und sind von einem Helfervirus, das dieselbe Zelle befällt, abhängig. Das Helfervirus liefert Proteine, die vom AAV für die Replikation in der Zelle benötigt werden. Bei einer Infektion gelangt in der Regel nur die DNA der AAV in den Zellkern der befallenen Zelle, kann sich dort aber nur mit Hilfe dieses Helfervirus (wie z.B. Adenoviren) sowie Polymerasen dieser befallenen Zellen replizieren. Andernfalls ruht das übertragene AAV-Genom im Zellkern der Wirtszelle, wird jedoch nicht ins Genom der Wirtszelle integriert.

Helferviren gehören zu den DNA-Viren. Die meisten Infektionen verlaufen mild und erfordern keine Therapie oder eine symptomatische Behandlung. Die für die AAV-Replikation erforderlichen Gene dieser Helferviren sind E1A, E1B, E2A, E4 und VA. Die von diesen Viren codierten Proteine entfalten ihre Wirkung auf die AAV-Replikation, indem sie die virale Genexpression regulieren und indem sie die Wirtszelle dazu bringen, in die S-Phase überzugehen.

Material 8

AAV–Genomaufbau

Das AAV-Genom enthält zwei Gene, das Replikations (Rep)-Gen und das Capsid (Cap)-Gen. Das Rep-Gen codiert (u.a. durch alternatives Spleißen) mehrere Proteine, die die Replikation regulieren. Das Cap-Gen codiert Strukturproteine, welche die Hülle des Virus bilden. Diese Hülle ist für die spezifische Bindung an die Oberfläche der Zapfen von zentraler Bedeutung. Es gibt verschiedene Typen von AAV-Viren, die sich u.a. im molekularen Bau der Hülle unterscheiden und entsprechend auf verschiedene Zielzellen spezialisiert sind. Der codierende Bereich wird von zwei nicht-codierenden Sequenzen begrenzt, sogenannten inverted terminal repeats (ITRs). Die ITRs spielen eine entscheidende Rolle bei der Verpackung der AAV-Genome sowie der Replikation.

Material 9

Produktion des viralen Vektors rAAV für eine Genersatztherapie

Bei einer Genersatztherapie wird ein Krankheitszustand dadurch behandelt, dass man einen durch defekte Gene hervorgerufenen Mangel durch das Hinzufügen funktionsfähiger Gene beseitigt. Für die Gentherapie werden rekombinante AAV (rAAV-Vektoren) verwendet, die nicht ins Genom integrieren. Ein anschauliches Beispiel für den Aufbau eines rAAV-Vektorenkonstrukts, welches in der CNGA3-Gentherapie bereits klinisch erfolgreich erprobt worden ist, ist in der Abbildung dargestellt. Dazu werden neukombinierte Vektorsequenzen, sogenannte Expressionskassetten, verwendet, die eine Expression des CNGA3-Gens unter Kontrolle eines Opsin-Promotors (O.p.) ermöglichen. Diese Expressionskassette kann ausschließlich in Zapfen exprimiert werden.

Um AAV gentherapeutisch nutzbar zu machen, müssen große Mengen an rekombinanten Vektoren produziert werden. Für die Produktion von rAAV-Vektoren werden HEK-Zellen verwendet. HEK-Zellen sind embryonale Nierenzellen, die DNA-Teile des menschlichen Adenovirus enthalten. In das Chromosom 19 dieser Zellen werden Gene der Helferviren E1A und E1B gentechnisch eingefügt und diese exprimieren kontinuierlich die entsprechenden Proteine.

Bei der Optimierung der Expressionsstärke von Kanalproteinen ist zu beachten, dass prinzipiell zwei Faktoren miteinander konkurrieren: Eine stabile und effiziente Expression des hinzugefügten Gens ist einerseits eine notwendige Voraussetzung für eine erfolgreiche Therapie, andererseits führt eine zu hohe Anzahl von Kationenkanälen auch zum Zelltod. Nur bei einer bestimmten Menge an CNG-Kanälen ist die Fotorezeptorzelle funktionsfähig. Daher ist bei gentherapeutischen Ansätzen die Menge an Plasmiden entscheidend.

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Beschreiben und erläutern Sie das Verfahren einer Genersatztherapie von der Herstellung des viralen Vektors bis zur Anwendung am Patienten mit Achromatopsie vom CNGA3-Typ. (Material 7, 8 und 9) [25 BE]