Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics

I 0 flashcards i 4 preguntes més al document.

Text del document

APUNTS MACROMOLÈCULES BIOLÒGIQUES Grau en Biotecnologia Universitat de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apunts complets sobre el plegament de proteïnes: paradoxa de Levinthal, experiment d'Anfinsen, forces no covalents, efecte hidrofòbic i l'embut entròpic.

APREN.AI Índex 1 Dogma del plegament, conformacions i paradoxa de Levinthal Principis fonamentals i autonomia del plegament Tipus de proteïnes segons el seu comportament conformacional La paradoxa de Levinthal 2 Forces moleculars i l'experiment clau d'Anfinsen Equilibri termodinàmic i interaccions d'enllaç Ponts disulfur i el paper de la PDI L'experiment de Christian Anfinsen Avaluació de les forces no covalents en el plegament 3 Termodinàmica del plegament: entalpia, entropia i efecte hidrofòbic Balanç termodinàmic i la contribució conformacional L'efecte hidrofòbic com a motor del procés 4 Cinètica i models de plegament: de les fases al funil entròpic Cinètica i models experimentals del plegament Mecanismes teòrics de plegament Model integrador: l'embut entròpic (entropy funnel) 5 Resum per repassar Principis i conformacions proteiques Forces motrius i experiment d'Anfinsen Termodinàmica i efecte hidrofòbic Cinètica i models de plegament Solucions de les preguntes de repàs Aquests apunts poden contenir errors o omissions.

Són un material de suport i no substitueixen el temari oficial ni el professorat: contrasta la informació important. Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 1 1 Dogma del plegament, conformacions i paradoxa de Levinthal EN ACABAR SABRÀS Definir el dogma del plegament espontani i el rol catalitzador de les xaperones. Distingir els diversos tipus de conformacions proteiques incloent les IDP i el glòbul fos. Formular i interpretar la paradoxa de Levinthal mitjançant el càlcul combinatori d'angles de gir.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 1 Com pot una proteïna trobar la seva forma correcta en menys d'un segon si les combinacions matemàtiques teòriques requeririen milers de milions d'anys de cerca? Principis fonamentals i autonomia del plegament El pas d'una cadena polipeptídica desordenada cap a una conformació tridimensional ordenada és un fenomen guiat per la seva pròpia composició química. La seqüència d'aminoàcids conté de manera intrínseca tota la informació requerida per assolir l'estructura nativa. La maquinària cel·lular no imposa l'estructura final ni modifica el dogma fonamental del plegament.

Determinats components com les xaperones actuen com a proteïnes facilitadores: optimitzen la cinètica cel·lular, acceleren el procés en condicions lentes i eviten associacions incorrectes, especialment en proteïnes amb múltiples conformacions o desestructurades. Tipus de proteïnes segons el seu comportament conformacional Les proteïnes presenten patrons de plegament diversos segons la rigidesa i flexibilitat de la seva estructura: Grup de proteïnes Característiques estructurals Exemples i peculiaritats Estructura tridimensional definida Adopten un estat natiu únic i rígid clarament establert. Representen la immensa majoria de les proteïnes globulars conegudes.

Amb conformacions alternatives Oscil·len entre un nombre finit d'estats (2 o 3 formes accessibles). Regulades per la unió de lligands o modificacions químiques posteriors. Intrínsecament desestructurades (IDP) No presenten una estructura global fixa; canvien ràpidament entre múltiples estats. Es pleguen sovint en reconèixer el seu lligand corresponent. Glòbul fos (Molten globule) Estructura secundària ben formada i definida, però amb una topologia terciària no compactada. Disposen els mateixos elements secundaris en orientacions espacials variables. Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 2 Esquema de diferents topologies en proteïnes de tipus glòbul fos.

Les proteïnes amb conformacions alternatives trenquen la idea clàssica d'una única estructura estàtica per a cada seqüència primària. Un exemple clar són les quinases: el seu centre actiu adopta una disposició inactiva en absència de molècula reguladora i passa a la conformació activa quan s'hi uneix el lligand. Diagrama de canvis conformacionals entre la forma inactiva i activa d'una quinasa. Un cas d'especial transcendència biomèdica és el receptor Egfr, situat a la membrana cel·lular epitelial. La unió del senyal extracel·lular promou un canvi conformacional que activa la replicació cel·lular.

En certs càncers, mutacions gèniques forcen el receptor a romandre permanentment en la forma activa, desencadenant la proliferació continuada de la cèl·lula sense control extern. Model estructural del receptor Egfr en diferents conformacions funcionals. Aquest repertori multifuncional a partir d'una sola seqüència s'anomena pluriempleo o moonlighting proteins, estratègia molt estesa en organismes complexos on les proteïnes desestructurades (IDP) tenen un paper clau. COMPROVA-HO 2 Quina funció realitzen les xaperones durant el plegament si no determinen l'estructura final?

Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 3 La paradoxa de Levinthal Per entendre la dinàmica del plegament cal analitzar la flexibilitat de l'esquelet proteic. Els enllaços peptídics formen plans rígids, de manera que la mobilitat d'una cadena depèn principalment de les rotacions al voltant dels angles (phi) i (psi). Esquema del pla de l'enllaç peptídic i els seus angles de torsió. Si considerem que cada enllaç pot adoptar un mínim de 12 rotacions discretes (un estat cada 30 graus), cada residu disposa de: En un polipèptid petit d'únicament 100 residus, el ventall total de combinacions conformacionals és de formes possibles.

Si el polipèptid explorés a l'atzar aquests confòrmers a la velocitat màxima d'una transició per cada 10 fs ( ), el temps necessari per topar per atzar amb l'estat natiu assoliria aproximadament 10.173 milions d'anys, una xifra astronòmica que supera amb escreix l'edat de l'univers. DEFINICIÓ Paradoxa de Levinthal: contradicció teòrica entre el temps gairebé infinit que requeriria un mostreig conformacional a l'atzar i la rapidesa real del plegament biològic experimental, el qual té lloc entre l'escala dels microsegons i el minut. Aquesta paradoxa no s'anul·la amb l'existència de proteïnes desestructurades ni amb la presència de maquinària enzimàtica acceleradora.

Demostra sense dubte que el plegament no pot transcórrer mitjançant un tempteig aleatori de totes les geometries possibles, sinó que respon a un procés altament canalitzat i coordinat per lleis físiques i químiques precises. ERROR FREQÜENT Creure que la paradoxa de Levinthal queda resolta pel fet que les xaperones consumeixin ATP per doblegar la cadena. Les xaperones només proporcionen un microentorn aïllat o acceleren etapes lentes; no exploren confòrmers per força bruta ni alteren el destí conformacional definit per la seqüència.

ϕ ψ 12 × 12 = 144 conformacions per residu 12200 10 s 14 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 4 COMPROVA-HO 3 Quina conclusió immediata es desprèn del càlcul matemàtic de Levinthal? ESQUEMA Classificació funcional de proteïnes segons la seva conformació IDEES CLAU La informació conformacional d'una proteïna resideix de forma inherent en la seva pròpia seqüència d'aminoàcids. Existeixen proteïnes amb conformacions alternatives regulables per lligands, proteïnes intrínsecament desestructurades (IDP) i formes de tipus glòbul fos.

La paradoxa de Levinthal posa en evidència que la recerca aleatòria de confòrmers requeriria milers de milions d'anys, mentre que a nivell biològic es completa en microsegons o minuts. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 4. Quina diferència estructural bàsica separa un estat natiu d'una proteïna d'un estat de tipus glòbul fos? 5. Per quina raó una proteïna de 100 residus genera de l'ordre de combinacions teòriques si considerem 12 conformacions per angle de torsió?

Estructura definida Estat tridimensional únic i rígid Conformacions alternatives Oscil·len entre 2 o 3 estats Kinases i Egfr Regulades per lligands Moonlighting proteins Pluriempleades amb diverses funcions 〰 Proteïnes IDP Sense estructura global fixa Glòbul fos (MGP) Secundària definida i topologia variable 12200 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 5 Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 6. Quin paper tenen les xaperones en el plegament proteic cel·lular? 7. Què caracteritza principalment les anomenades proteïnes intrínsecament desestructurades (IDP)? 8.

Quant de temps necessitaria una proteïna de 100 residus per plegar-se per cerca a l'atzar segons Levinthal? 9. Quina mutació en el receptor Egfr afavoreix el desenvolupament tumoral? 2 Forces moleculars i l'experiment clau d'Anfinsen EN ACABAR SABRÀS Descriure el balanç energètic bàsic associat a les interaccions covalents i no covalents. Analitzar pas a pas les etapes i conseqüències de l'experiment d'Anfinsen. Explicar per què els ponts d'hidrogen i els ponts salins no constitueixen la força motriu exclusiva del plegament.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 10 Per què una ribonucleasa desnaturalitzada pot recuperar la seva activitat per si sola si eliminem la urea abans que el reductor, però queda inactivada si ho fem a l'inrevés?

Canvien la seqüència d'aminoàcids diana a) Acceleren el procés evitant plegaments erronis b) Modifiquen el dogma imposant noves estructures c) Aporten la informació seqüencial necessària d) Manca d'una estructura global fixa aïllades a) Presència permanent de ponts disulfur rígids b) Incapacitat absoluta per interaccionar amb lligands c) Estructura terciària completament immutable d) Aproximadament un minut experimental a) El mateix temps que triga in vivo b) Més de 10.000 milions d'anys c) Pocs microsegons en solució aquosa d) La que bloqueja la transició conformacional activa a) La que impedeix la formació d'enllaços peptídics b) La que degrada immediatament el receptor membranós c) La que manté l'estat actiu sense senyal d) Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 6 Equilibri termodinàmic i interaccions d'enllaç Perquè el plegament d'una macromolècula tingui lloc de forma espontània, el sistema ha d'evolucionar cap a un mínim d'energia lliure.

Això exigeix que la variació d'energia lliure global sigui negativa: En l'estat natiu, les distàncies interatòmiques i la pràctica totalitat dels angles se situen en els valors d'equilibri. Les torsions de l'esquelet es concentren en les zones estèricament afavorides que descriu el mapa de Ramachandran. A més, els enllaços amida adopten la configuració trans, amb l'excepció puntual de determinades prolines que es troben en conformació cis. La transició d'aquests residus de prolina de l'estat cis a l'estat trans representa un pas cinètic decisiu in vivo.

Ponts disulfur i el paper de la PDI Els ponts disulfur són enllaços covalents que es formen per oxidació entre dues cadenes laterals de cisteïna espacialment pròximes: Aquests enllaços aporten una alta estabilitat a l'estructura final consolidada. Tanmateix, els ponts disulfur no acceleren la cinètica del plegament. Durant les etapes inicials es produeixen sovint emparellaments incorrectes (disulfurs no natius) que bloquegen temporalment la molècula. Per superar aquest obstacle cinètic, la cèl·lula empra l'enzim Protein Disulfide Isomerase (PDI), encarregat d'isomeritzar i trencar els enllaços disulfur no natius per permetre la formació dels enllaços correctes.

L'experiment de Christian Anfinsen Històricament es creia que els enllaços covalents com els ponts disulfur eren els responsables de dictar la conformació tridimensional. L'investigador Christian Anfinsen va desmuntar aquesta hipòtesi mitjançant el seu cèlebre assaig amb la ribonucleasa A, un enzim petit amb 4 ponts disulfur l'activitat catalítica del qual depèn estrictament de la seva correcta conformació nativa. Esquema del clàssic experiment de desnaturalització i renaturalització d'Anfinsen.

El procediment experimental va seguir els passos següents: ΔG < fold 0 Cys-SH + HS-Cys Cys-S-S-Cys + 2H + + 2e Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 7 EXEMPLE L'assaig d'Anfinsen va demostrar que si l'esquelet adopta primer la disposició espacial correcta gràcies a forces no covalents, les cisteïnes queden encarades i els ponts disulfur es tanquen en la combinació correcta de manera espontània. COMPROVA-HO 11 Què va succeir quan Anfinsen va eliminar el reductor abans que la urea en la segona alíquota?

Avaluació de les forces no covalents en el plegament Demostrat el paper secundari dels disulfurs com a determinants, cal quantificar la contribució individual de les diferents interaccions no covalents: Tipus d'interacció Energia i propietats Per què NO són la força motriu principal Interaccions no específiques (Van der Waals) Forces febles de dispersió i electroestàtiques (< 1 kcal/mol). Individualment aporten molt poca estabilitat; només sumen estabilitat per compactació global. Ponts salins (interaccions iòniques) Atraccions electroestàtiques intenses a llarga distància entre residus carregats.

La majoria se situen a la superfície exterior aquosa; desolvatar-los per situar-los a l'interior exigiria un cost energètic prohibitiu. A més, moltes proteïnes en manquen. Ponts d'hidrogen Interaccions direccionals de curt abast (< 10 kcal/mol). El balanç net és pràcticament neutre: el nombre d'enllaços d'hidrogen que la cadena desplegada estableix amb l'aigua és similar al que forma la cadena plegada intramolecularment. Desnaturalització i reducció: Es va tractar la ribonucleasa amb urea (agent caotròpic que trenca interaccions no covalents) i -mercaptoetanol (agent reductor que trenca els ponts disulfur). La proteïna va perdre tota la seva activitat enzimàtica.

1 β Bifurcació en dues alíquotes: La mostra desnaturalitzada es va dividir en dues fraccions sotmeses a diferents ordres d'eliminació dels reactius: Alíquota 1 (Reversió correcta): Es va retirar primer la urea mitjançant diàlisi, permetent que les interaccions febles pleguessin la cadena, i posteriorment es va eliminar el - mercaptoetanol per oxidar els sulfhidrils. Resultat: La proteïna va recuperar pràcticament el 100 % de l'activitat enzimàtica nativa. Alíquota 2 (Enllaços no natius aberrants): Es va retirar primer el -mercaptoetanol en presència d'urea concentrada, forçant l'oxidació de les cisteïnes mentre la cadena estava desordenada, i posteriorment es va retirar la urea.

Resultat: Es van generar ponts disulfur a l'atzar totalment inactius (menys de l'1 % d'activitat). 2 β β Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 8 Esferes de solvatació aquosa al voltant d'ions carregats. En conseqüència, no existeix una única interacció responsable del plegament, sinó un conjunt integrat de forces febles que actuen de manera cooperativa. ERROR FREQÜENT Atribuir la causa principal del plegament a la formació dels ponts d'hidrogen interns de les hèlixs alfa o làmines beta. Tot i ser fonamentals per a l'arquitectura secundària, en la forma desplegada aquests mateixos grups formen enllaços d'hidrogen d'energia similar amb l'aigua solvent.

PROCÉS Protocol experimental d'Anfinsen i renaturalització 1 Estat natiu actiu Ribonucleasa plegada amb 4 ponts disulfur 2 Desnaturalització total Tractament amb urea i beta-mercaptoetanol 3 Eliminació prèvia de urea Plegament guiat per forces no covalents 4 Oxidació final Retirada de reductor i restabliment del 100 % d'activitat IDEES CLAU L'estat natiu requereix un balanç d'energia lliure global negatiu ( ). Els ponts disulfur estabilitzen l'estructura però no acceleren el procés, podent requerir l'acció de la isomerasa PDI. L'experiment d'Anfinsen va demostrar que són les interaccions no covalents les que guien el plegament correcte, no pas els ponts disulfur.

Cap força no covalent per si sola (ponts d'hidrogen, ponts salins o Van der Waals) és la determinant absoluta del plegament. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 12. Per què els ponts salins no es troben majoritàriament confinats a l'interior de les proteïnes solubles? 13. Quin paper desenvolupa la proteïna disulfur isomerasa (PDI) si es produeix un plegament lent amb oxidacions accidentals? ΔG < fold 0 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 9 Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 14. Quin agent químic emprat per Anfinsen trenca específicament els ponts disulfur covalents? 15. Quina conclusió cabdal es va extreure de l'experiment d'Anfinsen amb ribonucleasa?

16. Per quina raó el balanç global dels ponts d'hidrogen no explica per si sol l'espontaneïtat del plegament? 17. Quina conformació amida predomina de forma gairebé universal llevat de certes prolines? 3 Termodinàmica del plegament: entalpia, entropia i efecte hidrofòbic EN ACABAR SABRÀS Definir el paper de l'entropia conformacional de la cadena i la de l'aigua en el terme global d'energia lliure. Descriure el fenomen de la formació de gàbies d'aigua polièdriques al voltant dels residus apolars. Explicar com el col·lapse hidrofòbic desencadena la formació del glòbul fos.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 18 Com pot un procés ser termodinàmicament espontani si condueix a una molècula molt més ordenada que en el seu punt de partida?

Beta-mercaptoetanol a) Protein Disulfide Isomerase b) Clorur de sodi concentrat c) Urea a concentració saturant d) Els ponts disulfur imposen l'estructura terciària a) La conformació cis de la prolina bloqueja l'activitat b) La urea és necessària per mantenir l'estat actiu c) Les forces no covalents guien el plegament natiu d) Només s'estableixen entre cadenes laterals apolars a) El nombre d'enllaços fets amb l'aigua desplegada és equivalent b) Són enllaços covalents d'energia excessivament elevada c) Es destrueixen completament en assolir l'estat natiu d) Conformació trans a) Conformació eclipsed b) Conformació cis c) Conformació antiperiplanar lliure d) Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 10 Balanç termodinàmic i la contribució conformacional El procés de plegament representa la transició d'un polipèptid desordenat cap a una conformació tridimensional altament organitzada.

L'energia lliure de Gibbs governa aquesta transformació segons l'equació fonamental: Des del punt de vista entàlpic ( ), el balanç depèn de les interaccions establertes entre la cadena i el solvent: residu-residu, aigua-aigua i residu-aigua. A mesura que la molècula es plega es maximitzen les interaccions intramoleculars favorables com els ponts d'hidrogen interiors. Per contra, des del punt de vista de la cadena polipeptídica, l'entropia conformacional és fortament desfavorable ( ). Una cadena desordenada té accés a múltiples confòrmers, mentre que l'estat natiu en selecciona pràcticament un de sol. Gràfica de pous de potencial i densitat de microestats segons l'amplada de la vall.

Els perfils d'energia potencial mostren que un estat amb menor energia no és necessàriament l'únic accessible; l'entropia és directament proporcional al nombre de microestats ( ): Un mínim de pou estret posseeix pocs microestats (baixa entropia), mentre que una vall ampla admet una major densitat d'estats. Afortunadament, la forma desplegada no posseeix una llibertat infinita, sinó una combinació d'un nombre limitat d'estats, fet que rebaixa lleugerament el cost entròpic que suposa restringir la mobilitat de la cadena. COMPROVA-HO 19 Per què l'entropia de la cadena polipeptídica representa un fre per al plegament espontani?

L'efecte hidrofòbic com a motor del procés Com es pot aconseguir un valor de si l'organització de la cadena disminueix l'entropia? La clau termodinàmica rau en el dissolvent aquós. ΔG = fold ΔH fold TΔS fold ΔH ΔS < cadena 0 W S = k lnW B ΔG < fold 0 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 11 Orientació dipolar de molècules d'aigua solvatant un ió positiu. L'aigua líquida solvata tant els grups polars com els apolars de la cadena desplegada. Les molècules d'aigua formen fàcilment enllaços d'hidrogen direccionals entre si i amb grups polars per atracció electroestàtica.

En canvi, davant de residus apolars exposats, l'aigua no pot formar interaccions electroestàtiques intenses; només pot establir febles forces de Van der Waals. DEFINICIÓ Energia lliure de cavitació: treball reversible necessari per crear un buit a l'interior de l'aigua líquida que permeti allotjar un solut apolar, reorganitzant l'estructura del solvent al seu voltant. Per minimitzar aquesta despesa energètica i mantenir la seva xarxa de ponts d'hidrogen, l'aigua s'ordena formant gàbies geomètriques o estructures polièdriques (clatrats) envoltant directament cada residu hidrofòbic exposat. Estructura polièdrica altament ordenada d'aigua envoltant un grup apolar.

Aquestes gàbies d'aigua posseeixen un grau d'ordenació extremament alt, fet que suposa una enorme disminució d'entropia per al dissolvent. Quan dos residus apolars s'acosten i s'associen entre si, l'àrea hidrofòbica exposada a l'aigua es redueix dràsticament: Estat desordenat: Múltiples residus apolars lliures obliguen a formar nombroses gàbies polièdriques de molècules d'aigua immobilitzades. 1 Col·lapse hidrofòbic: Les cadenes apolars s'enterren conjuntament a l'interior del glòbul proteic. 2 Alliberament del solvent: Les gàbies d'aigua es trenquen i centenars de molècules d'aigua tornen al medi lliure.

3 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 12 PER RECORDAR-HO L'efecte hidrofòbic no és una força d'atracció física real entre residus apolars, sinó una conseqüència entròpica del dissolvent: l'aigua expulsa els grups hidrofòbics per maximitzar el seu propi desordre molecular. Aquest efecte genera el pas cap a un estadi conegut com a col·lapse hidrofòbic o estat de glòbul fos, un intermedi compacte on el nucli apolar queda protegit de l'aigua i a partir del qual només calen reajustaments locals per assolir la conformació funcional. ERROR FREQÜENT Confondre l'efecte hidrofòbic amb interaccions entàlpiques favorables entre cadenes apolars.

El motor fonamental és de naturalesa purament entròpica, derivat de l'alliberament i desordenació de les molècules d'aigua de solvatació en enterrar-se els residus apolars. CAUSES I CONSEQÜÈNCIES Gàbies d'aigua desfavorables Ordre rígid del solvent sobre residus apolars Pèrdua d'entropia peptídica Restricció conformacional de la cadena polipeptídica Efecte hidrofòbic i estabilitat nativa Col·lapse hidrofòbic central Agrupació dels residus apolars a l'interior proteic Alliberament de molècules d'aigua Fort augment d'entropia en el solvent aquós IDEES CLAU El plegament requereix superar una variació d'entropia conformacional altament desfavorable a la cadena polipeptídica.

L'aigua circumdant forma gàbies o estructures polièdriques ordenades al voltant de grups apolars exposats. L'efecte hidrofòbic allibera aquestes molècules d'aigua cap al medi lliure, proporcionant l'augment d'entropia necessari per fer espontani el procés. El col·lapse hidrofòbic és el fenomen central que condueix a l'estat compacte de tipus glòbul fos. Guanys d'entropia global: L'augment de desordre de l'aigua ( ) supera el cost d'ordenar la cadena ( ). 4 ΔS aigua 0 ΔS < cadena 0 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 13 COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 20. Com influeix l'energia lliure de cavitació en la insolubilitat dels grups apolars en aigua? 21.

Quin és el signe de la variació d'entropia de l'aigua ( ) quan els residus apolars queden confinats a l'interior de la proteïna plegada? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 22. Com és la variació d'entropia de la cadena polipeptídica durant el seu plegament natiu? 23. Quina estructura adopten les molècules d'aigua al voltant dels grups apolars d'una proteïna desplegada? 24. Quina és la força motriu principal que afavoreix el plegament espontani globular? 25. Què s'esdevé si retirem l'aigua mitjançant l'addició d'agents químics hidrofòbics?

ΔS aigua Negativa a causa de la pèrdua de llibertat a) Molt positiva perquè allibera energia tèrmica b) Nul·la en tractar-se d'un procés espontani c) Positiva per la ruptura d'enllaços d'hidrogen d) Ponts salins directes amb el grup hidrofòbic a) Gàbies polièdriques altament ordenades b) Cadenes lineals d'enllaços covalents c) Estructures esfèriques lliures sense xarxa d) La disminució de l'entropia total de l'univers a) La repulsió electroestàtica dels ponts salins b) La formació exclusiva de ponts disulfur covalents c) L'augment d'entropia de l'aigua per efecte hidrofòbic d) Augmenta la quantitat d'aigua polièdrica en solució a) La proteïna es desnaturalitza per pèrdua d'efecte hidrofòbic b) Els ponts d'hidrogen es tornen covalents i estables c) La proteïna es plega de manera molt més ràpida d) Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 14 4 Cinètica i models de plegament: de les fases al funil entròpic EN ACABAR SABRÀS Comparar els models cinètics de descens downhill, dos estats i múltiples estats.

Distingir entre intermediaris cinètics 'in the path' i 'out of the path'. Analitzar el funcionament del model integrador d'embud entròpic (entropy funnel). PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 26 Per què es diu que el paisatge energètic del plegament té forma d'embut i no pas d'un simple tub estret amb una única via? Cinètica i models experimentals del plegament La determinació cinètica del plegament és experimentalment complexa perquè les etapes més decisives es produeixen en escales de temps que oscil·len entre el microsegon i el mil·lisegon. Per analitzar aquests comportaments s'han proposat tres models cinètics fonamentals: 1.

Model downhill folding (model d'una fase) Proposa que la proteïna existeix pràcticament en l'estat natiu i que les formes desnaturalitzades no són més que excitacions d'aquest mínim energètic. El plegament s'esdevé sense barrera d'activació ("baixada de pendent"), limitat únicament per la difusió dels residus. S'observa en proteïnes molt petites, riques en hèlixs alfa, que es pleguen entre microsegons i mil·lisegons. Perfil d'energia lliure del model downhill folding segons la temperatura. 2. Model dels dos estats Postula exclusivament l'existència de dos estats estables detectables: l'estat natiu ( ) i l'estat desnaturalitzat ( ).

La transició entre ells supera una barrera d'activació clara a través d'un estat de transició, sense intermediaris de vida mitjana suficient per ser mesurats. Les corbes de N U Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 15 desnaturalització per urea mostren una cooperativitat marcada amb un canvi d'estat brusc. Corbes cooperatives de desnaturalització química pel model de dos estats. Dins d'aquest model s'admet sovint l'aparició d'un estat privilegiat de tipus glòbul fos, amb la secundària formada i empaquetament bàsic, que posteriorment requereix reorganitzacions locals més lentes per assolir l'estructura terciària definitiva. 3.

Model de múltiples estats Contempla la formació d'intermediaris cinètics durant la ruta. Aquests intermediaris es classifiquen en dues tipologies: Intermediaris "in the path": Estructures parcialment plegades que condueixen directament a la forma nativa sense desviar-se de la ruta principal; només precisen una petita aportació energètica per continuar el descens. Intermediaris "out of the path": Conformacions atrapades en mínims locals d'energia (males associacions, disulfurs incorrectes o conformacions cis de prolines). La cadena ha de rebre una elevada quantitat d'energia per superar la barrera, desfer l'intermediari i reintegrar-se a la ruta productiva.

Diagrama de la ruta ràpida amb intermediaris productius in the path. Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 16 Ruta lenta amb intermediaris atrapats en mínims locals out of the path. COMPROVA-HO 27 Quina diferència energètica presenta un intermediari "in the path" respecte d'un "out of the path"? Mecanismes teòrics de plegament Per descriure la seqüència temporal de formació dels elements estructurals s'han plantejat diversos models clàssics: Model de plegament Mecanisme descrit Model del trencaclosques No existeix una ruta preferida. Cada molècula es plega per un camí diferent i tots convergeixen en l'estat natiu.

Model de l'armadura Condensació local primerenca d'elements secundaris independents que col·lapsen fins a formar la terciària. Model clàssic de nucleació Un petit grup de residus propers forma un nucli estable ràpid que serveix de plantilla de creixement. Model de col·lapse hidrofòbic Ràpida compactació dels residus hidrofòbics cap a l'interior (glòbul fos); després es reorganitza la terciària. Model de nucleació- condensació Híbrid entre nucleació i col·lapse: es forma un nucli difús sense estructura secundària definida sobre el qual col·lapsa tota la proteïna de forma simultània.

Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 17 Esquemes dels diferents mecanismes clàssics de plegament proteic. Model integrador: l'embut entròpic (entropy funnel) Per unificar els models anteriors i resoldre definitivament la paradoxa de Levinthal s'ha establert el concepte de l'embut d'energia o entropy funnel. Representació tridimensional de l'embud d'energia o paisatge entròpic. El procés de plegament es descriu com el descens per un paisatge energètic rugós (energy landscape). A la part superior de l'embut, la proteïna desplegada disposa d'un màxim d'entropia i nombrosos camins possibles.

A mesura que es formen contactes natius favorables, l'amplada de l'espai conformacional es redueix progressivament disminuint l'entropia i el nivell d'energia lliure. Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 18 PER RECORDAR-HO L'entropy funnel demostra que no cal una ruta única fixa: múltiples conformacions inicials llisquen per diferents trajectòries de la paret de l'embut fins a convergir en el mínim global d'energia de l'estat natiu.

Aquest model ofereix la solució matemàtica i física a Levinthal: en anar canalitzant l'espai de conformacions accessibles de manera contínua a través del descens energètic, el nombre d'estats a explorar es redueix exponencialment, explicant per què el plegament es completa en fraccions de segon. ERROR FREQÜENT Pensar que totes les proteïnes segueixen obligatòriament una ruta única i idèntica pas a pas. El model de paisatge energètic de l'embud entròpic demostra que molècules individuals poden seguir diferents trajectòries conformacionals fins a convergir en el mateix estat natiu.

PROCÉS Descens conformacional en l'embud entròpic 1 Estat desplegat Màxima entropia i multitud de rutes possibles a la vora 2 Col·lapse hidrofòbic Descens energètic i formació de l'estat de glòbul fos 3 Restricció d'estats Reducció de l'amplitud conformacional i eliminació de trampes 4 Estat natiu final Mínim global d'energia lliure i màxima estabilitat biològica IDEES CLAU El model downhill folding suposa un descens continu sense barrera d'activació, característic de proteïnes petites helicoïdals. El model de dos estats defineix una transició cooperativa entre l'estat desplegat i el natiu a través d'un estat de transició.

Els intermediaris "out of the path" queden atrapats en mínims locals d'energia i retarden el plegament. L'entropy funnel (embud entròpic) és el model integrador que descriu com el paisatge energètic canalitza múltiples rutes reduint l'espai conformacional fins a l'estat natiu. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 28. Com descriu el model de nucleació-condensació l'acoblament dels elements d'estructura secundària i terciària? 29. De quina manera l'embut d'energia (entropy funnel) dóna explicació satisfactòria a la paradoxa de Levinthal? Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 19 Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 30.

Quina característica singular defineix el model downhill folding? 31. Què representa un intermediari 'out of the path' en el model de múltiples estats? 32. Com es representa l'amplitud conformacional a la part superior de l'embud entròpic? 33. Quin model de plegament defensa que la compactació apolar interior precedeix la consolidació de l'estructura terciària? 5 Resum per repassar Principis i conformacions proteiques Concepte Definició resumida Autonomia del plegament La informació necessària per assolir l'estructura nativa està continguda de manera intrínseca en la pròpia seqüència d'aminoàcids.

Xaperones Facilitadores del plegament que acceleren la cinètica i eviten agregats no natius sense imposar l'estructura final. Proteïnes IDP Cadenes polipeptídiques intrínsecament desestructurades que només s'estabilitzen tridimensionalment en unir-se al seu lligand específic.

Atrapament sistemàtic en mínims no natius a) Manca total de barrera energètica d'activació b) Dependència estricta de la isomerització de prolines c) Presència d'una elevada barrera d'activació d) Una estructura que avança directament cap a l'estat natiu a) Un complex covalent irreversible amb xaperones b) La forma desplegada inicial sense cap contacte c) Una espècie atrapada en un pou energètic local d) Idèntica a la de la punta inferior del pou a) Molt reduïda amb un únic confòrmer natiu b) Ampla, corresponent a la màxima entropia c) Zero perquè no hi ha moviment tèrmic d) Model de l'armadura a) Model de col·lapse hidrofòbic b) Model del trencaclosques c) Model downhill folding pur d) Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 20 Concepte Definició resumida Glòbul fos (Molten globule) Estat intermedi compacte que ja posseeix estructura secundària definida però manca d'empaquetament terciari rígid.

Paradoxa de Levinthal Diferència entre el temps teòric gairebé infinit d'un mostreig aleatori i la rapidesa real del plegament biològic (microsegons a minuts). Forces motrius i experiment d'Anfinsen Concepte Definició resumida Experiment d'Anfinsen Demostració amb ribonucleasa que les interaccions febles no covalents guien el plegament correcte abans de la consolidació dels ponts disulfur. Protein Disulfide Isomerase (PDI) Enzim que isomeritza enllaços disulfur no natius formats accidentalment durant etapes cinètiques lentes. Prolina cis/trans Configuració peptídica minoritària in vivo la isomerització de la qual actua com un pas limitant en la cinètica de plegament.

Ponts salins i d'hidrogen Interaccions electroestàtiques que estabilitzen regions concretes però el balanç energètic net de les quals no constitueix la força motriu exclusiva. Termodinàmica i efecte hidrofòbic Concepte Definició resumida Entropia conformacional Variació altament desfavorable a la cadena peptídica per la pèrdua de mobilitat en passar de molts confòrmers a l'estat natiu únic. Energia de cavitació Treball reversible requerit per obrir una cavitat en la xarxa d'aigua per allotjar un solut apolar. Efecte hidrofòbic Motor principal del plegament degut a l'alliberament d'estructures polièdriques rígides d'aigua en agrupar-se els residus apolars a l'interior.

Cinètica i models de plegament Concepte Definició resumida Downhill folding Model de plegament sense barrera d'activació limitat només per la difusió en proteïnes petites molt helicoïdals. Model de dos estats Transició cooperativa directa entre la forma desplegada i la nativa a través d'un únic estat de transició. Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 21 Concepte Definició resumida Intermediaris out of the path Espècies atrapades en mínims locals d'energia que requereixen energia extra per revertir i reprendre la ruta de plegament.

Embut entròpic (Entropy funnel) Model integrador basat en un paisatge energètic rugós on múltiples trajectòries van reduint l'espai conformacional fins a convergir en l'estat natiu. Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 22 Solucions de les preguntes de repàs 1. Perquè el plegament no és un procés a l'atzar, sinó que està guiat per un gradient energètic que canalitza ràpidament la cadena cap a l'estat més estable. 2. Actuen com a catalitzadors evitant rutes d'agregació o plegaments aberrants i millorant la velocitat del procés, però l'estructura tridimensional nativa continua determinada exclusivament per la seqüència primària d'aminoàcids. 3.

Que les proteïnes no exploren totes les seves combinacions conformacionals a l'atzar fins a trobar la bona, sinó que segueixen rutes energèticament dirigides que escurcen el temps de cerca a fraccions de segon. 4. El glòbul fos té els elements d'estructura secundària ben formats i definits, però la seva disposició topològica terciària no és fixa ni compactada de forma única. 5. Perquè cada residu té dos angles principals de gir en l'esquelet ( i ), sumant 200 angles en 100 residus; cadascun amb 12 orientacions possibles produeix confòrmers. 6. b) Acceleren el procés evitant plegaments erronis.

Les xaperones són catalitzadors que faciliten la velocitat i eviten agregats, però no modifiquen la informació intrínseca del plegament. 7. a) Manca d'una estructura global fixa aïllades. Les IDP manquen d'una estructura tridimensional concreta definida quan estan lliures, adoptant sovint estructura en unir-se al lligand. 8. c) Més de 10.000 milions d'anys. El càlcul teòric mostra que caldrien uns 10.173 milions d'anys, un lapse immensament superior a l'edat de l'univers. 9. d) La que manté l'estat actiu sense senyal. Si Egfr es manté constantment en conformació activa en absència de lligand, la cèl·lula rep un senyal permanent de proliferació. 10.

Perquè les forces no covalents han de posicionar primer l'esquelet en l'orientació correcta; si s'oxida abans de plegar-se, es formen disulfurs creuats a l'atzar totalment erronis. 11. Les cisteïnes van oxidar-se a l'atzar en una cadena encara desestructurada, generant combinacions errònies de ponts disulfur que van inactivar la proteïna. 12. Perquè els grups carregats interaccionen fortament amb les molècules d'aigua perifèriques; transferir- los al medi hidrofòbic interior requereix una despesa energètica de desolvatació molt desfavorable. 13.

La PDI trenca de manera transitòria els ponts disulfur no natius perquè la cadena es reorganitzi i formi els disulfurs corresponents a l'estat natiu funcional. 14. a) Beta-mercaptoetanol. El beta-mercaptoetanol és l'agent reductor responsable de trencar els ponts disulfur entre cisteïnes. 15. d) Les forces no covalents guien el plegament natiu. Va provar que les interaccions febles no covalents són les veritables guies del plegament autònom de la cadena. 16. b) El nombre d'enllaços fets amb l'aigua desplegada és equivalent. En estat desplegat, els residus formen enllaços d'hidrogen amb l'aigua; en plegar-se es formen enllaços interns, resultant en un canvi net d'energia moderat. 17.

a) Conformació trans. L'enllaç amida es troba majoritàriament en conformació trans per evitar xocs estèrics, llevat d'algunes prolines. 18. Perquè l'espontaneïtat requereix que augmenti l'entropia total de l'univers: la petita pèrdua de desordre de la cadena queda compensada per l'enorme desordre que guanyen les molècules d'aigua alliberades. ϕ ψ 12200 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 23 19. Perquè en passar d'un conjunt ampli de conformacions desordenades a una única configuració tridimensional nativa ordenada, es produeix una pèrdua dràstica de graus de llibertat conformacionals ( ). 20.

És una energia desfavorable perquè requereix trencar l'estructura en xarxa de l'aigua per crear una cavitat que contingui el solut apolar, compensant-se només amb febles forces de Van der Waals. 21. És positiu ( ), ja que les molècules d'aigua atrapades a les gàbies polièdriques rígides s'alliberen i recuperen mobilitat en el dissolvent. 22. a) Negativa a causa de la pèrdua de llibertat. Com que es passa d'un estat desordenat d'alta flexibilitat a una única conformació ordenada, l'entropia de la cadena disminueix. 23. b) Gàbies polièdriques altament ordenades. L'aigua s'ordena formant gàbies polièdriques al voltant dels residus apolars per conservar els seus ponts d'hidrogen. 24.

d) L'augment d'entropia de l'aigua per efecte hidrofòbic. L'alliberament de l'aigua de solvatació i el seu increment d'entropia compensa sobradament el cost d'ordenar el polipèptid. 25. b) La proteïna es desnaturalitza per pèrdua d'efecte hidrofòbic. L'absència o disminució de la fase aquosa desestabilitza l'efecte hidrofòbic, provocant la desnaturalització de les proteïnes. 26. Perquè una proteïna pot iniciar el plegament des de nombroses conformacions diferents que van convergint en l'estat natiu a mesura que perden entropia i energia. 27.

L'intermediari "in the path" segueix la ruta descendent cap a l'estat natiu amb petites barreres, mentre que l'"out of the path" queda blocat en un mínim local energètic profund del qual ha de sortir retrocedint. 28. Planteja la formació d'un nucli difús i inestable sense estructura secundària prèvia, sobre el qual es formen simultàniament l'estructura secundària i la terciària en col·lapsar. 29. Demostrant que la cadena no fa un mostreig a l'atzar, sinó que és guiada per un pendent d'energia que restringeix ràpidament l'espai de conformacions possibles a mesura que avança cap al mínim natiu. 30. b) Manca total de barrera energètica d'activació.

El model downhill folding planteja un procés continu sense barrera d'activació, limitat només per la difusió de residus. 31. d) Una espècie atrapada en un pou energètic local. Són intermediaris que queden atrapats en conformacions no directives i necessiten energia per desfer-se i tornar a la ruta. 32. c) Ampla, corresponent a la màxima entropia. A la part superior, l'espai és màxim degut a l'alta quantitat d'estats conformacionals de la molècula desplegada. 33. b) Model de col·lapse hidrofòbic. El model de col·lapse hidrofòbic descriu la formació ràpida del glòbul fos apolar, a partir del qual es defineix la terciària nactiva.

ΔS < 0 ΔS > aigua 0 Plegament de Proteïnes: Termodinàmica i Models Cinètics 24