Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo

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APUNTES BIOQUÍMICA Grado en Biotecnología Universidad de Barcelona AprenAI 2026-2027 Domina la estructura proteica, cinética enzimática, cadena respiratoria mitocondrial y síntesis de proteínas con explicaciones claras, esquemas y tablas.

APREN.AI Índice Estructura de proteínas 1 Aminoácidos, enlace peptídico y niveles conformacionales Estructura general y clasificación de los aminoácidos proteicos Propiedades ópticas y quiralidad Propiedades ácido-base e ionización Formación y características geométricas del enlace peptídico Clasificación general de las proteínas Nivel primario y evolución de secuencias Estructura secundaria periódica Proteínas fibrosas y conformación del colágeno Estructura terciaria, dominios y fuerzas estabilizadoras Estructura cuaternaria y proteínas de membrana 2 Plegamiento y chaperonas moleculares Termodinámica del plegamiento y conformación nativa Teoría del embudo de plegamiento y trampas energéticas Chaperonas moleculares: función y clasificación Chaperonas monoméricas frente a chaperoninas en caja Organización estructural y ciclo catalítico de GroEL-GroES Enzimología 3 Catálisis, centro activo y mecanismos catalíticos 1.

Biocatalizadores y componentes moleculares 2. Clasificación funcional internacional (código EC) 3. Anatomía y microentorno del centro activo 4. Barrera de activación y energía de fijación 5. Estrategias catalíticas fundamentales 6.

Cuantificación de la actividad enzimática 4 Cinética de Michaelis-Menten, linearización e inhibición Principios de cinética química y velocidad inicial Modelo cinético de Michaelis-Menten y aproximación de Briggs-Haldane Parámetros cinéticos fundamentales: Km, Vmax, kcat y eficiencia catalítica Linearización de datos cinéticos Inhibición reversible: patrones cinéticos y gráficos Inhibición irreversible y modificaciones covalentes Cinética de sistemas bisustrato 5 Regulación enzimática y complejos multienzimáticos Estrategias temporales del control enzimático: largo y corto plazo Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 1 Modulación no covalente: cooperatividad y comportamiento alostérico Modificación covalente reversible: fosforilación y desfosforilación Modificación covalente irreversible: activación de zimógenos Diversidad funcional mediante isoenzimas Complejos multienzimáticos: canalización metabólica 6 Bioenergética — Principios termodinámicos y enlaces ricos en energía Termodinámica celular y acoplamiento energético Organización metabólica: catabolismo y anabolismo Estructura del adenosín trifosfato (ATP) y bases de su alta energía Jerarquía de compuestos fosforilados y fosforilación a nivel de sustrato Otros enlaces ricos en energía metabólica y transducción de trabajo Fosforilación oxidativa 7 Cadena respiratoria mitocondrial y transporte electrónico Fundamentos termodinámicos y compartimentación mitocondrial Grupos prostéticos y transportadores electrónicos Complejos I y II: Puertas de entrada de los equivalentes de reducción Complejo III y el Ciclo Q Complejo IV y reducción del oxígeno Inhibidores específicos del transporte electrónico 8 Síntesis de ATP, teoría quimiosmótica y transporte mitocondrial Teoría quimiosmótica y fuerza protón-motriz Estructura y mecanismo catalítico de la ATP sintasa Relación P/O y rendimiento energético de la fosforilación oxidativa Control respiratorio y estados fisiológicos mitocondriales Sistemas de transporte en la membrana interna mitocondrial Lanzaderas de equivalentes de reducción citosólicos: la lanzadera de malato-aspartato Desacoplamiento mitocondrial e ionóforos Flujo de información genética 9 Transcripción y procesamiento del ARN Bases moleculares de los ácidos nucleicos Naturaleza selectiva de la transcripción Fases del mecanismo de transcripción Acoplamiento espaciotemporal en procariotas y eucariotas Maduración postranscripcional del ARN heterogéneo nuclear 10 Código genético, activación y traducción proteica Maquinaria molecular de la traducción y tipos de ARN Estructura del ribosoma y la catálisis por ribozimas Estructura del ARNt maduro y activación de aminoácidos Características del código genético y la hipótesis del balanceo Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 2 Etapas del proceso de traducción en procariotas 11 Resumen para repasar Estructura y plegamiento de proteínas Enzimología y catálisis Cinética y regulación enzimática Bioenergética y metabolismo oxidativo Flujo de información genética Soluciones de las preguntas de repaso Estos apuntes pueden contener errores u omisiones.

Son un material de apoyo y no sustituyen al temario oficial ni al profesorado: contrasta la información importante. Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 3 1 Aminoácidos, enlace peptídico y niveles conformacionales AL ACABAR SABRÁS Clasificar los aminoácidos según la polaridad y carga de su radical R. Calcular el punto isoeléctrico y predecir el estado de ionización a diferentes pH. Describir la geometría del enlace peptídico y la restricción de sus ángulos diedros. Diferenciar las fuerzas estabilizadoras de los cuatro niveles conformacionales.

PIÉNSALO ANTES DE LEER 1 ¿Por qué un aminoácido en disolución acuosa a pH neutro casi nunca se encuentra en su forma molecular no ionizada? Las proteínas son macromoléculas biológicas formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos covalentemente. Su arquitectura espacial determina directamente su actividad biológica dentro de la célula.

Estructura de proteínas 1 Aminoácidos, enlace peptídico y niveles conformacionales 2 Plegamiento y chaperonas moleculares Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 4 ESQUEMA Organización estructural de las proteínas Estructura general y clasificación de los aminoácidos proteicos Los aminoácidos proteicos comparten un átomo de carbono central ( ) unido a un grupo carboxilo (- COOH), un grupo amino ( ), un átomo de hidrógeno ( ) y una cadena lateral distintiva denominada radical R. Existen unos 200 aminoácidos en la naturaleza que no poseen codón genético, actúan como intermediarios metabólicos y no forman parte de las proteínas.

Según la naturaleza química de su cadena lateral R, los aminoácidos proteicos se agrupan en tres familias principales: Grupo Características del radical R Aminoácidos integrantes Polares sin carga Contienen grupos hidrófilos con funciones hidroxilo ( ), tiol ( ) o amida. Forman enlaces de hidrógeno con el agua. Glicina (Gly, G), Serina (Ser, S), Cisteína (Cys, C), Treonina (Thr, T), Asparagina (Asn, N), Glutamina (Gln, Q), Tirosina (Tyr, Y). No polares (apolares) Cadenas hidrófobas alifáticas o aromáticas. No presentan grupos ni ; pueden poseer azufre tioéter no terminal.

Alanina (Ala, A), Valina (Val, V), Leucina (Leu, L), Isoleucina (Ile, I), Metionina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Triptófano (Trp, W), Prolina (Pro, P). Polares con carga (ionizables) Grupos funcionales que adquieren carga neta a pH fisiológico. Se dividen en ácidos (carga negativa) y básicos (carga positiva). Ácidos: Aspartato (Asp, D), Glutamato (Glu, E). Básicos: Lisina (Lys, K), Arginina (Arg, R), Histidina (His, H).

Estructura primaria Secuencia lineal de residuos unidos por enlace peptídico amida Estructura secundaria Plegamientos locales periódicos como hélice alfa y lámina beta Hélice alfa Enrollamiento helicoidal dextrógiro estabilizado por puentes intracatenarios 〰 Lámina beta Hebras polipeptídicas extendidas paralelas o antiparalelas Estructura terciaria Conformación tridimensional globular completa de una cadena Dominios proteicos Unidades funcionales y de plegamiento autónomas Estructura cuaternaria Asociación supramolecular de múltiples subunidades peptídicas C α NH 2 H OH SH OH SH Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 5 DEFINICIÓN Un zwitterión es una especie dipolar eléctricamente neutra que presenta simultáneamente grupos funcionales con carga positiva y negativa.

Propiedades ópticas y quiralidad El carbono de casi todos los aminoácidos es un centro quiral o asimétrico al estar enlazado a cuatro sustituyentes químicos distintos. La única excepción es la glicina por carecer de quiralidad, ya que su radical R es un segundo átomo de hidrógeno. Debido a esta asimetría, los aminoácidos existen como dos estereoisómeros especulares (enantiómeros) denominados configuraciones D y L. En la proyección de Fischer convencional, se clasifica como L-aminoácido cuando el grupo amino se sitúa hacia la izquierda, y como D-aminoácido cuando se orienta a la derecha.

Salvo excepciones específicas, las proteínas ribosomales están constituidas exclusivamente por L-alfa-aminoácidos. COMPRUEBA 2 ¿Por qué la glicina es el único aminoácido proteico que carece de actividad óptica? Propiedades ácido-base e ionización Los aminoácidos presentan un comportamiento anfótero: pueden captar o ceder protones según el valor del medio. En disolución acuosa experimentan equilibrios de disociación escalonados. El valor de pK representa el pH en el cual coexisten en concentraciones equivalentes la forma disociada y la no disociada de un grupo funcional concreto: : corresponde a la desprotonación del grupo ( ). : corresponde a la desprotonación del grupo ( ).

: constante de ionización de la cadena lateral R en aminoácidos ácidos o básicos. El punto isoeléctrico ( ) se define como el pH en el que la carga neta del aminoácido es exactamente cero. En este valor, la concentración de grupos catiónicos ( ) iguala a la de grupos aniónicos ( ). Para aminoácidos dipróticos sencillos sin cadena ionizable, el valor de se calcula mediante la media aritmética entre y : La relación entre el pH ambiental y el punto isoeléctrico determina el signo de la carga molecular neta: Si : la molécula se protona y predomina como catión (carga neta positiva). Si : predomina el zwitterión con carga eléctrica neta cero.

Si : la molécula cede protones y predomina como anión (carga neta negativa). COMPRUEBA 3 Si un aminoácido presenta un pI de 6,0 y se sumerge en un tampón a pH 8,5, ¿hacia qué polo migrará en una electroforesis? α pK 1 α-carboxilo COOH COO + H+ pK 2 α-amino NH 3 + NH + 2 H+ pK R π NH 3 + COO π pK 1 pK 2 π = 2 pK + pK 1 2 pH < π pH = π pH > π Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 6 Formación y características geométricas del enlace peptídico La unión entre dos aminoácidos se produce mediante un enlace amida covalente denominado enlace peptídico.

Se forma por la condensación nucleofílica entre el grupo de un residuo y el grupo del residuo contiguo, liberando una molécula de agua ( ). El polímero resultante conserva un extremo amino libre (N-terminal) a la izquierda y un extremo carboxilo libre (C-terminal) a la derecha, eje a partir del cual se nombran sus residuos con la terminación -il salvo el último. Esquema del plano rígido amida y los ángulos diedros phi y psi. El enlace peptídico se comporta como un híbrido de resonancia entre el enlace simple C-N y el doble enlace . Por consiguiente, los electrones del grupo carbonilo y del nitrógeno amídico se encuentran deslocalizados.

Esto genera una serie de propiedades geométricas estrictas: ERROR FRECUENTE Asumir erróneamente que la cadena peptídica rota libremente a lo largo del enlace C-N. Este enlace posee un 40% de carácter de doble enlace por resonancia que bloquea la rotación; únicamente pueden rotar los ángulos diedros ( ) y ( ).

Clasificación general de las proteínas Las proteínas se clasifican en función de diversos criterios morfológicos, moleculares y de función celular: Por su composición: Holoproteínas (integradas únicamente por aminoácidos) y heteroproteínas o conjugadas (asociadas a una fracción no proteica denominada grupo prostético: glucoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, fosfoproteínas, metaloproteínas, flavoproteínas y cromoproteínas). Por el número de subunidades: Monoméricas (constituidas por una única cadena, como la lisozima y la mioglobina) u oligoméricas (dos o más cadenas o protómeros, que pueden ser homoméricas o heteroméricas).

α-carboxilo α-amino H O 2 C = N π Coplanaridad y rigidez: Los seis átomos del grupo peptídico ( , C, O, N, H y el siguiente ) se localizan en un único plano rígido amida. 1 C α C α Ausencia de rotación interna: El carácter de doble enlace parcial impide el giro del enlace central C- N. 2 Ángulos diedros de giro: La flexibilidad conformacional de la cadena polipeptídica reside exclusivamente en los enlaces contiguos al carbono alfa: el ángulo diedro (phi) entre el y el nitrógeno amínico, y el ángulo diedro (psi) entre el y el carbono carbonílico.

3 Φ C α Ψ C α Φ N-C α Ψ C -C α Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 7 Por su forma global: Fibrosas (cadenas alargadas, insolubles y de función estructural) y globulares (redondeadas, solubles y dinámicas). Por su función biológica: Catalíticas (enzimas), transporte sistémico (albúmina, hemoglobina) o transmembrana (canales), soporte estructural (colágeno, queratinas), contráctiles (actina, miosina), reserva energética/nutricional (caseína, ferritina), defensa inmune (inmunoglobulinas, trombina) y reguladoras (factores de transcripción, hormonas peptídicas).

Nivel primario y evolución de secuencias La estructura primaria es la secuencia covalente, lineal y ordenada de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Dicta la pauta de replegamiento de las estructuras superiores, el destino intracelular y la función bioquímica global. Es propia de cada especie, y el número de aminoácidos variables es proporcional a la distancia filogenética entre organismos. En las proteínas homólogas (proteínas con funciones equivalentes en especies divergentes), se distinguen residuos invariables o conservados, indispensables para la estabilidad estructural o catalítica, y residuos variables.

Si una mutación sustituye un aminoácido alterando de forma apreciable la función, constituye un cambio no conservativo. COMPRUEBA 4 ¿Qué consecuencia tiene sobre la función proteica la mutación de un residuo invariable frente a uno variable? Estructura secundaria periódica La estructura secundaria engloba las conformaciones locales periódicas adoptadas por el esqueleto polipeptídico, estabilizadas mediante puentes de hidrógeno entre los átomos amídicos y carbonílicos de la cadena principal. En la hélice alfa, la cadena se enrolla como un cilindro dextrógiro estabilizado por puentes de hidrógeno intracatenarios y paralelos al eje central.

Cada enlace de hidrógeno se establece entre el grupo del residuo y el grupo N-H del residuo . Presenta 3,6 residuos por vuelta, proyectando las cadenas laterales R hacia el exterior para minimizar impedimentos estéricos. Ciertos aminoácidos favorecen su formación (Ala, Leu, Met, Phe), mientras que residuos voluminosos o con carga idéntica consecutiva la desestabilizan (Ser, Thr, Ile, Glu, Lys). La prolina actúa como interruptor de la hélice al carecer de hidrógeno amídico libre y poseer un anillo rígido que distorsiona el ángulo diedro. C = O i i + 4 Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 8 Diagrama estructural de la lámina beta con puentes de hidrógeno intercatenarios.

En la conformación lámina beta (hoja plegada), los esqueletos se extienden en zigzag a lo largo de un plano con los grupos funcionales orientados perpendicularmente al eje. Las cadenas laterales se alternan por encima y por debajo del plano. Esta disposición está estabilizada por puentes de hidrógeno intercatenarios y se organiza en dos variantes principales: láminas antiparalelas (cadenas contiguas en sentidos opuestos, con puentes de hidrógeno lineales y mayor estabilidad geométrica) y láminas paralelas (cadenas en idéntico sentido con enlaces inclinados). Los giros beta (o lazos) conectan tramos sucesivos de hélices o láminas beta invirtiendo el sentido de la cadena polipeptídica en 180°.

Se componen de cuatro aminoácidos estabilizados por un puente de hidrógeno entre los residuos 1 y 4. Se diferencian en dos clases: el giro beta tipo 1 (frecuente en diversos aminoácidos) y el giro beta tipo 2, caracterizado por presentar obligatoriamente un residuo de prolina o glicina en posiciones críticas para facilitar el cambio brusco de curvatura. Proteínas fibrosas y conformación del colágeno Las proteínas fibrosas proporcionan resistencia física y soporte tisular. El colágeno representa aproximadamente un tercio de la masa proteica total en vertebrados.

Se caracteriza por una composición aminoacídica atípica constituida por aproximadamente 35% de glicina, 12% de prolina, 11% de alanina y 9% de hidroxiprolina, repitiendo el motivo o . A diferencia de la hélice alfa globular, la cadena individual de colágeno es una hélice levógira con 3 residuos por vuelta, más abierta y extendida, sin puentes de hidrógeno intracatenarios. Tres de estas hélices levogiras se asocian arrollándose entre sí hacia la derecha para formar una superhélice rígida denominada tropocolágeno. Esta estructura está estabilizada por enlaces de hidrógeno entre cadenas contiguas , careciendo de puentes disulfuro.

COMPRUEBA 5 ¿En qué difieren esencialmente la hélice alfa y la hélice de la cadena del colágeno? N C (Gly-Pro-X) (Gly-X-Hyp) Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 9 Estructura terciaria, dominios y fuerzas estabilizadoras La estructura terciaria describe la disposición tridimensional completa en el espacio de todos los átomos de un polipéptido, incluyendo las relaciones de largo alcance entre cadenas laterales distantes en la secuencia lineal. Los motivos o estructuras supersecundarias se ensamblan para originar un plegamiento globular consolidado.

Las cadenas polipeptídicas complejas suelen dividirse en dominios proteicos: unidades estructurales compactas y funcionalmente independientes capaces de plegarse de forma autónoma. En las proteínas globulares acuosas, los aminoácidos apolares se ocultan densamente en el núcleo interior hidrófobo, mientras que los residuos polares e ionizables se disponen orientados hacia la superficie en contacto con el agua. El estado termodinámicamente funcional recibe el nombre de conformación nativa (véase «Estructura de proteínas — Plegamiento y chaperonas moleculares»).

La estabilidad de la conformación nativa resulta del equilibrio coordinado entre interacciones moleculares con diferencias energéticas pronunciadas: Interacciones débiles no covalentes: Aportan estabilidad cooperativa global. Su rotura demanda entre 4 y 30 kJ/mol. Comprenden interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, atracciones electrostáticas (puentes salinos) y fuerzas de dispersión de van der Waals. Enlaces covalentes: Principalmente puentes disulfuro ( ) formados entre dos residuos de cisteína mediante oxidación. Su fractura requiere entre 200 y 460 kJ/mol. Nivel Definición Enlaces estabilizadores principales Primario Orden lineal y covalente de aminoácidos ( ).

Enlaces peptídicos amida (covalentes, 200-460 kJ/mol). Secundario Plegamiento periódico local del esqueleto polipeptídico. Puentes de hidrógeno entre grupos y N-H principales. Terciario Arquitectura tridimensional globular completa de una cadena. Interacciones hidrofóbicas, puentes salinos, van der Waals y puentes disulfuro. Cuaternario Ensamblaje espacial de múltiples cadenas o subunidades. Predominio de fuerzas no covalentes débiles (raramente disulfuro). Estructura cuaternaria y proteínas de membrana La estructura cuaternaria define la agregación espacial y la interacción estequiométrica de dos o más cadenas polipeptídicas individuales (subunidades o protómeros).

Un ejemplo de ajuste alostérico dependiente de ligando ocurre en la hemoglobina tetramérica, en la cual la unión del oxígeno induce un desplazamiento angular de 15° entre sus monómeros. En el contexto biológico celular, numerosas proteínas realizan su actividad ancladas en la bicapa lipídica. Las proteínas de membrana se categorizan según el grado de asociación con el entorno lipídico: S S N C C = O Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 10 Clasificación de proteínas de membrana y sus mecanismos de disociación química. Proteínas integrales (o transmembrana): Atraviesan la bicapa fosfolipídica.

Presentan una distribución invertida respecto a las proteínas solubles: sus residuos hidrófobos se exponen hacia el exterior interactuando con los lípidos grasos, mientras que los aminoácidos hidrófilos se recluyen en el canal interior. Solo se disocian empleando agentes detergentes o disolventes orgánicos. 1 Proteínas periféricas: Se ligan a las cabezas polares de la bicapa o a proteínas integrales mediante enlaces electrostáticos y puentes de hidrógeno. Se desprenden suavemente por cambios en el pH, agentes quelantes o variaciones de fuerza iónica.

2 Proteínas anfitrópicas: Alternan de forma regulada su localización entre el citosol soluble y la asociación reversible con la superficie de la membrana. 3 Proteínas ancladas a lípidos (GPI): Proteínas hidrófilas unidas covalentemente a un resto de glucosilfosfatidilinositol insertado en la membrana. Se escinden y liberan selectivamente por acción de la fosfolipasa C. 4 Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 11 IDEAS CLAVE Los aminoácidos proteicos son moléculas anfóteras y quirales (excepto la glicina) que existen preferentemente bajo la serie configuracional L.

El punto isoeléctrico ( ) marca el pH específico en el que el aminoácido o péptido carece de carga eléctrica neta. El enlace peptídico tiene un marcado carácter parcial de doble enlace por resonancia que impone coplanaridad y restringe el giro exclusivamente a los enlaces y . La hélice alfa está estabilizada por puentes de hidrógeno intracatenarios axiales, mientras que la lámina beta recurre a enlaces de hidrógeno intercatenarios entre hebras paralelas o antiparalelas. La rotura de interacciones no covalentes débiles requiere de 4 a 30 kJ/mol, mientras que disociar enlaces covalentes requiere entre 200 y 460 kJ/mol.

Las proteínas integrales invierten la polaridad espacial globular: sitúan sus residuos apolares en la periferia membranosa y los polares hacia canales internos acuosos. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 6. ¿Cómo se calcula el punto isoeléctrico de un aminoácido neutro sin cadena lateral ionizable? 7. ¿Por qué la prolina tiende a romper o desestabilizar la conformación en hélice alfa? 8. ¿De qué manera difiere el aislamiento bioquímico de una proteína integral de membrana respecto a una periférica? ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS 2 Plegamiento y chaperonas moleculares AL ACABAR SABRÁS Describir la variación de energía libre y entropía en el embudo de plegamiento proteico.

Explicar el papel termodinámico del colapso hidrofóbico y el origen de las trampas cinéticas. Distinguir el mecanismo de acción de HSP70 frente a los complejos en caja como GroEL-GroES. Diferenciar las chaperoninas del Grupo I y Grupo II según su estructura y modo de cierre. PIÉNSALO ANTES DE LEER 9 ¿Por qué una proteína desnaturalizada que se pliega espontáneamente en un tubo de ensayo puede fallar y agregarse si intenta hacerlo dentro de una célula viva? Termodinámica del plegamiento y conformación nativa La conformación nativa es el estado tridimensional y funcional de una proteína en su entorno biológico estándar.

Desde el punto de vista biofísico, representa el estado termodinámicamente más estable, situándose en el mínimo global de energía libre (véase «Bioenergética — Principios termodinámicos y π Φ Ψ Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 12 enlaces ricos en energía»). A medida que la cadena polipeptídica transita desde un ovillo aleatorio desordenado hacia su arquitectura nativa, ocurren cambios simultáneos en las magnitudes termodinámicas: Disminución de energía libre: el proceso avanza espontáneamente hacia un nivel energético basal más favorable.

Disminución de entropía conformacional: la flexibilidad del esqueleto peptídico se restringe drásticamente al adoptar una única geometría definida. El principal motor que impulsa este colapso es la fuerza hidrofóbica. Los residuos apolares tienden a excluirse del solvente acuoso circundante y agruparse en el núcleo interno de la proteína globular. Este empaquetamiento libera moléculas de agua estructurada, lo que compensa la pérdida de entropía del propio polipéptido mediante un incremento entrópico en el disolvente.

DEFINICIÓN La conformación nativa es la estructura tridimensional biológicamente activa de una proteína, caracterizada por alcanzar la mínima energía libre y la máxima estabilidad termodinámica bajo condiciones fisiológicas. Teoría del embudo de plegamiento y trampas energéticas El plegamiento no ocurre mediante una exploración al azar de todas las conformaciones posibles, sino a través de un paisaje energético continuo descrito por la teoría del embudo de plegamiento (folding funnel). La boca superior del embudo representa el estado desnaturalizado, donde existe una altísima entropía conformacional y un elevado nivel de energía libre.

Esquema del embudo energético mostrando intermediarios, trampas cinéticas y estado nativo. Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 13 A medida que la proteína avanza en sentido descendente por las paredes del embudo, el repertorio de conformaciones se estrecha. La compactación puede completarse en un único evento cooperativo rápido (característico de proteínas pequeñas y de un solo dominio, como la ribonucleasa) o a través de múltiples etapas sucesivas en cadenas de mayor tamaño o de organización multidominio (véase «Estructura de proteínas — Aminoácidos, enlace peptídico y niveles conformacionales»).

Diagrama tridimensional del paisaje conformacional y descenso energético del plegamiento proteico. Durante este descenso aparecen estados intermediarios metaestables. Si estos intermediarios presentan regiones hidrófobas expuestas transitoriamente a la solución acuosa, corren el riesgo de asociarse de forma no específica con otras cadenas celulares. Esto genera agregados amorfos insolubles o conduce a la molécula hacia trampas energéticas: mínimos locales de energía libre que bloquean a la proteína en una conformación plegada incorrectamente de la que no puede salir con facilidad.

COMPRUEBA 10 ¿Por qué los intermediarios de plegamiento son especialmente propensos a formar agregados insolubles dentro del medio celular? Chaperonas moleculares: función y clasificación Para evitar las asociaciones aberrantes en el abarrotado entorno intracelular, las células emplean chaperonas moleculares. Se trata de proteínas accesorias que interactúan transitoriamente con sustratos polipeptídicos mal plegados o en vías de síntesis, facilitando que adquieran su arquitectura tridimensional correcta o alcancen su destino celular sin integrarse en la estructura final de la proteína cliente.

Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 14 PARA RECORDARLO Las chaperonas no proporcionan información estructural nueva ni dictan cómo debe plegarse una proteína. Esa información reside exclusivamente en la secuencia primaria de aminoácidos. Su labor se limita a evitar vías no productivas de agregación. Muchas de estas familias se sobreexpresan de forma masiva frente a agresiones ambientales térmicas u oxidativas, por lo que se conocen formalmente como proteínas de choque térmico (HSP, heat-shock proteins). Se clasifican habitualmente según su peso molecular aparente en kilodaltons: Familia HSP Peso molecular Características funcionales destacadas Pequeñas HSP 10 kDa (ej.

HSP10) Cochaperonas estabilizadoras de pequeño tamaño que colaboran con complejos mayores. HSP40 ~40 kDa Regulan y estimulan la actividad ATPasa de socios moleculares como HSP70. HSP60 ~60 kDa Chaperoninas oligoméricas cilíndricas organizadas en cámaras aisladas de plegamiento. HSP70 ~70 kDa Monómeros que reconocen segmentos hidrófobos cortos en polipéptidos nacientes o desnaturalizados. HSP90 ~90 kDa Dímeros citosólicos involucrados en el mantenimiento y maduración de receptores y quinasas. HSP100 ~100 kDa Desagregan y remodelan agregados proteicos mediante translocación guiada por ATP.

Su función requiere el consumo continuado de energía química mediante la hidrólisis de adenosina trifosfato (ATP) (véase «Bioenergética — Principios termodinámicos y enlaces ricos en energía»). Están involucradas en una amplia diversidad de rutas esenciales para la homeostasis proteica o proteoma: plegamiento de novo durante la traducción en el ribosoma (véase «Flujo de información genética — Código genético, activación y traducción proteica»), renaturalización de proteínas sometidas a estrés ambiental, ensamblaje de complejos oligoméricos, tráfico o traslocación a través de membranas y asistencia en la degradación proteolítica selectiva.

ERROR FRECUENTE Pensar que las chaperonas catalizan el plegamiento aportando un molde externo o alterando la secuencia de la proteína sustrato. Las chaperonas no aportan información adicional: la conformación tridimensional final depende exclusivamente de la estructura primaria codificada en el polipéptido. COMPRUEBA 11 ¿En qué momento celular entra en juego la función protectora de HSP70 para prevenir la agregación?

Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 15 Chaperonas monoméricas frente a chaperoninas en caja Dentro del aparato celular de control conformacional coexisten dos grandes familias organizativas que cooperan de forma coordinada y secuencial: Chaperonas tradicionales (monoméricas o diméricas): formadas por una cadena polipeptídica individual que ejerce su acción sobre el sustrato en solución abierta. El ejemplo clave es HSP70 (cuyo homólogo bacteriano es DnaK) y su colaboradora HSP90. Estas interactúan con segmentos lineales hidrófobos conforme emergen de la maquinaria ribosomal.

Chaperoninas: grandes complejos oligoméricos que forman cajas o barriles cilíndricos en cuyo interior queda delimitada una cavidad hidrofílica protegida. El polipéptido entra aislado en dicha cavidad y se pliega sin riesgo de colisionar con otros componentes del citosol. A este grupo pertenecen GroEL- GroES en procariotas, HSP60 en orgánulos de origen endosimbiótico y el complejo TRiC en el citosol eucariota.

PROCESO Cooperación secuencial de chaperonas en la biosíntesis proteica Ambos sistemas operan frecuentemente en tándem: HSP70 estabiliza primero los polipéptidos nacientes o desplegados de manera temprana; posteriormente, aquellas moléculas que no alcanzan el estado nativo de forma autónoma son transferidas hacia las chaperoninas para someterse a rondas de replegamiento protegido dentro de su cavidad interna. Organización estructural y ciclo catalítico de GroEL-GroES Las chaperoninas oligoméricas (familia HSP60) presentan dos arquitecturas principales distribuidas evolutivamente entre dominios celulares: Grupo I: presentes en bacterias, mitocondrias y cloroplastos.

Su estructura consta de dos anillos apilados espalda contra espalda, integrados cada uno por 7 subunidades. Necesitan la unión coordinada de una cochaperona móvil con forma de tapa heptamérica, denominada GroES en procariotas (o HSP10 en eucariotas). Traducción ribosomal La cadena polipeptídica naciente emerge hacia el citoplasma celular. 1 Reconocimiento por HSP70 HSP70 se une a parches hidrófobos expuestos y previene agregaciones tempranas. 2 Transferencia a chaperonina Los polipéptidos no plegados pasan a la cavidad interna de GroEL/HSP60. 3 Encapsulamiento y plegamiento El sellado con GroES y el consumo de ATP facilitan el plegado en aislamiento.

4 Liberación nativa Se expulsa la proteína funcionalmente activa con su conformación final establecida. 5 Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 16 Grupo II: presentes en el citosol eucariota (complejo TRiC/CCT) y en arqueobacterias. Están formadas por anillos de 8 a 9 subunidades que pueden ser homoméricas o heteroméricas. No emplean una cochaperona separable, sino que poseen protuberancias integradas («asas» o segmentos apicales propios) que cierran la cavidad a modo de compuerta intrínseca. El ciclo funcional de las chaperoninas del Grupo I ha sido descrito detalladamente en el complejo bacteriano GroEL-GroES: Esquema del ciclo catalítico dependiente de ATP en GroEL-GroES.

COMPRUEBA 12 ¿Qué diferencia estructural básica distingue el mecanismo de cierre de una chaperonina del Grupo I frente a una del Grupo II? Captura del sustrato mal plegado: un anillo de GroEL en conformación abierta expone residuos hidrófobos en su abertura apical, reclutando el polipéptido desplegado o atrapado cinéticamente. 1 Entrada de nucleótido y sellado de la cavidad: la unión cooperativa de ATP induce un cambio conformacional que promueve la asociación del domo cochaperona GroES. Esto encapsula a la proteína en una microcámara cerrada donde las paredes cambian de hidrófobas a marcadamente hidrofílicas.

2 Fase lenta de plegamiento protegido: la proteína se repliega en aislamiento molecular durante el tiempo que dura la hidrólisis del ATP retenido en el anillo. Al no haber contacto con otros polipéptidos, desaparece por completo la vía de agregación inespecífica. 3 Descarga alostérica del sustrato: la unión simultánea de nuevo ATP en el anillo trans opuesto induce la liberación de ADP, de fosfato inorgánico ( ) y de la tapa GroES. La proteína se vierte de nuevo a la disolución celular; si aún conserva regiones hidrófobas desestructuradas, vuelve a entrar en un nuevo ciclo sobre la misma u otra chaperonina.

4 P i Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 17 IDEAS CLAVE La conformación nativa es el estado biológicamente activo de una proteína y representa el mínimo absoluto de energía libre y una baja entropía conformacional. El colapso hidrofóbico es el principal motor del plegamiento, al agrupar los residuos apolares en el núcleo para maximizar la entropía del agua circundante. La teoría del embudo visualiza el proceso como un descenso energético punteado por intermediarios metaestables y trampas cinéticas de plegamiento incorrecto.

Las chaperonas moleculares asisten el plegamiento consumiendo ATP y previenen la formación de agregados, sin alterar la información contenida en la secuencia primaria. HSP70 actúa de forma temprana sobre cadenas nacientes en solución, mientras que las chaperoninas tipo GroEL-GroES aíslan el polipéptido dentro de cámaras protegidas. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 13. ¿Qué consecuencia entrópica tiene sobre la cadena polipeptídica la transición desde el estado desnaturalizado al nativo? 14. ¿Por qué se clasifica a DnaK y GroEL dentro de familias diferentes de proteínas de choque térmico? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 15.

¿Qué aminoácido estándar carece de centro estereogénico y no posee actividad óptica? 16. ¿Cuál es la causa directa de la rigidez y coplanaridad del enlace peptídico? 17. ¿Cuántos residuos de aminoácidos contiene una vuelta completa de hélice alfa? 18. ¿Qué enzima específica permite liberar proteínas ancladas a la membrana plasmática mediante GPI?

Serina a) Prolina b) Alanina c) Glicina d) Su impedimento estérico extremo a) La formación de enlaces disulfuro b) El carácter parcial de doble enlace c) Los enlaces de hidrógeno intercatenarios d) 3,6 residuos a) 5,4 residuos b) 4,2 residuos c) 3,0 residuos d) Fosfolipasa C a) Quimotripsina b) ATP sintasa c) Peptidil transferasa d) Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 18 19. ¿Cuál es la principal fuerza que impulsa el colapso inicial de la cadena polipeptídica hacia su forma globular? 20. ¿Qué función realizan las chaperonas moleculares durante la síntesis y maduración de proteínas? 21.

¿Cuántas subunidades por anillo componen típicamente las chaperoninas del Grupo I como GroEL? 22. ¿En qué compartimento u organismo celular se localiza de forma característica el complejo TRiC/CCT?

Fuerzas electrostáticas iónicas a) Puentes de hidrógeno peptídicos b) Puentes disulfuro covalentes c) Fuerza hidrofóbica d) Aportan información estructural extra a) Sustituyen enlaces amida rotos b) Modifican los codones traduccionales c) Previenen la agregación inespecífica d) 5 subunidades a) 7 subunidades b) 4 subunidades c) 9 subunidades d) Citosol eucariota a) Matriz mitocondrial b) Lumen de cloroplastos c) Citoplasma de procariotas d) Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 19 3 Catálisis, centro activo y mecanismos catalíticos AL ACABAR SABRÁS Diferenciar los componentes de una holoenzima y los tipos de cofactores.

Explicar la complementariedad con el estado de transición y la energía de fijación. Describir paso a paso el mecanismo catalítico de la tríada Ser-His-Asp. Convertir valores de actividad catalítica entre Katal y Unidades Internacionales. PIÉNSALO ANTES DE LEER 23 ¿Por qué una enzima cuyo centro activo encaje con precisión milimétrica sobre su sustrato basal sería un catalizador pésimo? Los seres vivos dependen de transformaciones químicas que deben suceder con extraordinaria rapidez y bajo condiciones sumamente suaves de temperatura, presión y pH neutro. Los agentes encargados de hacer viables estas reacciones son los catalizadores biológicos.

ESQUEMA Organización del bloque temático de Enzimología Enzimología 3 Catálisis, centro activo y mecanismos catalíticos 4 Cinética de Michaelis-Menten, linearización e inhibición 5 Regulación enzimática y complejos multienzimáticos Catálisis y mecanismos Bases fisicoquímicas, centro activo y tríada Cinética e inhibición Michaelis-Menten, linearización y tipos inhibidores Regulación enzimática Alosterismo, cooperatividad y complejos multienzimáticos Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 20 1. Biocatalizadores y componentes moleculares Un catalizador químico incrementa la velocidad de una reacción sin consumirse durante el proceso ni alterar su equilibrio químico.

Los biocatalizadores son catalizadores biológicos que aceleran las reacciones a velocidades compatibles con la vida celular. La inmensa mayoría de ellos son proteínas globulares, aunque también existen moléculas de ARN con capacidad catalítica denominadas ribozimas (polímeros de ribonucleótidos capaces de autorrecorte o catálisis). Asimismo, existen las abzimas, que son anticuerpos generados experimentalmente frente a análogos del estado de transición dotados de actividad catalítica.

Frente a los catalizadores inorgánicos, las enzimas ofrecen notables ventajas adaptativas: Gran poder catalítico, elevando la velocidad varios órdenes de magnitud a concentraciones enzimáticas extraordinariamente bajas. Alta especificidad de acción y de sustrato, impidiendo la formación de subproductos indeseados. Actividad en condiciones celulares fisiológicas (entorno acuoso, temperatura cercana a 37 °C y pH habitualmente neutro). Posibilidad de compartimentación (como las hidrolasas ácidas retenidas en los lisosomas).

Regulación fina de su síntesis y de su actividad catalítica tanto a largo plazo (control génico inducido o constitutivo) como a corto plazo (modificaciones covalentes o alosterismo). Muchas enzimas requieren componentes no proteicos para ser funcionales. La fracción estrictamente proteica e inactiva se denomina apoenzima, mientras que el complejo activo completo junto con su cofactor constituye la holoenzima. DEFINICIÓN Holoenzima: forma catalíticamente activa de la enzima constituida por la unión de la parte polipeptídica (apoenzima) y las moléculas auxiliares no proteicas (cofactores).

Tipo de componente Naturaleza química Fijación a la apoenzima Comportamiento en la reacción Cofactor inorgánico Iones metálicos ( , , , , ) Coordinación variable Estabilizan cargas o participan en transferencias electrónicas. Cosustrato (coenzima) Orgánica (comúnmente derivada de vitaminas) Débil y reversible Se une y se libera alterado, requiriendo otra enzima para recuperar su forma inicial (ej. ). Grupo prostético Orgánica o metálica (frecuente origen vitamínico) Fuerte o covalente Permanece integrado en la estructura proteica y se regenera en el propio ciclo catalítico. COMPRUEBA 24 ¿Cuál es la diferencia de asociación y regeneración entre un cosustrato y un grupo prostético?

Mg2+ Zn2+ Mn2+ Ni2+ K+ NAD+ Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 21 2. Clasificación funcional internacional (código EC) La Comisión de Enzimas (EC) asigna a cada biocatalizador un código de cuatro dígitos separados por puntos. El primer dígito determina la clase general de reacción catalizada: 1. Oxidorreductasas (EC 1): catalizan transferencias de electrones o átomos de hidrógeno (reacciones redox). 2. Transferasas (EC 2): trasladan grupos funcionales entre una molécula dadora y otra aceptora. 3. Hidrolasas (EC 3): rompen enlaces químicos ( , , etc.) mediante la incorporación de una molécula de agua. 4.

Liasas (EC 4): catalizan la rotura de enlaces sin intervención de agua ni oxidación, generando dobles enlaces o anillos, o bien la adición de grupos a dobles enlaces. 5. Isomerasas (EC 5): efectúan reorganizaciones intramoleculares para transformar un isómero en otro. 6. Ligasas (EC 6): unen dos moléculas mediante condensación acoplada al consumo de enlaces ricos en energía (ATP u otros nucleósidos trifosfato). Esquema de la reacción de hidrólisis peptídica catalizada por tripsina.

Un caso ilustrativo es la tripsina (EC 3.4.21.4): pertenece a las hidrolasas (3), actúa sobre enlaces peptídicos (4), emplea un residuo de serina catalítica (21) y muestra preferencia por escindir tras aminoácidos cargados positivamente como lisina o arginina (4). 3. Anatomía y microentorno del centro activo El centro activo es una hendidura tridimensional delimitada que ocupa una fracción reducida del volumen total de la enzima globular. Está compuesto por aminoácidos que proceden de puntos distantes en la secuencia primaria pero que confluyen espacialmente gracias al plegamiento conformacional.

En su estructura interna se diferencian dos zonas funcionales complementarias: Sitio de unión al sustrato: contiene residuos encargados de seleccionar, orientar y fijar la molécula reactiva mediante enlaces débiles (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones electrostáticas impulsadas por el efecto hidrofóbico). Sitio catalítico: aloja las cadenas laterales directamente implicadas en la ruptura y formación de nuevos enlaces. Según su función en la arquitectura global, los aminoácidos de una enzima se agrupan en: C O C N Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 22 1.

Residuos catalíticos: participan activamente en el mecanismo químico dentro del centro activo. 2. Residuos de unión: retienen el sustrato mediante interacciones no covalentes específicas. 3. Residuos conformacionales: sostienen el armazón tridimensional exterior garantizando la orientación nativa del bolsillo catalítico. 4. Residuos no esenciales: localizados en la superficie exterior sin función mecánica o catalítica directa perceptible. El centro activo constituye un microentorno hidrófobo exclusivo donde el agua queda expulsada.

La exclusión del disolvente incrementa la reactividad de los grupos funcionales y refuerza las interacciones electrostáticas que en medio acuoso quedarían apantalladas. COMPRUEBA 25 ¿Por qué la presencia de agua debilitaría la reactividad dentro del centro activo? 4. Barrera de activación y energía de fijación Para que ocurra una reacción química, las moléculas deben superar una barrera energética denominada energía de activación ( ). Esta magnitud representa la diferencia de energía libre entre el reactivo y el estado de transición, una configuración molecular transitoria e inestable caracterizada por enlaces distorsionados o repulsiones electrónicas.

Gráfica del perfil energético y deformación del sustrato hacia el estado de transición. La constante de velocidad ( ) se relaciona de manera exponencial e inversa con la energía de activación a través de la ecuación de Eyring: ΔG= k Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 23 La enzima acelera el proceso abatiendo ; no altera la constante de equilibrio de la reacción ( ) ni la variación global de energía libre estándar ( ), sino que permite que el equilibrio se alcance antes. El descenso de procede del balance entálpico y entrópico: Entalpía de activación ( ): refleja las distorsiones electrónicas y la deformación de enlaces requeridas para alcanzar el estado de transición.

La enzima proporciona interacciones compensatorias. Entropía de activación ( ): en solución, dos moléculas libres poseen múltiples grados de libertad traslacionales y rotacionales. El centro activo aproxima y alinea los reactivos, reduciendo drásticamente la pérdida de entropía durante el choque eficaz. Desolvatación: el reemplazo de la cubierta de agua por enlaces débiles enzima-sustrato neutraliza el coste de eliminar la capa de solvatación estabilizante. El motor catalítico principal reside en la energía de fijación ( ), que es la pequeña liberación de energía libre derivada de la formación de múltiples enlaces débiles entre la enzima y el sustrato.

ERROR FRECUENTE Asumir que el centro activo es perfectamente complementario al sustrato en su estado basal (modelo de llave y cerradura rígido). Si la enzima se adaptara a la perfección al reactivo inicial, formaría un complejo enzima-sustrato (ES) hiperestable en un pozo termodinámico profundo, lo que aumentaría la energía necesaria para alcanzar el estado de transición e impediría la reacción. El centro activo es complementario al estado de transición mediante un mecanismo de ajuste inducido. 5.

Estrategias catalíticas fundamentales Las enzimas combinan diversas tácticas fisicoquímicas para facilitar la ruptura y síntesis de enlaces: Catálisis ácido-base Consiste en la transferencia concertada de protones hacia o desde el sustrato mediada por aminoácidos ionizables del centro activo para estabilizar intermediarios reactivos inestables.

Un ejemplo característico ocurre en la lactato deshidrogenasa: un residuo de histidina (His-195) actúa como catalizador básico extrayendo un protón del hidroxilo del lactato, lo que favorece su oxidación a piruvato simultáneamente a la cesión de electrones e hidruro al cosustrato (que se reduce a ), mientras residuos como Arg-171 y Arg-109 posicionan y estabilizan la carga negativa. Catálisis covalente y la tríada catalítica de las serín-proteasas En este mecanismo se establece un enlace covalente transitorio entre el sustrato y un residuo nucleofílico de la enzima, generando una ruta de reacción bifurcada con menor energía de activación global.

El paradigma por excelencia lo constituyen las serín-proteasas como la quimotripsina y la tripsina, cuyo núcleo funcional es la tríada catalítica formada por aspartato, histidina y serina (Asp-102, His-57 y Ser- 195 en quimotripsina). k = e h k T B RT ΔG= ΔG= K ΔG = RT ln K ΔG= ΔH= ΔS= ΔG B NAD+ NADH + H+ Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 24 Diagrama del ciclo catalítico completo de la serín-proteasa quimotripsina.

El ciclo catalítico de la tríada transcurre en dos fases secuenciales (acilación y desacilación): PROCESO Mecanismo catalítico de la tríada Ser-His-Asp La especificidad entre miembros de esta familia reside en la cavidad de reconocimiento adyacente: la quimotripsina posee un bolsillo hidrófobo ancho para ubicar cadenas aromáticas, mientras que la tripsina presenta un residuo de Asp-189 cargado negativamente al fondo del bolsillo para coordinar residuos Fijación y ataque nucleofílico His retira el protón de Ser; Ser ataca el carbonilo 1 Primer intermedio tetraédrico Carga negativa transitoria estabilizada en el oxianión 2 Rotura peptídica y acil-enzima His cede protón al grupo saliente y se libera péptido 1 3 Ataque del agua activada His polariza una molécula de agua que ataca el éster 4 Segundo intermedio y liberación Colapso tetraédrico, salida de péptido 2 y regeneración 5 Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 25 básicos (lisina o arginina).

Catálisis por iones metálicos Aproximadamente un tercio de las enzimas conocidas requieren metales (metaloenzimas). Los cationes metálicos (como , , ) orientan el sustrato en el bolsillo, apantallan cargas electrostáticas negativas, facilitan la desprotonación de moléculas para generar nucleófilos fuertes o intervienen en transferencias electrónicas cuando no participan coenzimas redox. Un ejemplo clásico es la enolasa (EC 4.2.1.11, liasa), que requiere iones para estabilizar el intermediario enolato durante la deshidratación reversible del 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato. COMPRUEBA 26 ¿Qué papel ejerce el residuo de histidina dentro de la tríada catalítica en cada fase del ciclo? 6.

Cuantificación de la actividad enzimática La evaluación experimental de una enzima se fundamenta en su capacidad para transformar reactivo en producto en un intervalo de tiempo determinado bajo condiciones estándar controladas (temperatura óptima habitualmente de 25 °C o 37 °C, pH óptimo y sustrato a concentración saturante). Katal (kat): unidad del Sistema Internacional definida canónicamente como la cantidad de enzima necesaria para transformar 1 mol de sustrato por segundo ( ). Unidad Internacional (UI): cantidad de enzima que cataliza la transformación de . PARA RECORDARLO La conversión exacta entre ambas unidades es . Para deducirlo, considera que y : .

Para determinar el grado de aislamiento de un preparado biológico se recurre a la actividad específica (AE): La actividad específica aumenta progresivamente a medida que se purifica una muestra, ya que se eliminan proteínas contaminantes inactivas. Finalmente, la actividad molecular o número de recambio ( ) cuantifica el número de moléculas de sustrato transformadas por cada centro activo o molécula de enzima individual por unidad de tiempo cuando el biocatalizador se encuentra totalmente saturado de reactivo.

Mg2+ Zn2+ Mn2+ Mg2+ 1 kat = 1 mol/s 1 μmol de sustrato por minuto 1 kat = 6 × 10 UI 7 1 mol = 10 μmol 6 1 minuto = 60 segundos 1 mol/s = (10 × 6 60) μmol/min = 6 × 10 UI 7 AE = (expresada en kat/g o UI/mg) Masa total de prote na ı ˊ Actividad enzim tica a ˊ k cat Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 26 IDEAS CLAVE Las enzimas aceleran las reacciones disminuyendo la energía de activación ( ) sin alterar el equilibrio termodinámico ni la variación global de energía libre ( ). El centro activo no es complementario al sustrato en reposo sino al estado de transición, compensando energéticamente las tensiones moleculares mediante la energía de fijación.

La holoenzima activa surge de la asociación entre la apoenzima polipeptídica y sus cofactores inorgánicos o coenzimas orgánicas. La tríada catalítica Ser-His-Asp de las serín-proteasas utiliza catálisis ácido-base general y catálisis covalente mediante un intermediario acil-enzima y agujero de oxianión. El Katal es la unidad del SI equivalente a la transformación de 1 mol de reactivo por segundo ( ). COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 27. ¿Por qué un ajuste molecular perfecto entre la enzima y el sustrato basal frenaría la catálisis en lugar de favorecerla? 28. ¿Qué distingue operativamente a una coenzima cosustrato de un grupo prostético? 29.

¿Cómo se relacionan numéricamente la Unidad Internacional (UI) y el Katal (kat)? ENZIMOLOGÍA 4 Cinética de Michaelis-Menten, linearización e inhibición AL ACABAR SABRÁS Deducir analíticamente la ecuación hiperbólica de Michaelis-Menten a partir del estado estacionario de Briggs-Haldane. Calcular e interpretar gráficamente los parámetros Km, Vmax y kcat/Km mediante las transformaciones de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee. Diferenciar los mecanismos y efectos cinéticos de la inhibición competitiva, acompetitiva, no competitiva e irreversible suicida. Distinguir cinéticamente entre reacciones bisustrato secuenciales y de tipo ping-pong.

PIÉNSALO ANTES DE LEER 30 ¿Por qué aumentar indefinidamente la concentración de sustrato no acelera la reacción enzimática de forma ilimitada? Principios de cinética química y velocidad inicial La cinética química analiza la velocidad a la que transcurren las transformaciones moleculares. En los sistemas biológicos, la velocidad de una reacción depende de la concentración de reactivos y del mecanismo catalítico involucrado. El orden de reacción describe esta dependencia matemática: ΔG= ΔG 1 kat = 6 × 10 UI 7 Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 27 Reacciones de orden cero: la velocidad es constante e independiente de la concentración de sustrato ( ).

Ocurre cuando la enzima se encuentra completamente saturada de sustrato. Reacciones de primer orden: la velocidad resulta directamente proporcional a la concentración de un único reactivo ( ). La constante de velocidad se expresa en unidades de . Reacciones de segundo orden: la velocidad depende del choque entre dos reactivos distintos ( ). Sus constantes se expresan en . Reacciones de pseudo-primer orden: cuando uno de los dos reactivos está en un exceso muy elevado respecto al otro, su concentración apenas cambia. La reacción se comporta formalmente como si fuera de primer orden respecto al reactivo limitante.

En enzimología se evalúa la velocidad inicial ( ), que corresponde a la cantidad de moles de producto generados por unidad de tiempo en los primeros instantes del ensayo, cuando apenas se ha consumido sustrato. En este breve intervalo lineal, la concentración de sustrato se considera inalterada y la reacción inversa ( ) resulta despreciable. COMPRUEBA 31 ¿Por qué se mide la velocidad inicial (V ) en lugar de la velocidad a tiempos prolongados? Modelo cinético de Michaelis-Menten y aproximación de Briggs-Haldane El estudio formal de la catálisis comenzó con Víctor Henri, quien propuso la formación obligada de un complejo intermediario enzima-sustrato ( ) antes de originar los productos.

Leonor Michaelis y Maud Menten consolidaron este modelo empleando disoluciones tamponadas para controlar el pH y formalizando la medición de la velocidad inicial. George Briggs y John Haldane refinaron el tratamiento introduciendo la aproximación del estado estacionario. El esquema elemental de reacción comprende: Bajo las condiciones iniciales, la velocidad de formación de producto viene determinada por el paso lento o limitante: . Briggs y Haldane postularon que, tras un periodo pre-estacionario fugaz, la concentración del complejo intermedio alcanza una meseta estacionaria ( ).

En este régimen, la tasa a la que se forma compensa con exactitud su velocidad de descomposición: Considerando que la concentración enzimática total es y que el sustrato se halla en gran exceso ( ), la sustitución y el despeje algebraico conducen a la ecuación de Michaelis- Menten: V = k V = k[S] k s 1 V = k[S][A] M 1 s 1 V 0 P S ES E + S ES k 1 k 1 k 2 E + P V = 0 k [ES] 2 d[ES]/dt = 0 ES Velocidad de formaci n = o ˊ k [E][S] 1 Velocidad de descomposici n = o ˊ (k + 1 k )[ES] 2 [E] = T [E] + [ES] [S] [E] T V = 0 K + [S] m V [S] max Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 28 Gráfica de saturación de Michaelis-Menten mostrando Km a semimáxima velocidad.

La representación gráfica de frente a traza una curva hiperbólica rectangular. A concentraciones reducidas de sustrato ( ), la ecuación se simplifica a , manifestando una cinética de primer orden. En contraposición, cuando el sustrato abunda en extremo ( ), el denominador se aproxima a y la velocidad se independiza de este ( ), entrando en una cinética de orden cero donde los centros activos se encuentran saturados.

Parámetros cinéticos fundamentales: Km, Vmax, kcat y eficiencia catalítica La constante de Michaelis-Menten ( ) se define operativamente a partir de las constantes elementales: Posee unidades de concentración molar y es característica de cada enzima frente a un sustrato determinado, resultando independiente de la cantidad de enzima presente. Si sustituimos en la ecuación de velocidad, comprobamos que . Por tanto, Km representa la concentración de sustrato a la cual la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima, reflejando la ocupación del 50 % de los centros catalíticos.

Cuando el paso químico limitante es muy lento en comparación con la disociación ( ), se aproxima al cociente , que corresponde a la constante de disociación o . En ese supuesto, un valor bajo de indica una alta afinidad de la enzima por su sustrato. Sin embargo, si es comparable o superior a , deja de ser una medida directa de afinidad en sentido termodinámico estricto. La velocidad máxima ( ) describe el límite cinético asintótico cuando todos los centros activos están ocupados por el sustrato. A diferencia de , la depende linealmente de la concentración total de enzima utilizada en el ensayo: al duplicar se duplica la observada.

La constante catalítica ( ), o número de recambio (turnover number), mide el número de moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo en cada molécula de enzima (o centro activo) cuando el sistema trabaja a saturación completa: V 0 [S] [S] K m V 0 [S] K m V max [S] K m [S] V 0 V max K m K = m k 1 k + k 1 2 [S] = K m V = 0 = 2K m V K max m 2 V max k 2 k 1 K m k /k 1 1 K d Ks K m k 2 k 1 K m V max K m V max [E] T V max k cat k = cat [E] T V max Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 29 Sus dimensiones son de tiempo inverso ( ).

Cuando la concentración de sustrato en el medio fisiológico es baja ( ), la ecuación de velocidad se expresa como: Por este motivo, el cociente kcat/Km representa la constante de velocidad de segundo orden que mide la eficiencia catalítica de una enzima en condiciones sub-saturantes. Este cociente tiene un techo biológico fijado por la velocidad de difusión de las moléculas en disolución acuosa, situado entre y . Las enzimas cuyos valores se aproximan a este rango alcanzan la denominada perfección catalítica. Un ejemplo sobresaliente es la catalasa, que exhibe un de y un de 40 millones de moléculas por segundo al convertir peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

COMPRUEBA 32 ¿Por qué el cociente kcat/Km evalúa la eficiencia catalítica mejor que el valor aislado de kcat? Linearización de datos cinéticos La curva hiperbólica directa dificulta estimar de manera exacta las asíntotas de y los valores de en el laboratorio sin ajustes por ordenador. Por ello, se recurre a transformaciones algebraicas lineales. Representación de Lineweaver-Burk (doble recíproca) Tomando los inversos en ambos miembros de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene la recta de Lineweaver-Burk: Linearización de Lineweaver-Burk con indicación de cortes y pendiente.

Al representar (eje de ordenadas, ) frente a (eje de abscisas, ), los parámetros se deducen directamente de las propiedades geométricas de la recta: Pendiente: . Ordenada en el origen ( ): . Abscisa en el origen ( ): .

s 1 [S] K m V = 0 [E] [S] K m k cat T 108 10 M 9 1 s 1 k /K cat m 4 × 10 M 7 1 s 1 k cat V max K m = V 0 1 V max K m + [S] 1 V max 1 1/V 0 y 1/[S] x m = V max K m x = 0 V max 1 y = 0 K m 1 Apuntes de Bioquímica: Proteínas, Enzimas y Metabolismo 30 Representación de Eadie-Hofstee Multiplicando la ecuación linealizada por y reordenando términos se formula la ecuación de Eadie- Hofstee: Al graficar frente al cociente , la recta presenta una pendiente negativa igual a , un corte con el eje vertical en y una intersección horizontal en . ERROR FRECUENTE Confundir las constantes de inhibición y conduce a clasificar erróneamente el tipo de inhibidor.

Ki mide la constante de disociación del inhibidor por la enzima libre (E + I EI), mientras que Ki' cuantifica la disociación respecto al complejo enzima-sustrato (ES + I ESI). Un valor de más bajo no significa menor unión, sino mayor afinidad inhibitoria. Inhibición reversible: patrones cinéticos y gráficos Los inhibidores reversibles se asocian a la enzima mediante interacciones no covalentes y pueden retirarse por diálisis o dilución. Se clasifican según reconozcan a la enzima libre ( ), al complejo enzima- sustrato ( ) o a ambos. Para modelizar su efecto se emplean los factores de escala y , donde y .

Patrones comparativos en representaciones de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee para distintas inhibiciones. V max V = 0 K + m (…