Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives

I 0 flashcards i 4 preguntes més al document.

Text del document

APUNTS BIOLOGIA II Grau en Biologia Universitat de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apunts de cromatografia per a Biologia II: cromatografia plana (Rf), de gasos (GC-MS), líquida preparativa (exclusió, intercanvi iònic, afinitat) i HPLC.

APREN.AI Índex 1 Fonaments de la cromatografia i cromatografia plana Principis generals i coeficient de repartiment Cromatografia plana: paper i capa fina (TLC) 2 Cromatografia de gasos (GC i GC-MS) Arquitectura instrumental del cromatògraf de gasos Mecanisme de retenció i cromatograma Limitacions i acoblament GC-MS 3 Cromatografia líquida preparativa: exclusió molecular, intercanvi iònic i afinitat Cromatografia d'exclusió molecular (filtració en gel) Cromatografia d'intercanvi iònic Cromatografia d'afinitat 4 Cromatografia líquida d'alta eficàcia (HPLC) Configuració del sistema instrumental d'HPLC Rendiment analític i aplicacions biomèdiques 5 Resum per repassar Fonaments i cromatografia plana Cromatografia de gasos (GC i GC-MS) Cromatografia líquida preparativa (LC) Cromatografia líquida d'alta eficàcia (HPLC) Solucions de les preguntes de repàs Aquests apunts poden contenir errors o omissions.

Són un material de suport i no substitueixen el temari oficial ni el professorat: contrasta la informació important. Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 1 1 Fonaments de la cromatografia i cromatografia plana EN ACABAR SABRÀS Definir el concepte de coeficient de repartiment i els components essencials d'un sistema cromatogràfic. Calcular i interpretar el factor d'alliberament (Rf) en cromatografia en paper i capa fina. Distingir les característiques operatives de les tècniques analítiques i preparatives. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 1 Com és possible separar components d'una mescla simplement deixant que un líquid s'enfili per una tira de cel·lulosa?

La cromatografia aplega un conjunt de procediments analítics orientats fonamentalment a la separació qualitativa de compostos. Aquestes eines poden funcionar de manera semiquantitativa o transformar-se en mètodes quantitatius quan s'acoblen a detectors com espectrofotòmetres, fluorímetres o espectròmetres de masses. A més de la seva vessant analítica, constitueixen el grup principal de tècniques preparatives, orientades a recuperar quantitats rellevants d'una substància en estat purificat.

Principis generals i coeficient de repartiment Totes les modalitats cromatogràfiques comparteixen el mateix mecanisme de resolució basat en el coeficient de repartiment de les molècules presents en una mostra. Per fer possible aquesta separació físico-química, el sistema requereix obligatòriament la interacció de dos components essencials: Fase estacionària: suport físic fix sobre el qual es diposita inicialment la mescla que hom vol analitzar. Fase mòbil: fluid que es desplaça al llarg de la fase estacionària arrossegant les molècules de la mostra.

Quan la fase mòbil comença el seu recorregut, cada component químic es distribueix dinàmicament entre ambdues fases segons la seva afinitat diferencial. Si una molècula manifesta una interacció forta amb la fase estacionària, avança lentament; per contra, si presenta més afinitat per la fase mòbil, és transportada amb major celeritat. Aquesta diferència en les velocitats de migració fa possible la separació espacial dels analits al llarg del suport. Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 2 PROCÉS Separació per cromatografia plana 1 Aplicació a l'origen Dipòsit de la mostra líquida a la base del suport hidròfil sec.

2 Ascens per capil·laritat La fase mòbil orgànica ascendeix pel suport absorbent. 3 Repartiment diferencial Les molècules apolars avancen amb el solvent; les polars queden retingudes. 4 Lectura del front Aturada del procés i mesura de distàncies per calcular el Rf. COMPROVA-HO 2 Quina és la funció clau de la fase mòbil en una separació cromatogràfica? Cromatografia plana: paper i capa fina (TLC) La cromatografia plana és la metodologia històricament inaugural que va donar nom a la disciplina a partir de la separació de pigments vegetals sobre tires de paper («escriptura en colors»).

En aquesta modalitat, la fase estacionària consisteix en una superfície plana de caràcter hidròfil que absorbeix humitat de l'ambient, de manera que l'aigua retinguda actua com a entorn altament polar. Per contra, la fase mòbil sol estar formada per una barreja orgànica apolar (per exemple, combinacions com 20% etanol i 80% hexà) que ascendeix per capil·laritat des de la base de la cubeta. Esquema d'una cambra de cromatografia plana amb paper vertical immers.

Quan el front del solvent assoleix la posició on s'han dipositat les gotes inicials de mostra (origen), les molècules es reparteixen segons la seva polaritat: Les molècules de caràcter polar interaccionen intensament amb l'aigua de la fase estacionària i queden retingudes a prop de l'origen. Les molècules apolars mostren més solubilitat en la fase mòbil orgànica i assoleixen distàncies de migració superiors. Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 3 Diagrama del càlcul del factor d'alliberament sobre una placa cromatogràfica.

L'avaluació quantitativa d'aquest desplaçament es realitza calculant el factor d'alliberament ( ), que tradueix de manera pràctica el coeficient de repartiment per a unes condicions de solvent determinades: On indica la distància coberta per la molècula des de la línia de càrrega i correspon a la distància total recorreguda pel front del solvent. Modalitat plana Fase estacionària Característiques i resolució Cromatografia en paper Tira de cel·lulosa absorbent que reté aigua ambiental. Mètode ràpid, econòmic i d'utilitat bàsica; resolució senzilla. Cromatografia en capa fina (TLC) Gel higroscòpic (sílice o midó) estès sobre suport rígid (vidre o plàstic).

Major poder de resolució; permet anàlisis amb valor semiquantitatiu. ERROR FREQÜENT Confondre el càlcul del factor d'alliberament invertint els termes del quocient. Recorda que la distància recorreguda pel solut ( ) mai pot superar la distància del front de la fase mòbil ( ); per tant, el valor de sempre oscil·la entre 0 i 1. COMPROVA-HO 3 En una TLC estàndard amb fase estacionària polar i fase mòbil apolar, quina substància tindrà un Rf més proper a 1? R f R = f d f dm d m d f d m d f R f Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 4 IDEES CLAU El coeficient de repartiment entre la fase estacionària i la fase mòbil regeix la velocitat de migració de cada molècula.

La cromatografia té utilitat analítica (identificació i quantificació) i preparativa (purificació de biomolècules). En la cromatografia plana clàssica, la fase estacionària hidròfila reté aigua (polar) i la fase mòbil és un solvent orgànic apolar. El factor d'alliberament es defineix estrictament com la fracció . COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 4. Per què la fase mòbil en cromatografia plana sobre paper no ha de ser una fase exclusivament aquosa? 5. Com influeix la polaritat d'una molècula en el seu valor de en una capa fina sobre gel de sílice? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 6. Quin paràmetre determina fonamentalment la separació cromatogràfica de dos soluts? 7.

Quina funció compleix la cel·lulosa a la cromatografia en paper? 8. Què representa la distància en la fórmula del Rf? 9. Respecte al paper, quina millora aporta la cromatografia TLC de capa fina?

R = f d /d m f R f La pressió atmosfèrica estàndard a) El pes del paper b) El coeficient de repartiment c) La temperatura ambiental externa d) Reaccionar químicament amb el solut a) Retenir aigua com a fase polar b) Empènyer activament el solvent apolar c) Destruir els pigments biològics d) d f L'amplada total de la placa a) El diàmetre de la cubeta b) L'avanç del front mòbil c) El recorregut de la mostra d) Impedeix l'ús de solvents orgànics a) Millora resolució i valor semiquantitatiu b) Només permet mostres completament gasoses c) Evita l'ús de fase estacionària d) Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 5 2 Cromatografia de gasos (GC i GC-MS) EN ACABAR SABRÀS Identificar les parts estructurals d'un equip de cromatografia de gasos i les seves funcions.

Analitzar la relació entre el temps de retenció i la naturalesa química de la fase estacionària. Comprendre el caràcter analític i destructiu de la GC davant les tècniques preparatives. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 10 Per què una mostra no es pot recuperar després de passar per un cromatògraf de gasos acoblat a espectrometria de masses? La cromatografia de gasos (GC) comparteix el principi fonamental de la partició entre fases, però presenta diferències estructurals i operatives profundes respecte a les variants planes. Constitueix una metodologia exclusivament analítica i d'elevadíssima precisió, en la qual la mostra s'ha de volatilitzar completament abans de penetrar en el circuit de separació.

Arquitectura instrumental del cromatògraf de gasos El dispositiu de GC requereix un control precís de pressions, fluxos i temperatures mitjançant mòduls especialitzats connectats en sèrie: Esquema dels components principals d'un cromatògraf de gasos amb forn i detector. Dipòsits de gas: bombones d'alimentació que inclouen el gas portador o acarreador (un gas inert que fa de fase mòbil) juntament amb gasos auxiliars de combustió per al detector si s'escau (aire i hidrogen). Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 6 Línies de purificació i control: vàlvules reguladores, trampes d'adsorció molecular (mol-sieve) i un controlador de flux per mantenir la fase mòbil estable.

Port d'injecció: zona calefactada on s'introdueix la mostra líquida mitjançant xeringa perquè s'evapori immediatament. Forn termostatitzat i columna: cambra amb regulació tèrmica estricta que allotja la columna cromatogràfica. Aquesta pot amidar diversos metres de longitud, per la qual cosa es disposa enrotllada en espiral per estalviar espai. Detector i integrador: aparells encarregats de mesurar les pertorbacions físico-químiques que produeix cada substància en sortir del circuit i registrar-ne el gràfic pertinent. PROCÉS Recorregut de la mostra en GC-MS 1 Injecció i volatilització Evaporació tèrmica immediata de la mostra líquida al port d'entrada.

2 Arrossegament amb gas inert El gas acarreador impulsa els vapors cap a la columna enrotllada. 3 Retenció diferencial Interacció entre els analits i la fase estacionària dins del forn. 4 Espectrometria de masses Detecció, quantificació i determinació estructural a la sortida. COMPROVA-HO 11 Quina funció específica té el gas inert a la cromatografia GC? Mecanisme de retenció i cromatograma A diferència de la cromatografia plana, on la fase mòbil exercia una forta competència química, a la cromatografia de gasos la fase mòbil és neutra.

La resolució recau exclusivament en la capacitat de les molècules de la mostra per interaccionar amb la resina empaquetada a la columna (la fase estacionària), la qual pot exhibir diferents graus de polaritat o grups funcionals específics. El paràmetre analític de referència és el temps de retenció, definit com el lapse temporal que triga un compost des de la seva injecció fins a la seva arribada al detector: Els analits sense afinitat per la resina són impulsats ràpidament pel gas acarreador i presenten temps de retenció mínims. Les molècules que estableixen enllaços o afinitats fortes amb la fase estacionària retarden la seva sortida i generen temps de retenció perllongats.

Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 7 Gràfica de temps de retenció per a diferents compostos en una anàlisi GC. Limitacions i acoblament GC-MS La metodologia presenta dues limitacions inherents destacades: ERROR FREQÜENT Proposar la cromatografia de gasos per purificar proteïnes actives o enzims. La GC requereix vaporitzar la mostra a altes temperatures dins l'injector i el forn, fet que desnaturalitza i destrueix de manera irreversible les macromolècules biològiques. Pèrdua irreversible de la mostra: el procés de termodegrada i volatilització juntament amb el pas pel detector fa impossible recuperar els analits purs en el seu estat nadiu.

No és, per tant, una eina preparativa. 1 Detecció i caracterització molecular: la columna ha d'estar acoblada a sensors quantitatius fiables. Per suplir aquesta carència es recorre a la tècnica híbrida de cromatografia de gasos - espectrometria de masses (GC-MS), que permet fraccionar, quantificar i determinar simultàniament l'estructura química dels compostos emergents. 2 Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 8 IDEES CLAU A la GC la fase mòbil és un gas inert que actua exclusivament com a vehicle de transport homogeni. La resolució s'assoleix mitjançant les interaccions químiques dels analits amb la resina de la columna empaquetada.

El temps de retenció substitueix la distància de migració com a mètrica bàsica de caracterització. La tècnica és estrictament analítica i destructiva, assolint la màxima potència en acoblar-se a l'espectrometria de masses (GC-MS). COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 12. Per què les columnes de cromatografia de gasos es munten enrotllades en espiral? 13. Quina diferència mecanística fonamental hi ha entre el paper de la fase mòbil a la cromatografia plana i a la GC? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 14. Quin paper desenvolupa la fase mòbil a la cromatografia de gasos? 15. Com es mesura la velocitat de pas d'un analit a la GC? 16.

Per quin motiu la cromatografia de gasos no serveix per purificar proteïnes? 17. Quina tècnica analítica combinada s'obté en acoblar la GC a un espectròmetre de masses?

Mantenir el pH bàsic a) Fixar les biomolècules per càrrega b) Vehicle inert de transport c) Reaccionar covalentment amb la mostra d) Pel factor d'alliberament Rf a) Per la distància del front líquid b) Pel temps de retenció c) Pel volum d'aigua desplaçat d) Triga massa dies a eluir a) Fa servir només gels d'agarosa b) Requereix volatilitzar la mostra destructivament c) Només resol mescles inorgàniques d) TLC preparativa a) Electroforesi bifàsica b) GC-MS c) Extracció soxhlet d) Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 9 3 Cromatografia líquida preparativa: exclusió molecular, intercanvi iònic i afinitat EN ACABAR SABRÀS Diferenciar els principis de separació per exclusió molecular, intercanvi iònic i afinitat.

Explicar l'efecte del pH en l'elució de molècules en columnes d'intercanvi catiònic i aniònic. Descriure el mètode de purificació de mRNA mitjançant columnes d'afinitat amb poliU. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 18 Com aconseguim separar una proteïna diana d'una barreja complexa sense fer servir calor ni agents químics agressius que la facin malbé? A diferència de la cromatografia de gasos, les metodologies de cromatografia líquida (LC) empren fases mòbils líquides que flueixen per gravetat o pressió a través de columnes més curtes (habitualment de menys d'un metre).

El gran avantatge biològic de la LC és que opera en condicions no desnaturalitzants, la qual cosa permet preservar l'estructura i funcionalitat de les biomolècules. Esdevenen, per tant, les eines principals de tipus preparatiu, adreçades a aïllar substàncies en estat natiu mitjançant la recollida de fraccions de líquid o eluït. Cromatografia d'exclusió molecular (filtració en gel) La cromatografia d'exclusió molecular o filtració en gel separa les molècules en funció estricta de la seva mida molecular. La columna conté una fase estacionària porosa formada per partícules de gel amb diàmetres de porus calibrats. Mecanisme de separació per mida en filtració per exclusió molecular.

Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 10 El mecanisme d'elució segueix una dinàmica basada en l'accessibilitat física als porus: Molècules grans: en superar la mida límit del porus en queden excloses. Circulen exclusivament per l'espai intersticial situat entre les partícules del gel, recorren un camí molt més curt i s'elueixen primer (temps de retenció mínim). Molècules petites: penetren a través dels porus de la matriu, recorren tot el volum intern aquós del gel i retarden la seva sortida (temps de retenció llarg). Els gels s'escullen segons el rang de fraccionament necessari.

Per exemple, la resina Sephadex G-10 discrimina compostos de 0 a (excloent els superiors), mentre que Sephadex G-200 separa entre 5.000 i (5 a ). Això permet concatenar columnes consecutives per aïllar proteïnes d'alt pes i, posteriorment, fraccionar pèptids o metabòlits més petits. COMPROVA-HO 19 Quines molècules surten primer d'una columna de filtració en gel i per quin motiu? Cromatografia d'intercanvi iònic Aquesta tècnica discrimina soluts ionitzables aprofitant les càrregues elèctriques superficials. La matriu sòlida està funcionalitzada químicament amb grups dotats de càrrega fixa: Elució diferencial en intercanvi iònic mitjançant descens esglaonat de pH.

DEAE-cel·lulosa (dietilaminoetil): resina carregada positivament (intercanviadora d'anions) que reté molècules amb càrrega neta negativa, deixant passar les neutres i positives. 700 Da 800.000 Da 800 kDa Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 11 CM-cel·lulosa (carboximetil): resina carregada negativament (intercanviadora de cations) que reté molècules amb càrrega neta positiva. La retenció i l'alliberament es controlen modificant el pH de la fase mòbil.

Atès que la càrrega d'una proteïna depèn de la relació entre el pH del medi i el seu punt isoelèctric (pI), en reduir progressivament el pH d'un tampó alcalí (per exemple, de 9,8 a 8,5 i posteriorment a 7,6), els analits amb pI intermedis neutralitzen la seva càrrega negativa, perden la unió amb la resina DEAE i s'elueixen de manera esglaonada per fraccions. ESQUEMA Modalitats de cromatografia líquida preparativa Cromatografia d'afinitat La cromatografia d'afinitat proporciona el nivell de selectivitat més alt en explotar interaccions biològiques específiques clau-pany.

S'ancora covalentment a la resina un lligand que reconeix una única molècula diana: Cromatografia líquida Conservació de mostres en estat natiu Exclusió molecular Filtra segons diàmetre molecular i porus Intercanvi iònic Retenció per càrrega amb DEAE o CM Afinitat específica Unió reversible amb lligand complementari Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 12 Purificació de mRNA en columna d'afinitat amb resina de poliU. Purificació de mRNA eucariota: s'immobilitzen cues de poliuridina (poliU) a la columna.

Els fragments d'ARN missatger queden units mitjançant ponts d'hidrogen gràcies a la seva cua poliA terminal de l'extrem 3', mentre que l'ARN ribosòmic (rRNA) i altres àcids nucleics s'elueixen directament. Purificació proteica per anticossos: la matriu conté immobilitzats anticossos monoclonals específics contra la proteïna objectiu. Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 13 Esquema d'aïllament de proteïnes amb anticossos immobilitzats i desalat. L'elució s'aconsegueix habitualment trencant aquests ponts d'hidrogen febles mitjançant un tampó amb alta força iònica (elevada concentració de sals com NaCl).

L'excés salí posterior s'elimina ràpidament per diàlisi o filtració en gel (desalting). Mètode LC Base de la separació Fase estacionària típica Mecanisme d'elució Exclusió molecular Mida o volum molecular. Partícules de gel amb porus definits (Sephadex). Flux isocràtic de tampó per gravetat o bomba. Intercanvi iònic Càrrega elèctrica superficial neta. Grups carregats (DEAE positiu, CM negatiu). Gradient decreixent o creixent de pH / sals. Afinitat Reconeixement biològic específic. Lligands immobilitzats (poliU, anticossos). Augment de la força iònica (rentat amb sal).

ERROR FREQÜENT Creure que a l'exclusió molecular les partícules petites s'elueixen primer perquè «pesen menys i cauen més ràpid». És a l'inrevés: el pes molecular no determina la velocitat de caiguda, sinó la capacitat d'entrar als porus. Les molècules petites queden atrapades temporalment dins del laberint de porus i retarden la seva sortida. COMPROVA-HO 20 Com es desenganxa el mRNA atrapat en una columna d'afinitat amb poliU? Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 14 IDEES CLAU La cromatografia líquida opera sense volatilització, preservant l'estat natiu de les biomolècules per a usos preparatius.

L'exclusió molecular separa per mida: les partícules grans s'elueixen abans que les petites. L'intercanvi iònic es basa en la càrrega elèctrica de l'analit i es modula mitjançant el pH del medi. La cromatografia d'afinitat aconsegueix màxima puresa utilitzant lligands biològics específics (com poliU per a la cua poliA del mRNA). COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 21. En una columna d'intercanvi catiònic amb CM-cel·lulosa, quines molècules seran retingudes a la matriu? 22. Quin procediment permet desalar una proteïna purificada procedent d'una columna d'afinitat? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 23. Quin criteri regeix la sortida en cromatografia d'exclusió molecular? 24.

Quin tipus de resina és la DEAE-cel·lulosa? 25. Quina molècula s'immobilitza a la resina per purificar mRNA eucariota? 26. Quin canvi químic permet eluir molècules unides per afinitat?

Mida i volum de la molècula a) Punt isoelèctric del solut b) Apolaritat de les cadenes c) Volatilitat a 100 ºC d) Intercanviadora catiònica negativa a) Afinitat per anticossos b) Intercanviadora d'anions positiva c) Gel rígid per a gasos d) Dietilaminoetil lliure a) Poliadenina (poliA) b) Poliuridina (poliU) c) Anticòs anti-histona d) Canviar a fase mòbil gasosa a) Reduir el volum del solvent b) Apagar el termòstat del forn c) Augmentar la força iònica d) Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 15 4 Cromatografia líquida d'alta eficàcia (HPLC) EN ACABAR SABRÀS Comprendre les millores instrumentals que defineixen la cromatografia líquida d'alta eficàcia.

Descriure el funcionament dels desgasificadors, bombes d'alta pressió i columnes en HPLC. Valorar la idoneïtat de l'HPLC en aplicacions analítiques biomèdiques i de control antidopatge. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 27 Com podem aconseguir una separació cromatogràfica tan nítida com la de gasos sense escalfar ni degradar les molècules biològiques? La cromatografia líquida d'alta eficàcia (HPLC, de l'anglès High Performance Liquid Chromatography) és una modificació tecnològica avançada dels sistemes cromatogràfics líquids tradicionals.

A diferència de les columnes manuals clàssiques de vidre que funcionen sota pressió hidrostàtica ambiental, l'HPLC utilitza columnes analítiques més llargues i compactes per on la fase mòbil s'introdueix forçada mitjançant bombes d'alta pressió. Configuració del sistema instrumental d'HPLC Per garantir fluxos reproductibles i evitar pertorbacions en les lectures dels detectors, els equips d'HPLC incorporen diversos mòduls d'alta precisió: Diagrama de flux instrumental d'un sistema de cromatografia líquida HPLC.

Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 16 Dipòsits de dissolvents: contenidors independents (solvent 1 i solvent 2) que permeten treballar en modalitats isocràtiques o generar gradients de polaritat. Desgasificadors i mesclador: cambres connectades a una bomba de buit encarregades d'eliminar bombolles d'aire dissoltes als líquids abans d'arribar al bloc de pressió. Bomba d'alta pressió: dispositiu que impulsa de manera constant la fase mòbil barrejada a través de les canonades del circuit. Pre-columna i injector de mostra: la pre-columna reté impureses que podrien obturar el sistema, mentre que la vàlvula d'injecció dosifica microvolums precisos de mostra líquida.

Columna analítica i detector: cambra de separació d'alta densitat empaquetada acoblada a un detector electrònic a la sortida per registrar el cromatograma. PROCÉS Flux de treball en un equip d'HPLC COMPROVA-HO 28 Quina funció desenvolupen els desgasificadors en el circuit d'un equip d'HPLC? Rendiment analític i aplicacions biomèdiques Gràcies a l'alta pressió i a la uniformitat de la fase estacionària, l'HPLC assoleix una precisió i resolució analítica pràcticament equivalents a les de la cromatografia de gasos (GC).

No obstant això, com que requereix volums d'injecció extraordinàriament petits, generalment no s'utilitza com a tècnica preparativa a gran escala, sinó com una potentíssima metodologia d'inspecció quantitativa. Desgasificació Eliminació d'aire dels solvents mitjançant bomba de buit. 1 Mescla i pressió Formació de la fase mòbil i bombeig a pressió elevada. 2 Injecció Introducció automatitzada de microvolums de mostra a la línia. 3 Separació a la columna Resolució d'alta precisió entre analits a la matriu empaquetada. 4 Detecció Registre quantitatiu del senyal de cada solut a la sortida.

5 Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 17 Àmbit d'aplicació Ús específic d'HPLC Exemple d'analit determinat Clínic i diagnòstic Monitorització precisa de metabòlits, fàrmacs i vitamines en sèrum. Control analític dels nivells sanguinis de vitamina D. Legal i toxicologia esportiva Detecció ultrasensible de substàncies prohibides en fluids biològics. Control antidopatge en competicions esportives d'elit. ERROR FREQÜENT Assumir que, pel fet de ser una cromatografia líquida (LC), l'HPLC és una tècnica d'elecció per a la preparació i purificació massiva de proteïnes.

L'HPLC està optimitzada per a microvolums amb resolució analítica extrema; per purificar quantitats considerables en el laboratori s'empren columnes preparatives convencionals de gravetat o baixa pressió. IDEES CLAU L'HPLC introdueix la fase mòbil líquida mitjançant bombes a alta pressió a través de columnes analítiques denses. Requereix elements auxiliars com desgasificadors i pre-columnes per estabilitzar el flux i protegir la fase estacionària. Assoleix una resolució similar a la GC però operant amb mostres líquides sense necessitat de volatilització tèrmica. Té gran rellevància analítica en el seguiment mèdic (vitamina D) i legal (control de dopatge). COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 29.

Per què l'HPLC convencional no se sol emprar per purificar grans quantitats d'una biomolècula? 30. Quin avantatge té l'HPLC sobre la cromatografia de gasos en analitzar compostos termolàbils? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 31. Quin component aporta la pressió necessària a la fase mòbil en un HPLC? 32. Quin és un dels camps legals i analítics principals on destaca l'HPLC? Columna analítica a) Bomba de buit final b) Vàlvula d'injecció c) Bomba d'alta pressió d) Extracció d'ADN nuclear a) Seqüenciació massiva d'ARN b) Producció industrial d'antígens c) Detecció de dopatge esportiu d) Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 18 33.

Quina funció acompleix la pre-columna en un sistema d'HPLC? 34. Per què l'HPLC permet determinar quantitats molt petites de vitamina D? 5 Resum per repassar Fonaments i cromatografia plana Concepte Definició clau Coeficient de repartiment Propietat físico-química que determina la distribució diferencial d'un analit entre la fase estacionària i la fase mòbil. Fase estacionària Suport rígid o matriu fixa sobre el qual es retenen diferencialment les molècules de la mostra. Fase mòbil Fluid líquid o gas que es desplaça pel suport actuant com a vehicle de transport dels soluts. Factor d'alliberament ( ) Relació entre la distància recorreguda pel solut ( ) i la recorreguda pel front de solvent ( ).

TLC (capa fina) Separació plana sobre vidre o plàstic cobert d'un gel higroscòpic (sílice o midó), més resolutiva que el paper. Cromatografia de gasos (GC i GC-MS) Concepte Definició clau Cromatografia de gasos (GC) Tècnica analítica destructiva on la fase mòbil és un gas inert i la mostra s'ha de volatilitzar tèrmicament. Temps de retenció Temps que triga un compost des de la seva injecció fins que surt de la columna i genera senyal al detector. GC-MS Acoblament d'un cromatògraf de gasos a un espectròmetre de masses per a identificació i quantificació estructural.

Elevar el pH de la mostra a) Evaporar els solvents b) Reter impureses i protegir c) Mesurar la fluorescència d) Volatilitza completament el sèrum a) Funciona exclusivament per gravetat b) Té alt poder resolutiu analític c) Destrueix les altres vitamines d) R f d m d f Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 19 Cromatografia líquida preparativa (LC) Concepte Definició clau Exclusió molecular Separació per mida en gel porós (Sephadex); les molècules grans no entren als porus i s'elueixen abans que les petites. DEAE-cel·lulosa Resina carregada positivament (intercanviadora d'anions) que reté selectivament soluts de càrrega neta negativa.

CM-cel·lulosa Resina carregada negativament (intercanviadora de cations) que reté selectivament soluts de càrrega neta positiva. Cromatografia d'afinitat Separació altament específica per reconeixement biològic reversible (per exemple, cues de poliU per aïllar mRNA amb poliA). Elució per força iònica Alliberament d'analits units a la matriu mitjançant una fase mòbil amb alta concentració de sals com NaCl. Cromatografia líquida d'alta eficàcia (HPLC) Concepte Definició clau HPLC Cromatografia líquida analítica d'alta resolució que injecta la fase mòbil mitjançant bombes d'alta pressió.

Pre-columna Filtre de seguretat situat abans de la columna analítica que atrapa impureses i evita obstruccions del sistema. Aplicacions biomèdiques d'HPLC Control analític quantitatiu d'alta sensibilitat en l'àmbit clínic (vitamina D) i legal (control antidopatge). Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 20 Solucions de les preguntes de repàs 1. Perquè cada component té afinitats diferents per l'aigua fixada a la cel·lulosa i pel líquid en moviment, fet que en provoca una migració a velocitats dispars. 2. Actua com a vehicle que flueix pel suport i arrossega diferencialment els components de la mostra segons l'afinitat que tinguin per ella o per la fase estacionària. 3.

La substància més apolar de la barreja, ja que interacciona poc amb el suport aquós i és arrossegada fàcilment pel solvent mòbil fins a prop del front. 4. Perquè la fase estacionària ja està constituïda per l'aigua ambiental absorbida per la cel·lulosa. Si la fase mòbil fos igualment aquosa, no existiria diferència de polaritat ni repartiment selectiu dels analits. 5. Com més polar és la molècula, més afinitat té per la matriu hidròfila i menys es desplaça, donant lloc a un valor de baix. Les molècules apolars migren amb el front mòbil orgànic, assolint un elevat. 6. c) El coeficient de repartiment. El repartiment diferencial de les molècules entre les dues fases és la base de la separació.

7. b) Retenir aigua com a fase polar. La cel·lulosa és un suport hidròfil que absorbeix aigua ambiental actuant de fase estacionària polar. 8. c) L'avanç del front mòbil. és la distància que recorre el front de la fase mòbil des de la línia d'origen. 9. b) Millora resolució i valor semiquantitatiu. El recobriment amb gels higroscòpics ofereix capes uniformes amb major poder resolutiu. 10. Perquè cal evaporar la mostra a altes temperatures per convertir-la en gas i la seva detecció la fragmenta i destrueix completament. 11. Funciona exclusivament com a vehicle impulsor de les molècules gasoses sense exercir interacció química amb els analits de la mostra. 12.

Perquè poden amidar diversos metres de longitud per maximitzar la resolució de la separació i, d'aquesta forma, poden cabre dins d'un forn de dimensions reduïdes. 13. A la cromatografia plana la fase mòbil competeix activament mitjançant afinitat química amb la mostra, mentre que a la GC és un gas inert que es limita a transportar físicament els vapors. 14. c) Vehicle inert de transport. La fase mòbil és un gas neutre que impulsa la mostra sense interaccionar-hi. 15. c) Pel temps de retenció. El temps de retenció registra els minuts que triga el compost a sortir de la columna. 16. c) Requereix volatilitzar la mostra destructivament.

La volatilització tèrmica degrada la mostra i n'impedeix la recuperació funcional. 17. c) GC-MS. GC-MS uneix la separació de gasos amb la identificació molecular per espectrometria de masses. 18. Fent ús de la cromatografia líquida en columna, que permet separar en medi aquós controlant la càrrega elèctrica, la mida o l'afinitat biològica específica. 19. Les molècules de major volum molecular, perquè el gel les exclou dels porus i només han de recórrer l'espai buit extern entre partícules. R f R f d f Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 21 20.

Augmentant la força iònica de la fase mòbil (per exemple, amb una solució concentrada de NaCl) per desestabilitzar els ponts d'hidrogen entre les adenines i les uridines. 21. Les molècules que presentin càrrega neta positiva al pH de treball, ja que la CM-cel·lulosa està carregada negativament. 22. Es pot eliminar l'excés de sals mitjançant un procés de diàlisi o fent passar la fracció per una columna de cromatografia d'exclusió molecular. 23. a) Mida i volum de la molècula. Les molècules grans no entren als porus i s'elueixen abans que les petites. 24. c) Intercanviadora d'anions positiva. La DEAE té càrrega positiva i reté anions de la mostra. 25. c) Poliuridina (poliU).

La poliU forma ponts d'hidrogen amb la cua de poliA de l'extrem 3' del mRNA. 26. d) Augmentar la força iònica. Un augment de la concentració de sals (força iònica) trenca els enllaços febles d'afinitat. 27. Empenyent la fase mòbil líquida a través de partícules microscòpiques molt empaquetades mitjançant bombes a alta pressió (HPLC). 28. Eliminen els gasos dissolts als solvents mòbils per evitar que es formin bombolles que alterin el bombeig a alta pressió o falsegin el senyal del detector. 29. Perquè està dissenyada per gestionar volums d'injecció molt reduïts amb l'objectiu de maximitzar la precisió analítica, limitant la seva capacitat com a eina preparativa. 30.

Que treballa en fase líquida a temperatures moderades, de manera que no cal escalfar ni volatilitzar la mostra, evitant-ne la destrucció tèrmica. 31. d) Bomba d'alta pressió. La bomba d'alta pressió impulsa els solvents mòbils a través de la columna densa. 32. d) Detecció de dopatge esportiu. L'HPLC s'utilitza àmpliament en controls antidopatge per la seva alta precisió. 33. c) Reter impureses i protegir. La pre-columna actua com a filtre protector abans d'arribar a la columna analítica. 34. c) Té alt poder resolutiu analític. La combinació d'alta pressió i columnes fines aporta una resolució analítica molt elevada. Cromatografia: Tècniques Analítiques i Preparatives 22