Problemes resolts: Mètodes de separació i anàlisi de macromolècules

Problema 7. Cromatografia de gel-filtració

Es pretén estimar el pes molecular relatiu ($M_r$) d'una proteïna purificada utilitzant una columna de gel-filtració amb un interval de fraccionament de 5.000 a 250.000 Da. Durant el calibratge de la columna es va mesurar un volum buit ($V_0$) de 40 mL i un volum total ($V_t$) de 90 mL.

S'ha injectat una sèrie de proteïnes patró de pes conegut, observant-se els volums d'elució ($V_e$) següents:

Proteïna

$M_r$ (Da)

$V_e$ (mL)

Estàndard A · 12.500 · 82,5

Estàndard B · 15.300 · 81,25

Estàndard C · 22.000 · 77,5

Estàndard D · 25.100 · 75

Estàndard E · 28.700 · 70

Estàndard F · 33.300 · 68,75

Estàndard G · 45.200 · 67,5

Estàndard H · 74.500 · 55

Estàndard I · 96.800 · 52,5

Estàndard J · 120.000 · 50

Estàndard K · 244.000 · 41,25

Quan es passa la proteïna problema pura per la mateixa columna, elueix amb un volum $V_e = 60\text{ mL}$.

Calculeu el pes molecular aproximat d'aquesta proteïna.

Problema 8. Electroforesi en gel SDS-PAGE

S'ha analitzat una mostra d'una proteïna purificada mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida amb SDS (SDS-PAGE), col·locant al costat una barreja d'estàndards de pes molecular conegut. En finalitzar l'electroforesi es va tenyir el gel i es va fotografiar amb una regla mil·limetrada alineada amb el carril de marcadors, tal com s'aprecia a la imatge:

A partir d'aquestes dades, determineu el pes molecular de la proteïna problema.

Problema 9. Separació amb Sephadex G-150

Es va carregar una barreja de proteïnes estàndard en una columna de gel-filtració empaquetada amb Sephadex G-150, mesurant els seus volums d'elució respectius:

Proteïna

$M_r$ (Da)

$V_e$ (mL)

Citocrom C

13.400

206

Quimotripsinogen

25.000

184

Ovoalbúmina

45.000

165

Seroalbúmina

66.000

153

Catalasa

248.000

115

Tiroglobulina

660.000

100

Les especificacions del fabricant indiquen que el Sephadex G-150 té un rang de fraccionament per a proteïnes globulars comprès entre 5.000 i 300.000 Da.

a.

Quin és el volum buit ($V_0$) de la columna? Raoneu la resposta.

b.

Trobeu la massa molecular relativa ($M_r$) d'una proteïna que elueix a un volum $V_e = 131\text{ mL}$ en aquesta mateixa columna.

c.

Quantes subunitats constitueixen aquesta proteïna si, després de tractar-la amb l'agent desnaturalitzant SDS a l'1% i passar-la de nou per la columna, s'obté un volum d'elució $V_e = 152\text{ mL}$?

4. Problema addicional. Purificació i electroforesi bidimensional

Es disposa d'una barreja formada per quatre proteïnes (A, B, C i D) de la qual es vol aïllar cadascun dels seus components. Les propietats físico-químiques de les proteïnes es detallen a continuació:

Proteïna · Pes molecular (Da) · Punt isoelèctric (pI)

A · 45.000 · 6

B · 12.000 · 9,5

C · 120.000 · 10

D · 45.000 · 8

a)

Dibuixeu esquemàticament el resultat esperat d'una electroforesi bidimensional (2D-PAGE) d'aquesta barreja.

b)

Dissenyeu un procediment de purificació optimitzat triant estrictament les etapes necessàries d'entre les opcions de la llista següent, per aconseguir separar i aïllar de manera pura totes quatre proteïnes. Justifiqueu l'ordre i el fonament de cadascuna de les etapes seleccionades.

1. Cromatografia de bescanvi aniònic a pH 8,5

2. Cromatografia de bescanvi catiònic a pH 7

3. Elució amb solució de NaCl 1 M

4. Cromatografia de gel-filtració amb rang de fraccionament 25.000 - 100.000 Da

5. Cromatografia de gel-filtració amb rang de fraccionament 50.000 - 200.000 Da

5. Problema addicional. Purificació de proteïnes

Es disposa d'una mescla que conté quatre proteïnes (A, B, C i D) amb les propietats següents:

Proteïna · Pes molecular (Da) · Punt isoelèctric (pI)

A · 45.000 · 6,0

B · 12.000 · 9,5

C · 120.000 · 10,0

D · 45.000 · 8,0

Dissenyeu un procediment seqüencial i òptim per purificar cadascuna de les proteïnes de manera individual escollint els passos estrictament necessaris d'entre les opcions següents. Justifiqueu la selecció realitzada:

1. Cromatografia de bescanvi aniònic a pH 8,5.

2. Cromatografia de bescanvi catiònic a pH 7,0.

3. Solució de NaCl 1 M per a l'elució.

4. Cromatografia de filtració en gel amb rang de fraccionament 25.000 – 100.000 Da.

5. Cromatografia de filtració en gel amb rang de fraccionament 50.000 – 200.000 Da.

Pas 1

Pas 2

Pas 3

Problema 11. Anàlisi del logotip de seqüència d'Hsp90

Les xaperones moleculars de la família Hsp90 participen en el plegament proteic cel·lular i es troben altament conservades des dels bacteris fins als mamífers. A la imatge següent es presenta la seqüència consens de 10 residus d'aquesta família en dos formats (fórmula de patrons i representació gràfica de tipus logotip):

a)

Quins aminoàcids es troben absolutament conservats (invariables) a totes les espècies?

b)

A quines posicions es troben exclusivament aminoàcids bàsics? Indiqueu en cadascuna d'aquestes posicions quin residu és el predominant.

c)

En quines posicions apareixen exclusivament residus àcids? Quin és el residu més abundant en cadascuna?

d)

Hi ha alguna posició amb tolerància a qualsevol aminoàcid però on un d'ells tingui una presència clarament majoritària? Identifiqueu la posició i l'aminoàcid en qüestió.

Problema 12. Bescanvi iònic i precipitació de proteïnes

Respon als següents supòsits de separació i precipitació utilitzant la informació estructural i les taules de propietats:

a)

Indica l'ordre d'elució dels aminoàcids àcid glutàmic (Glu, $pI = 3{,}2$), lisina (Lys, $pI = 9{,}7$) i isoleucina (Ile, $pI = 6{,}0$) quan es fan passar per una columna d'intercanvi catiònic empaquetada amb carboximetil-cel·lulosa (CM) equilibrada a pH 6,0.

b)

Determina quin seria l'ordre de sortida d'aquests mateixos tres aminoàcids (Glu, Lys i Ile) en emprar una columna d'intercanvi aniònic amb dietilaminoetil-cel·lulosa (DEAE) a pH 8,0.

c)

Com es podria aprofitar una columna de DEAE-cel·lulosa per separar la ribonucleasa A bovina ($pI = 9{,}4$) de la seroalbúmina humana ($pI = 4{,}9$)? Detalla el pH de treball i com es recuperaria la fracció retinguda.

d)

Si es vol precipitar selectivament ovoalbúmina de pollastre ($pI = 4{,}6$) a partir d'una dissolució que inicialment es troba a pH 7,5 afegint sulfat amònic, quin ajust de pH convé fer per optimitzar la precipitació? Justifica-ho.

Problema 13. Comportament de pèptids i motiu P-loop

Es disposa d'una mescla dels tres polipèptids següents:

ATKNRASCLVPKHGALMFWRHKQLVSDPILQKRQHILVCRNAAG

GPYFGDEPLDVHDEPEEG

PHILLSAWKGMEGVGKSQSFAALIVILA

Respon raonadament a les qüestions:

a)

Quin d'ells mostrarà una migració més lenta a través d'una resina d'intercanvi aniònic a pH fisiològic (~7)?

b)

Quin dels tres es desplaçarà amb major lentitud en una matriu de bescanvi catiònic a pH 7?

c)

Si s'aplica una cromatografia de filtració en gel calibrada per a pèptids de mida petita, quin eluirà més lentament?

d)

Quin d'aquests polipèptids conté el motiu funcional d'unió a ATP (P-loop) reflectit en el logotip següent?

Problema 14. Absorbància de pèptids a 280 nm

Considerant els dos polipèptids següents:

Pèptid A: SVWDFGFYWAY

Pèptid B: QLEFTLDGY

Quin dels dos presentarà un coeficient d'extinció i una absorbància superior a una longitud d'ona de 280 nm?

Problema Extra. Estequiometria i estructura de subunitats d'una proteïna

Una proteïna oligomèrica presenta en condicions fisiològiques una massa molecular nativa de 140.000 Da. En analitzar-la mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida amb SDS (SDS-PAGE) s'obtenen els resultats representats a la imatge següent:

Carril A: Mostra tractada amb SDS en absència d'agent reductor (-BME).

Carril B: Mostra tractada amb SDS en presència de β-mercaptoetanol (+BME).

Carril C: Patrons de pes molecular conegut (seroalbúmina, 67.000 Da a 1,2 cm; ovoalbúmina, 43.000 Da a 2,9 cm; anhidrasa carbònica, 30.000 Da a 6,6 cm; inhibidor de tripsina, 20.000 Da a 9,5 cm).

A partir d'aquestes dades experimentals:

a)

Quina és l'estequiometria en subunitats de la proteïna en la seva conformació nativa?

b)

Quin tipus d'enllaços o interaccions mantenen unides les subunitats entre si? Justifiqueu la naturalesa dels enllaços entre monòmers i entre dímers a partir de l'efecte del SDS i del β-mercaptoetanol.