Pràctica d'electroforesi SDS-PAGE: Recta de calibratge i anàlisi de la caseïna

Context

En una electroforesi en condicions desnaturalitzants ( SDS-PAGE), les proteïnes migren a través d'un gel segons la seva massa molecular relativa ($M_r$), atès que el detergent SDS confereix una densitat de càrrega negativa uniforme per unitat de massa. La mobilitat relativa ($R_f$) d'una proteïna es calcula com el quocient entre la distància recorreguda per la banda i la distància total recorreguda pel front d'electroforesi ($R_f = d / d_{\text{front}}$). En un rang adequat de separació, existeix una relació lineal inversa entre el logaritme de la massa molecular ($\log M_r$) i la mobilitat relativa ($R_f$), la qual permet establir una recta de calibratge per determinar el pes molecular d'una proteïna problema.

Activitat 1. Determinació de la massa molecular de la caseïna mitjançant electroforesi SDS-PAGE

A partir d'un gel d'electroforesi SDS-PAGE en el qual s'ha carregat un patró de marcadors de pes molecular (bandes 1 a 9) i una mostra de caseïna (banda 10), s'han registrat les distàncies de migració respectives en unitats arbitràries o píxels:

Banda

Proteïna / Patró

Distància de migració

Massa molecular ($M_r$, Da)

1 · Patró 1 · 26 · 250.000

2 · Patró 2 · 54,009 · 150.000

3 · Patró 3 · 90,006 · 100.000

4 · Patró 4 · 119,004 · 75.000

5 · Patró 5 · 187,003 · 50.000

6 · Patró 6 · 244,002 · 37.000

7 · Patró 7 · 344,006 · 25.000

8 · Patró 8 · 389,005 · 20.000

9 · Patró 9 (front) · 439,000 · 15.000

10 · Caseïna · 295,042 · Desconeguda

La representació gràfica de les dades experimentals proporciona la següent recta de calibració:

Respon als apartats següents:

a)

Calcula els valors de mobilitat relativa ($R_f$) i de $\log M_r$ per a cadascun dels patrons del marcador de pesos moleculars, prenent la distància de la banda 9 (439,000) com a referència del front.

b)

Presenta l'equació de regressió lineal ($\log M_r = m \cdot R_f + n$) i el coeficient de determinació ($R^2$) obtinguts a partir de la recta de calibració.

c)

Calcula el valor de $R_f$ per a la caseïna, el valor estimat de $\log M_r$ mitjançant la recta de calibratge i dedueix la seva massa molecular relativa ($M_r$).