Pràctica: Separació de proteïnes per electroforesi PAGE-SDS

Context

L'electroforesi en gel de poliacrilamida amb dodecilsulfat sòdic ( SDS-PAGE) és una de les tècniques més emprades en bioquímica per a la separació i caracterització de mescles proteiques en funció de la seva massa molecular relativa ($M_r$). L'objectiu d'aquesta sessió de laboratori és analitzar els perfils proteics de diferents tipus de llet (sencera, semidesnatada, desnatada i de soja), determinar la massa molecular relativa de la $\beta$-caseïna per interpolació en una corba de calibratge i planificar la preparació i càrrega de les mostres a partir de la seva informació nutricional.

Pregunta 1. Qüestions conceptuals sobre el gel PAGE-SDS

A partir de la imatge obtinguda del gel d'electroforesi de la pràctica, responeu breument a les següents qüestions:

a)

b)

c)

d)

Pregunta 2. Determinació de la massa molecular relativa (Mr) de la beta-caseïna

A partir del patró de marcadors de pes molecular (MW) indicat a la imatge, determineu la massa molecular relativa ($M_r$) de la $\beta$-caseïna mitjançant una corba de calibratge lineal.

La mobilitat relativa ($R_f$) es calcula dividint la distància recorreguda per cada proteïna estàndard entre la distància recorreguda pel front del colorant:

$$R_f = \frac{\text{distància migrada per la proteïna}}{\text{distància migrada pel front del colorant}}$$

Considerant una distància total recorreguda pel front de 8,9 cm, es van obtenir les següents mesures:

a)

Calculeu els valors de $R_f$ i de $\log(M_r)$ per a cadascun dels patrons estàndard i per a la $\beta$-caseïna:

Proteïna / Banda

$M_r$ teòrica (Da)

Distància migrada (cm)

$R_f$

$\log(M_r)$

Marcador 1

100.000

1,50

Marcador 2

75.000

2,05

Marcador 3

50.000

3,05

Marcador 4

37.000

3,95

Marcador 5

35.000

5,55

Marcador 6

20.000

6,20

Marcador 7

15.000

7,75

$\beta$-Caseïna

-

4,90

-

b)

Obtingueu l'equació de la recta de regressió lineal ($\log(M_r)$ enfront de $R_f$) i estimeu el valor de la massa molecular de la $\beta$-caseïna.

Pregunta 3. Anàlisi electroforètica d'una proteïna dimèrica amb enllaços disulfur

Disposem d'una proteïna dimèrica unida per ponts disulfur intercatenaris (Cys-S-S-Cys) tal com s'il·lustra a l'estructura següent:

Feu un esquema il·lustrant les bandes que s'observarien en un gel de SDS-PAGE quan la proteïna es tracta en les dues condicions següents:

Carril 1: Mostra incubada amb un tampó de càrrega que conté agent reductor ($+\beta$-mercaptoetanol, $+\beta\text{ME}$).

Carril 2: Mostra incubada amb un tampó de càrrega en absència de reductor ($-\beta\text{ME}$).

%

Pregunta 4. Protocol de preparació del gel i càrrega de mostres de llet sencera i de soja

Es volen carregar $20\ \mu\text{g}$ de proteïna total en dos carrils d'un gel SDS-PAGE a partir de mostres comercials de llet sencera i de llet de soja. A continuació es mostren les dades de les etiquetes nutricionals dels dos productes:

Paràmetre nutricional (per 100 mL)

Llet sencera de vaca

Beguda de soja

Valor energètic

62 kcal / 260 kJ

43 kcal / 178 kJ

Proteïnes

3,0 g

3,3 g

Hidrats de carboni

4,5 g

2,8 g

Greixos

3,6 g

1,9 g

Calci

120 mg (15% QDR)

120 mg (15% CDR)

a)

Calculeu el volum exacte de mostra directa de llet sencera i de llet de soja necessari per a obtenir els $20\ \mu\text{g}$ de proteïna requerits per pouet.

b)

Descriviu el procediment complet de laboratori: preparació dels gels de separació i apilament, dilució prèvia amb el tampó de càrrega ( loading buffer), tractament tèrmic i condicions electroforètiques.