Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià

I 0 flashcards i 8 preguntes més al document.

Text del document

APUNTS BIOLOGIA MOLECULAR I CEL·LULAR DELS MICROORGANISMES Grau en Biotecnologia Universitat de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apunts de regulació post-transcripcional, control global (cAMP, ppGpp, Ntr), sistemes R-M i CRISPR, i mecanismes de quorum sensing microbià.

APREN.AI Índex Regulació post-transcripcional 1 Estabilitat del mRNA i autoregulació ribosòmica Dinàmica i degradació del mRNA bacterià Particularitats de l'extrem 3' en bacteris Autoregulació de la síntesi de proteïnes ribosòmiques Coordinació amb la maquinària de transcripció 2 Atenuació, riboswitches i sRNA Atenuació traduccional de trpE per la proteïna TRAP Riboswitches sensors de metabòlits i temperatura Petits RNA reguladors (sRNA) i el paper de la xaperona Hfq Diversitat d'accions reguladores dels sRNA Control osmòtic de les porines OmpF i OmpC pel sistema EnvZ/OmpR i MicF 3 Control de qualitat per tmRNA i proteòlisi Rescat de ribosomes bloquejats i control de qualitat pel tmRNA Sistemes proteolítics dependents d'ATP: proteases citoplasmàtiques Lon i Clp Tipus de senyals de degradació: degrons i la seva exposició Regulació del factor σS (RpoS) per l'adaptador RssB i antiadaptadors Control proteolític de la resposta SOS: LexA i SulA Regulació global 4 Repressió per catabòlit i resposta restrictiva Jerarquia de control genètic: operó, reguló i moduló Repressió per catabòlit en Escherichia coli Repressió catabòlica per carboni (CCR) a Bacillus subtilis La resposta restrictiva i l'alarmona ppGpp Mecanisme d'acció de ppGpp: redistribució de la RNA polimerasa 5 Sistemes de dos components i regulació del metabolisme del nitrogen Principis de la transducció de senyals per dos components La glutamina sintetasa i la seva regulació al·lostèrica Control covalent: cascades d'adenilació i d'uridilació de PII Organització transcripcional de l'operó glnALG Mecanisme molecular de regulació per NtrB-NtrC i factor σ54 6 Defensa bacteriana — Resistència, sistemes de restricció-modificació i CRISPR-Cas 1.

Estratègies de resistència genètica a la superfície Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 1 2. Sistemes de modificació-restricció (R-M) 3. Enzims de restricció de Tipus II i enginyeria genètica 4.

El sistema immunitari adaptatiu CRISPR-Cas Quorum sensing 7 Models moleculars en bacteris Gram-negatius, Gram-positius i híbrids Principis generals de la comunicació per Quorum Sensing Classificació molecular dels circuits de Quorum Sensing Circuit canònic LuxI/LuxR en bacteris Gram-negatius Circuit basat en pèptids en bacteris Gram-positius Model híbrid i la cascada repressora de Vibrio harveyi 8 Processos biològics regulats, comunicació interregne i aplicacions Processos clàssics coordinats per Quorum Sensing Comunicació interregne: hoste i microorganisme Estratègies d'inhibició i enginyeria bacteriana Coordinació immunitària CRISPR segons la densitat cel·lular 9 Resum per repassar Regulació post-transcripcional Regulació global Defensa bacteriana i Quorum Sensing Solucions de les preguntes de repàs Aquests apunts poden contenir errors o omissions.

Són un material de suport i no substitueixen el temari oficial ni el professorat: contrasta la informació important. Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 2 1 Estabilitat del mRNA i autoregulació ribosòmica EN ACABAR SABRÀS Comprendre el valor adaptatiu de la ràpida degradació del mRNA bacterià. Descriure el requeriment d'extrem 5' de l'endonucleasa RNasa E. Explicar el mecanisme de retroalimentació traduccional de les proteïnes ribosòmiques regulat per rRNA. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 1 Per què els bacteris tenen una taxa de degradació del seu mRNA molt més elevada que les cèl·lules eucariotes? La regulació gènica en bacteris no es limita a la iniciació de la transcripció.

Un cop sintetitzat el transcrit primari, la cèl·lula modula la quantitat final de proteïna mitjançant mecanismes post- transcripcionals: alterant l'estabilitat del missatger, controlant la seva traducció o modificant la taxa de recanvi proteic. Regulació post-transcripcional 1 Estabilitat del mRNA i autoregulació ribosòmica 2 Atenuació, riboswitches i sRNA 3 Control de qualitat per tmRNA i proteòlisi Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 3 ESQUEMA Regulació post- transcripcional, global i sistemes bacterians Esquema dels nivells de regulació de l'expressió gènica bacteriana.

Dinàmica i degradació del mRNA bacterià A diferència de les molècules estables com el rRNA o el tRNA, el mRNA bacterià presenta una notable labilitat. La vida mitjana habitual del mRNA d'Escherichia coli és d'uns 40 segons a 37 ºC, tot i que certs transcrits poden perdurar més o menys temps. Aquesta elevada taxa de recanvi permet a la cèl·lula remodelar ràpidament el seu patró d'expressió proteica davant de fluctuacions sobtades de l'entorn.

Control post- transcripcional Estabilitat de mRNA, sRNA, atenuació i proteòlisi Regulació global Repressió catabòlica, ppGpp i sistemes de dos components Defensa bacteriana Restricció-modificació i CRISPR- Cas Quorum sensing Comunicació cel·lular per autoinductors Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 4 Els missatgers cel·lulars es poden protegir de la degradació enzimàtica a través de dos mecanismes fonamentals: Ocupació per ribosomes: la unió i avanç dels complexos de traducció cobreixen físicament la cadena de RNA. Estructures secundàries: el plegament del propi missatger emmascara els llocs de reconeixement de les nucleases.

Quan aquestes defenses fallen o desapareixen, actuen les ribonucleases cel·lulars. La RNasa E és una endonucleasa depenent d'extrems 5' que requereix un mínim de 4 nucleòtids a l'extrem 5' per realitzar el tall. Aquest enzim lidera la degradació de la majoria dels missatgers d'E. coli i intervé en el processament d'operons policistrònics de rRNA i certs tRNA. D'altra banda, la RNasa P s'encarrega d'escindir regions precursores en operons que codifiquen tRNA. COMPROVA-HO 2 Quina conseqüència tindria per a un bacteri que el seu mRNA fos tan estable com el rRNA?

Particularitats de l'extrem 3' en bacteris En els organismes eucariotes, gairebé tots els mRNA madurs posseeixen una cua poli(A) funcional a l'extrem 3' que els protegeix de la degradació i serveix per a la seva purificació per cromatografia d'afinitat. En canvi, el dogma tradicional indica que els bacteris manquen d'aquesta modificació. Aproximadament un 1-2% dels mRNA d'E. coli presenten una cua de poliA a l'extrem 3' afegida post- transcripcionalment. Aquesta cua no prové de la matriu transcripcional original, sinó que s'afegeix a posteriori com a marca accessòria, a diferència del patró general d'estabilització eucariota.

Característica mRNA bacterià mRNA eucariota Vida mitjana típica Molt curta (aprox. 40 segons a 37 ºC) Llarga (des de minuts fins a hores o dies) Presència de cua poli(A) Residual (1-2% dels transcrits) Generalitzada a la pràctica totalitat de missatgers Purificació per afinitat (oligo-dT) No aplicable de forma rutinària Mètode estàndard de separació ERROR FREQÜENT Confondre la funció de la cua poli(A) eucariota amb la bacteriana. A E. coli, la cua poli(A) només afecta una minoria del missatge (1-2%) i no s'utilitza com a eina habitual de purificació per afinitat per cromatografia, a diferència del que passa en eucariotes.

Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 5 Autoregulació de la síntesi de proteïnes ribosòmiques La cèl·lula bacteriana modula intensament la seva maquinària de traducció en funció dels nutrients disponibles. En creixement ràpid una cèl·lula d'E. coli pot tenir uns 70.000 ribosomes, mentre que en creixement lent baixa a uns 20.000. En condicions de màxima taxa metabòlica, els ribosomes poden arribar a representar fins al 45% del pes sec cel·lular. Diagrama de la composició dels ribosomes en eucariotes i bacteris.

El ribosoma bacterià complet (70S) està format per dues subunitats: la subunitat gran (50S), que integra els rRNA 23S i 5S amb 34 proteïnes, i la subunitat petita (30S), composta pel rRNA 16S i 21 proteïnes. Aquestes més de 50 proteïnes ribosomals es troben agrupades en uns 20 operons policistrònics. El mecanisme que ajusta la quantitat d'aquestes proteïnes és un control a nivell traduccional en funció dels nivells de rRNA lliure. Quan les proteïnes ribosòmiques es tradueixen al citoplasma, es troben davant de dues opcions: Acoblament al rRNA: si hi ha rRNA lliure disponible, les proteïnes s'hi associen de manera preferent i amb gran afinitat per constituir nous ribosomes.

1 Repressió per excés: si s'esgota el rRNA cel·lular, les proteïnes ribosòmiques queden lliures en el citoplasma. Una proteïna específica de cada operó (com la proteïna L1 en el seu operó corresponent) s'uneix a la regió 5' UTR del seu propi transcrit policistrònic. 2 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 6 Esquema de repressió traduccional per unió al 5' UTR. Aquesta interacció física de la proteïna ribosomal lliure sobre la regió 5' UTR bloqueja l'accés o progressió de la maquinària de traducció. Com a resultat, s'atura la traducció de tots els cistrons d'aquell operó fins que torni a haver-hi rRNA lliure disponible.

COMPROVA-HO 3 Què determina que la proteïna L1 s'associï al 5' UTR del seu propi mRNA en lloc de formar ribosomes? Coordinació amb la maquinària de transcripció Diversos operons policistrònics ribosomals no només porten la informació per a proteïnes de les subunitats 30S i 50S, sinó que també contenen els gens de subunitats clau de la RNA polimerasa, com les subunitats , o . Aquesta organització gènica compartida coordina directament la capacitat transcripcional i la capacitat traduccional del bacteri, mantenint una proporció equilibrada entre ambdues maquinàries moleculars segons l'estat energètic cel·lular.

COMPROVA-HO 4 Quin benefici biològic aporta que els gens de subunitats de la RNA polimerasa comparteixin operó amb proteïnes ribosòmiques? β β α Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 7 IDEES CLAU La vida mitjana del mRNA d'E. coli és d'aproximadament 40 segons a 37 ºC, fet que permet una reprogramació ràpida de l'expressió cel·lular. Els ribosomes en trànsit i els plegaments secundaris defensen els missatgers de l'atac per ribonucleases. La RNasa E és una endonucleasa depenent d'extrems 5' clau en la degradació general i en el processament d'operons de rRNA. Només un 1-2% dels transcrits bacterians incorporen una cua de poliA terminal afegida post- transcripcionalment.

L'autoregulació ribosòmica funciona com un sensor: en excés de rRNA es formen ribosomes; en manca de rRNA, certes proteïnes ribosòmiques s'uneixen al 5' UTR del seu propi transcrit policistrònic i bloquegen la traducció. La presència de gens de la RNA polimerasa en operons ribosomals acobla la capacitat transcripcional amb la traduccional. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 5. Com actua la RNasa E sobre els transcrits cel·lulars d'E. coli? 6. Què passa quan els nivells de rRNA a la cèl·lula són molt baixos respecte a les proteïnes ribosòmiques?

REGULACIÓ POST-TRANSCRIPCIONAL 2 Atenuació, riboswitches i sRNA EN ACABAR SABRÀS Diferenciar els mecanismes de segrest del RBS per proteïnes com TRAP i per dominis riboswitch. Explicar com la temperatura modula la virulència a Listeria monocytogenes mitjançant el termosensor de prfA. Descriure el paper fonamental de la xaperona Hfq i analitzar accions inhibidores o activadores dels sRNA. Analitzar el circuit integrat Fur-RyhB en l'estalvi de ferro i el control MicF sobre la porina OmpF. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 7 Com pot un bacteri decidir si tradueix o no un enzim sense utilitzar cap proteïna reguladora addicional?

Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 8 Atenuació traduccional de trpE per la proteïna TRAP La síntesi de triptòfan a Bacillus està sotmesa a una doble barrera de seguretat. A més del control durant l'elongació transcripcional, existeix un mecanisme d'atenuació traduccional sobre el primer gen de la ruta, trpE. Aquest procés depèn directament de la proteïna reguladora TRAP (trp RNA- binding attenuation protein), un complex anular multimèric. Quan la concentració intracel·lular de triptòfan és elevada, l'aminoàcid s'uneix a les subunitats de TRAP i activa la proteïna. En aquest estat actiu, TRAP s'associa a una sèrie de repeticions de codons a la regió líder del transcrit de trp.

Aquesta unió reconfigura l'estructura secundària de l'RNA missatger: indueix la formació d'una forquilla que segresta la seqüència Shine-Dalgarno (SD o RBS, Ribosome Binding Site) de trpE. Com a conseqüència, el ribosoma no pot reconèixer el lloc d'inici i la traducció queda completament bloquejada. Esquema del bloqueig del RBS de trpE per la proteïna TRAP. Si el triptòfan escasseja, TRAP roman inactiva i no s'uneix a l'RNA. Sense la interacció de TRAP, la molècula de mRNA adopta una conformació alternativa on la seqüència Shine-Dalgarno queda lliure i exposada, permetent l'acoblament del ribosoma i la traducció immediata dels enzims biosintètics.

Aquest segon nivell de control garanteix que, si la polimerasa escapa accidentalment de l'atenuació transcripcional, no es malgasti energia sintetitzant proteïnes innecessàries. COMPROVA-HO 8 Quina funció té l'atenuació traduccional de trpE si ja existeix una atenuació a nivell de transcripció? Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 9 Riboswitches sensors de metabòlits i temperatura Els riboswitches o interruptors d'RNA són dominis estructurats presents principalment a la regió 5' no traduïda (5' UTR) dels missatgers bacterians capaços de monitorar paràmetres fisicoquímics o metabòlits concrets sense intervenció de factors proteics accessoris.

Consten clàssicament d'un domini aptàmer que reconeix el senyal i una plataforma d'expressió que tradueix aquest reconeixement en una resposta funcional. DEFINICIÓ Un riboswitch és un sensor d'RNA present en el propi transcrit que pateix una transició conformacional en detectar un lligand químic o un canvi físic, modificant l'accessibilitat de la seqüència Shine-Dalgarno o la continuïtat de la transcripció. Sensors de metabòlits: el cas de la cobalamina En molts operons biosintètics, la molècula sintetitzada actua com a lligand que apaga la seva pròpia producció. Un exemple paradigmàtic és el riboswitch de l'operó de la cobalamina. El producte final d'aquesta via és el coenzim B12.

Quan aquest metabòlit assoleix concentracions suficients, s'uneix de manera altament específica a la regió líder del mRNA. La unió provoca una reorganització intramolecular en què una seqüència anti-SD (ASD) s'aparella amb la seqüència Shine-Dalgarno. En quedar el lloc d'unió ribosòmic oclòs en una doble hèlix, s'aboleix la traducció. Per contra, davant la carència de coenzim B12, l'aptàmer roman buit, la seqüència SD resta accessible i la maquinària traduccional pot sintetitzar els enzims de síntesi.

Tot i que en les rutes anabòliques el lligand sol exercir una repressió, existeixen riboswitches que funcionen en sentit oposat: la interacció amb el compost desfa una estructura inhibitòria prèvia, allibera la seqüència SD i actua com a inductor traduccional. Riboswitches termosensors: virulència a Listeria monocytogenes Determinats dominis d'RNA varien la seva conformació directament per l'energia tèrmica de l'entorn, actuant com a termosensors d'RNA. Aquests mecanismes són claus en patògens per coordinar l'expressió de toxines amb l'entrada al cos d'un hoste de sang calenta. Esquema del funcionament del riboswitch termosensor segons la temperatura ambiental.

Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 10 El patogen intracel·lular Listeria monocytogenes utilitza aquest sistema per modular l'activador de virulència prfA, el qual activa la transcripció de factors patogènics essencials com la toxina listeriolisina: A temperatures baixes o ambientals (inferiors a 37 ºC): El missatger de prfA es transcriu, però l'extrem 5' UTR manté una forquilla bicatenària molt estable. La seqüència Shine-Dalgarno queda emmascarada a l'interior d'aquesta estructura, de manera que els ribosomes no hi poden accedir i la traducció queda apagada (estat OFF).

A temperatura corporal fisiològica (37 ºC): L'increment d'entalpia desestabilitza els ponts d'hidrogen de la tija secundària. L'estructura es fon tèrmicament, exposant el RBS. Els ribosomes inicien la traducció de PrfA, desencadenant la maquinària infecciosa exclusivament dins de l'hoste (estat ON). COMPROVA-HO 9 Com distingeix Listeria monocytogenes si es troba a l'ambient o dins d'un hoste mamífer per sintetitzar la listeriolisina? Petits RNA reguladors (sRNA) i el paper de la xaperona Hfq Els bacteris disposen d'una complexa xarxa de petits RNA no codificants (sRNA), amb mides habituals d'entre 50 i 300 nucleòtids.

Malgrat representar aproximadament el 0,3% del pes sec total d'RNA cel·lular (davant del conjunt d'RNA que suposa al voltant del 20,5% de la biomassa seca), desenvolupen funcions reguladores essencials. En un organisme model com Escherichia coli se n'han descrit més de mig centenar. Els sRNA modulen l'expressió gènica aparellant-se per complementarietat de bases parcial o total amb regions específiques dels seus mRNA diana, localitzades sovint a la vora de l'extrem 5' o directament cobrint la seqüència SD.

Aquesta interacció pot conduir a quatre desenllaços bàsics: DEFINICIÓ La proteïna Hfq és una xaperona d'RNA bacteriana homohexamèrica que facilita i estabilitza els aparellaments imperfectes de bases entre els sRNA reguladors i els seus mRNA diana, evitant la seva dissociació prematura o degradació. Inhibició traduccional directa: El sRNA s'hibrida amb la seqüència Shine-Dalgarno o el codó d'inici, impedint físicament l'acoblament del complex ribosòmic 30S. 1 Activació traduccional: El missatger diana presenta una estructura intramolecular nativa que segresta el seu propi RBS. El sRNA s'uneix a la tija complementària, desfent la forquilla i deixant el RBS exposat per als ribosomes.

2 Promoció de la degradació per ribonucleases: El dúplex d'RNA format entre el sRNA i el missatger serveix de substrat de reconeixement per a endonucleases com la RNasa E (vegeu «Regulació post-transcripcional — Estabilitat del mRNA i autoregulació ribosòmica»), accelerant la hidròlisi del missatger. 3 Protecció enfront de ribonucleases: La unió de l'sRNA emmascara punts de tall vulnerables d'endonucleases, incrementant la vida mitjana del transcrit. 4 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 11 Atès que molts sRNA només comparteixen fragments curts de complementarietat amb els seus objectius, les unions bicatenàries resultants serien termodinàmicament inestables per si soles.

La proteïna Hfq actua com una plataforma d'unió que recluta ambdues molècules d'RNA, accelera la seva cinètica d'hibridació i en preserva l'estabilitat estructural. PROCÉS Mecanisme del riboswitch de cobalamina Diversitat d'accions reguladores dels sRNA Un únic sRNA pot controlar diversos missatgers i produir respostes oposades sobre cadascun d'ells segons el context cel·lular. Repressió traduccional: OxyS sobre fhlA Davant de condicions d'estrès oxidatiu, la cèl·lula indueix l'expressió del sRNA OxyS. La seva funció és reorganitzar el metabolisme bloquejant rutes incompatibles amb el dany oxidatiu.

Una de les seves dianes principals és el transcrit de fhlA, factor transcripcional encarregat d'activar el sistema de la formiat hidrogen liasa. El sRNA OxyS s'uneix de manera complementària al voltant del RBS de fhlA, impedint mecànicament l'accés del ribosoma i inhibint la traducció de l'activador.

Absència de lligand Nivells citoplasmàtics de coenzim B12 molt baixos 1 RBS accessible Seqüència Shine-Dalgarno lliure a l'extrem 5' UTR 2 Traducció activa El ribosoma tradueix els enzims de l'operó 3 Acumulació de B12 El coenzim s'uneix al domini aptàmer de l'mRNA 4 Segrest del RBS La seqüència anti-SD s'aparella amb el RBS 5 Aturada traduccional El ribosoma no pot unir-se i cessa la síntesi 6 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 12 Esquema de la repressió traduccional de fhlA mitjançant el sRNA OxyS. Activació traduccional: DsrA sobre rpoS El gen rpoS codifica el factor sigma alternatiu de fase estacionària i estrès general, .

En condicions estàndard a temperatures baixes, el transcrit de rpoS es plega sobre si mateix: una tija intramolecular segresta el RBS i manté la traducció apagada. El sRNA DsrA es produeix precisament a baixes temperatures. En hibridar-se amb el braç bloquejant del missatger de rpoS, DsrA allibera el RBS. Els ribosomes inicien la traducció i el transcrit queda estabilitzat. De forma interessant, DsrA té un efecte diametralment oposat sobre el gen hns (proteïna estructural del nucleoide implicada en el superenrotllament i la regulació gènica global): la unió de DsrA al mRNA de hns n'accelera el recanvi mitjançant una ràpida degradació.

Degradació del missatger i control de ferro: RyhB i Fur L'homeòstasi del ferro és un equilibri delicat: el és un cofactor essencial per a molts enzims, però la seva acumulació descontrolada genera toxicitat per radicals lliures. Aquest balanç està supervisat pel repressor transcripcional Fur (Ferric uptake regulator) i el sRNA RyhB. La proteïna Fur s'activa quan s'associa directament a l'ió .

Per tant, actua com a sensor d'abundància de ferro: Quan hi ha abundància de ferro: El complex Fur- s'uneix als promotors corresponents i reprimeix la transcripció de dos elements: d'una banda, el gen ent (responsable de sintetitzar l'enteriquelina, un sideròfor per captar ferro extracel·lular); de l'altra, el gen del sRNA ryhB. Com que RyhB no s'expressa, els missatgers d'enzims dependents de ferro (com sodB, la superòxid dismutasa de ferro, o sdhCDAB per a la succinat deshidrogenasa) no es degraden i es tradueixen lliurement. Quan el ferro és escàs: Fur perd el cofactor i s'inactiva, alliberant la repressió.

Es transcriu l'enteriquelina (ent) per captar ferro del medi extern i s'expressa el sRNA RyhB. RyhB, amb l'auxili d'Hfq, s'hibrida amb transcrits que codifiquen proteïnes consumidores de ferro com sodB. La formació d'aquest dúplex estimula el reclutament de ribonucleases per a la degradació immediata de l'mRNA, estalviant així el ferro restant per als processos cel·lulars indispensables.

σS Fe2+ Fe2+ Fe2+ Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 13 CAUSES I CONSEQÜÈNCIES Baixa concentració de Fe2+ Pèrdua del cofactor de la proteïna Fur Inactivació de Fur Alliberament dels promotors ent i ryhB Circuit de regulació de ferro per Fur i RyhB Síntesi d'enteriquelina Expressió del gen ent per captar Fe extern Transcripció de RyhB Producció del sRNA regulador assistit per Hfq Degradació de sodB Ribonucleases destrueixen l'mRNA per estalviar ferro sRNA Dianes principals Mecanisme d'acció Condició reguladora MicF ompF Repressió de la traducció (segrest del RBS) Alta osmolaritat, estrès oxidatiu, àcids MicC ompC Repressió de la traducció Condicions osmòtiques específiques DsrA rpoS, hns Activació traduccional (rpoS) / Degradació (hns) Baixes temperatures RprA rpoS Activació traduccional Estrès de coberta / senyals osmòtics OxyS fhlA, rpoS Repressió traduccional de fhlA Estrès oxidatiu RyhB sodB, sdhCDAB Repressió traduccional i degradació per RNases Baixa concentració de ferro ( ) Spot42 galETKM Repressió traduccional Disponibilitat de carboni GcvB oppA, dppA Repressió traduccional Homeòstasi d'aminoàcids ERROR FREQÜENT Confondre l'efecte de Fur amb el del sRNA RyhB sobre les proteïnes consumidores de ferro.

Recorda que Fur és un repressor transcripcional directe del gen ryhB. Per tant, Fur NO indueix la degradació de sodB: quan hi ha ferro, Fur reprimeix RyhB, de manera que sodB es tradueix. És la manca de ferro (manca d'activitat de Fur) el que allibera la síntesi de RyhB i provoca la degradació del missatger per RNases. Fe2+ Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 14 Control osmòtic de les porines OmpF i OmpC pel sistema EnvZ/OmpR i MicF La membrana externa dels bacteris Gram-negatius conté proteïnes formadores de porus (porines) que regulen la permeabilitat passiva de soluts. A E. coli, les dues porines clau són OmpF i OmpC.

OmpF presenta un canal hidrofílic d'un diàmetre lleugerament superior al d'OmpC, la qual cosa permet una difusió de soluts més ràpida. En ambients de baixa osmolaritat, OmpF predomina a la membrana per captar nutrients eficientment. En canvi, en ambients d'alta pressió osmòtica, la cèl·lula afavoreix OmpC i reprimeix OmpF per limitar l'entrada massiva de soluts o tòxics.

La resposta inicial comença pel sistema de dos components format pel sensor de membrana EnvZ i el regulador citoplasmàtic OmpR (vegeu «Regulació global — Sistemes de dos components i regulació del metabolisme del nitrogen»): Addicionalment, la transcripció del sRNA MicF pot ser induïda per altres factors d'estrès com canvis de pH, estrès oxidatiu (activador SoxS), antibiòtics i sals biliars (activador MarA o Rob), integrant múltiples vies d'estrès en un únic interruptor post-transcripcional sobre la permeabilitat cel·lular. COMPROVA-HO 10 Quin és el mecanisme molecular precís pel qual una alta osmolaritat aconsegueix disminuir els nivells de la porina OmpF?

Detecció osmòtica: Quan augmenta l'osmolaritat externa (provocant canvis en la turgència cel·lular), EnvZ s'autofosforila aprofitant ATP en un residu d'histidina. 1 Fosforilació en cascada: EnvZ transfereix el grup fosfat a la proteïna efectora OmpR, generant OmpR~P. 2 Regulació transcripcional divergent: A altes concentracions, OmpR~P s'uneix als promotors gènics activant la transcripció d'ompC i estimulant la transcripció del gen regulador micF. 3 Repressió post-transcripcional per MicF: El sRNA MicF és un RNA antisentit de 93 nucleòtids complementari a la regió 5' UTR del missatger d'ompF.

Quan MicF s'expressa, s'hibrida amb el missatger d'ompF i segresta la seva seqüència Shine-Dalgarno, bloquejant immediatament la traducció de la porina de porus gran. 4 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 15 IDEES CLAU Atenuació de trpE: en presència de triptòfan, la proteïna TRAP segresta la seqüència Shine- Dalgarno de l'mRNA impedint la unió del ribosoma. Riboswitches de metabòlits: molècules com el coenzim B12 s'uneixen directament a l'aptàmer del missatger per provocar el segrest intramolecular del RBS. Riboswitches termosensors: l'mRNA de prfA a Listeria monocytogenes manté el RBS inaccessible a baixes temperatures i es desnaturalitza a 37 ºC per permetre la traducció.

sRNA i proteïna Hfq: els sRNA reguladors representen prop del 0,3% de l'RNA cel·lular i depenen de la xaperona Hfq per estabilitzar l'aparellament de bases amb les seves dianes. Balanç de ferro per Fur i RyhB: quan el ferro escasseja, la inactivació de Fur permet l'expressió del sRNA RyhB, que guia la destrucció per ribonucleases dels missatgers com sodB. Modulació osmòtica d'OmpF/OmpC: a alta osmolaritat, OmpR activa el sRNA MicF, el qual bloqueja la traducció d'ompF per complementarietat antisentit sobre el seu RBS. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 11. Quin paper juga la proteïna acompanyant Hfq en l'acció reguladora dels petits RNA (sRNA)? 12.

De quina manera diferent actua el sRNA DsrA sobre els missatgers de rpoS i hns? 13. Què ocorre sobre l'expressió de la porina OmpF quan la cinasa EnvZ s'autofosforila per un increment d'osmolaritat? REGULACIÓ POST-TRANSCRIPCIONAL 3 Control de qualitat per tmRNA i proteòlisi EN ACABAR SABRÀS Descriure el mecanisme d'acció del tmRNA en el rescat de ribosomes encallats i marcatge de pèptids defectuosos. Comparar l'organització estructural i catalítica de les proteases bacterianes Lon i Clp. Analitzar el paper de l'adaptador RssB i dels antiadaptadors en el control proteolític de σS. Detallar el circuit proteolític de la resposta SOS implicant RecA*, LexA, SulA i la proteasa Lon.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 14 Com aconsegueix un bacteri no malgastar els seus ribosomes quan un missatger es trenca i perd el codó de STOP? Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 16 Rescat de ribosomes bloquejats i control de qualitat pel tmRNA Durant el cicle de vida d'un bacteri, alguns transcrits d'mRNA poden patir trencaments o degradacions prematures des de l'extrem 3' mitjançant ribonucleases (sobre l'estabilitat del mRNA bacterià i l'acció de la RNasa E, vegeu «Regulació post-transcripcional — Estabilitat del mRNA i autoregulació ribosòmica»).

Quan un ribosoma tradueix un transcrit escapçat que no conté un codó de STOP, arriba al final de la molècula sense poder reclutar els factors d'alliberament. Com a resultat, la maquinària de traducció queda encallada: el ribosoma no es desprèn i la cadena polipeptídica truncada no s'allibera, provocant un bloqueig que redueix el conjunt de ribosomes disponibles per a la cèl·lula. Per resoldre aquesta fallida, els bacteris utilitzen una molècula bifuncional anomenada tmRNA. Aquest RNA híbrid disposa d'un domini amb estructura de tRNA i d'un altre domini que actua com a mRNA amb un marc de lectura propi.

El mecanisme de rescat es desenvolupa de manera coordinada: El tmRNA, carregat prèviament amb una alanina al seu domini tRNA, ingressa al lloc A buit del ribosoma aturat. 1 L'alanina s'incorpora per enllaç peptídic a la cadena en creixement. 2 El ribosoma canvia la plantilla original pel marc de lectura intern aportat pel mateix tmRNA. 3 Es tradueix una petita pauta de lectura que afegeix una etiqueta peptídica d'uns 10 aminoàcids a l'extrem C-terminal de la proteïna truncada. 4 El segment del tmRNA finalitza en un codó d'aturada ordinari, la qual cosa permet la intervenció dels factors d'alliberament habituals, el desmuntatge de les subunitats ribosòmiques i l'emissió del pèptid anòmal.

5 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 17 Esquema del rescat de ribosomes aturats i marcatge peptídic pel tmRNA. El pèptid resultant no només queda lliure, sinó que porta el senyal precís per a la seva eliminació. La cua d'uns 10 residus aminoacídics exposada al seu extrem C-terminal actua com a senyal de reconeixement perquè les proteases bacterianes degradin immediatament el producte invàlid, evitant la formació d'agregats citoplasmàtics nocius. COMPROVA-HO 15 Quina doble conseqüència biològica aconsegueix el tmRNA quan intervé sobre un ribosoma encallat en un mRNA truncat?

Sistemes proteolítics dependents d'ATP: proteases citoplasmàtiques Lon i Clp La proteòlisi constitueix una modificació post-traduccional de caràcter irreversible fonamental per regular el recanvi proteic i eliminar polipèptids danyats o anòmals. A Escherichia coli coexisteixen unes vint proteases diferents, però aproximadament el 60% de l'activitat proteolítica dependent d'ATP recau conjuntament en dos grans sistemes: Lon i la família Clp. Les proteïnes reguladores i les que intervenen en la replicació solen tenir vides mitjanes curtes. Això garanteix que la seva concentració s'adapti ràpidament als canvis ambientals.

Quan una proteïna es desnaturalitza o es plega malament a causa de situacions d'estrès com el xoc tèrmic, la cèl·lula pot prendre dues vies alternatives: Via de retorn: intervenció de xaperones moleculars (com DnaK, DnaJ o GroEL) que intenten restaurar la conformació nativa i funcional. Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 18 Via de degradació: encarrilament de la molècula irreversiblement danyada cap als complexos proteolítics citoplasmàtics dependents d'energia per al seu reciclatge en aminoàcids. Diagrama de la via de plegament per xaperones davant la proteòlisi cel·lular.

Aquests complexos proteics combinen dues activitats enzimàtiques complementàries: una activitat ATPàsica (que utilitza l'energia d'hidròlisi de l'ATP per desplegar el substrat i introduir-lo al canal catalític) i una activitat peptidàsica interna que trenca els enllaços peptídics. L'organització estructural varia segons l'enzim considerat: Proteasa Estructura i subunitats Activitats catalítiques Substrats destacats Lon Homooligòmer d'una sola cadena polipeptídica Totes dues activitats (ATPàsica i peptidàsica) resideixen en el mateix polipèptid Proteïnes danyades, SulA, proteïna N del fag λ, RcsA Clp (p.

ex., ClpXP, ClpAP) Complex multimeric format per subunitats diferents L'activitat ATPasa (ClpX o ClpA) està dissociada de la peptidasa central (ClpP) Pèptids etiquetats per tmRNA, σS (RpoS) mitjançant adaptadors COMPROVA-HO 16 En què es diferencia la disposició molecular de les activitats ATPasa i peptidasa entre la proteasa Lon i el complex ClpXP? Tipus de senyals de degradació: degrons i la seva exposició Perquè un substrat sigui reconegut i processat per una proteasa dependent d'ATP, cal que contingui un senyal específic anomenat degró.

Els degrons poden presentar-se en diferents modalitats segons la dinàmica estructural de la proteïna: Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 19 Degrons constitutivament exposats: seqüències situades directament a l'extrem amino o carboxi terminal d'una molècula que romanen accessibles de manera constant, fet que confereix una vida mitjana molt curta a aquests polipèptids. Degrons incorporats de manera extrínseca: senyals afegits de novo mitjançant processos com el marcatge pel tmRNA, que afegeix l'etiqueta C-terminal exclusivament a proteïnes truncades.

Degrons críptics exposats per canvi conformacional: motius de degradació situats internament que romanen amagats fins que l'associació o dissociació amb una altra proteïna o lligand indueix un reordenament de l'estructura terciària. Degrons activats per tall proteolític: senyals que requereixen una escissió endocel·lular prèvia per alliberar un nou extrem terminal accessible a la maquinària Clp o Lon. COMPROVA-HO 17 Com pot una proteïna reguladora modular la seva estabilitat si el seu degró no està situat a l'extrem terminal sinó en el seu interior?

Regulació del factor σS (RpoS) per l'adaptador RssB i antiadaptadors El factor de transcripció alternatiu σS (RpoS) és el responsable de dirigir la RNA polimerasa cap a la transcripció de gens d'estrès general i de fase estacionària. En condicions de creixement microbià exponencial, els bacteris necessiten mantenir una concentració extremadament reduïda de σS. Aquesta repressió s'executa tant a escala de traducció (on sRNAs com DsrA poden estimular la seva traducció a baixes temperatures obrint el seu RBS; vegeu «Regulació post-transcripcional — Atenuació, riboswitches i sRNA») com mitjançant una proteòlisi rigorosa.

La proteasa ClpXP és l'encarregada de degradar σS, però no pot unir-s'hi directament de forma eficient. Requereix una proteïna intermèdia coneguda com a adaptador RssB. Aquest sistema funciona mitjançant una cascada de modificacions post-traduccionals: Fosforilació de RssB: l'adaptador RssB requereix trobar-se en estat fosforilat (RssB-P) per poder unir-se amb alta afinitat a σS i escortar-lo cap al complex ClpXP per a la seva ràpida degradació. En estat desfosforilat, RssB no interacciona eficaçment amb σS.

Paper dels antiadaptadors: davant de condicions adverses com el dèficit de nutrients (manca de fosfat o de glucosa), estrès oxidatiu, xoc de magnesi o dany genòmic, la cèl·lula sintetitza petites proteïnes anomenades antiadaptadors (com ara IraP, IraD o IraM). Aquests antiadaptadors s'uneixen directament a RssB, competint amb σS i segrestant l'adaptador. En quedar immobilitzat RssB, σS deixa de ser lliurat a ClpXP, la seva degradació cau en picat i la seva concentració citoplasmàtica s'eleva per engegar els gens de resistència. COMPROVA-HO 18 Què succeeix amb els nivells cel·lulars de σS si s'expressa l'antiadaptador IraP durant una carència de nutrients?

Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 20 Control proteolític de la resposta SOS: LexA i SulA La integritat del genoma bacterià està vigilada pel sistema SOS, un mecanisme que respon davant de danys que comprometen la replicació del DNA. Aquest circuit està sota el control rígid de dos processos proteolítics diferenciats. En absència de danys genòmics, el repressor transcripcional LexA es manté unit als operadors d'uns 30 gens del reguló SOS, impedint-ne la transcripció. Quan un agent genotòxic (com la radiació ultraviolada o els radicals oxidants) produeix lesions al DNA, la forqueta de replicació s'atura i deixa regions extenses de DNA de cadena senzilla (ssDNA).

La proteïna RecA polimeritza ràpidament al voltant d'aquests filaments de ssDNA formant una nucleoproteïna activa coneguda com a RecA*. RecA* no és pròpiament una proteasa convencional, sinó un cofactor que estimula l'autocivatge proteolític de LexA. En fragmentar-se, LexA perd la seva capacitat repressor i es dissocia dels promotors, permetent l'expressió coordinada de tots els gens del reguló SOS dedicats a la reparació de l'ADN. Entre els productes induïts pel reguló SOS es troba el gen sulA. La missió cel·lular de SulA és aturar immediatament la divisió mentre s'estan esmenant les anomalies cromosòmiques, evitant que una cèl·lula filla hereti material genètic truncat o letalment mutat.

Esquema del circuit de la resposta SOS i degradació de LexA i SulA. Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 21 ERROR FREQÜENT No confonguis la funció de SulA amb la degradació mecànica de l'anell contràctil: SulA mai hidrolitza ni destrueix FtsZ. El que fa és segrestar FtsZ i inhibir la seva capacitat de polimerització. L'enzim que realitza la hidròlisi proteolítica és la proteasa Lon, que degrada específicament SulA quan s'ha completat la reparació de l'ADN, permetent que FtsZ torni a acoblar-se en l'anell de divisió. Un cop el DNA ha estat reparat, desapareixen els fragments de cadena senzilla i la proteïna RecA recupera el seu estat monomèric inactiu.

LexA intacte es torna a acumular i restableix la repressió transcripcional dels operons SOS. En aquest moment decisiu, la proteïna Lon reconeix i degrada SulA, alliberant els monòmers de FtsZ perquè polimeritzin de nou i restaurin la divisió bacteriana. COMPROVA-HO 19 Com s'elimina la inhibició sobre la divisió cel·lular un cop reparat el dany genòmic en el sistema SOS?

ESQUEMA Mecanismes d'exposició de degrons a proteïnes Constitutius Permanents als extrems N o C terminal Extrínsecs Inserits per maquinàries com tmRNA Condicionals Exposats per canvis moleculars Canvi conformacional Descoberts per interaccions proteiques Tall proteolític Alliberats per escissió prèvia d'un segment Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 22 PROCÉS Destí de σS segons les condicions de creixement IDEES CLAU El tmRNA actua com a tRNA i com a mRNA per alliberar ribosomes aturats en transcrits sense codó de STOP, marcant el pèptid incomplet amb una etiqueta C-terminal d'uns 10 aminoàcids. A E.

coli, Lon i els complexos Clp representen el 60% de l'activitat proteolítica dependent d'ATP citoplasmàtica. Mentre que Lon integra les activitats ATPasa i peptidasa en la mateixa proteïna, Clp separa aquestes funcions en subunitats independents com ClpX i ClpP. L'adaptador RssB requereix estar fosforilat per guiar σS (RpoS) a la degradació per ClpXP, procés que els antiadaptadors inhibeixen en condicions d'estrès. La resposta SOS desencadena l'autocivatge de LexA estimulat per RecA*, alliberant l'expressió de SulA que inhibeix FtsZ fins que Lon la degrada. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 20. Per què és indispensable que el tmRNA contingui un codó de parada propi? 21.

De quina manera modulen els antiadaptadors com IraP la resposta a la manca de nutrients? 22. Quin paper executa la proteasa Lon en finalitzar la resposta SOS al dany genètic? Fase exponencial RssB es fosforila activament 1 Captura de σS RssB-P s'uneix amb afinitat alta a σS 2 Degradació per ClpXP σS és destruït i els nivells cauen 3 Senyal d'estrès Expressió d'antiadaptadors com IraP, IraD o IraM 4 Segrest de RssB L'antiadaptador bloqueja RssB 5 Acumulació de σS σS queda estable i activa gens d'estrès 6 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 23 Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 23.

Quina és la vida mitjana aproximada del mRNA a Escherichia coli a 37 ºC? 24. Quants nucleòtids a l'extrem 5' necessita com a mínim la RNasa E per poder tallar el RNA? 25. Quin percentatge de mRNA d'E. coli presenta una cua de poli(A) afegida després de la transcripció? 26. On s'uneix la proteïna ribosomal reguladora quan no hi ha rRNA disponible? 27. Com actua la proteïna TRAP activada sobre l'operó trp a Bacillus? 28. Quin canvi estructural pateix el termosensor de prfA a Listeria a 37 ºC? 29. Sota condicions de deficiència de ferro (Fe2+ baix), què succeeix amb RyhB i sodB? 30. Quin és el mecanisme pel qual MicF redueix els nivells de la porina OmpF?

12 segons a) 40 minuts b) 40 segons c) 4 hores d) Cap nucleòtid a) 2 nucleòtids b) 4 nucleòtids c) 10 nucleòtids d) 50% a) 0% b) 1-2% c) 95-100% d) Al promotor del DNA a) A la regió 5' UTR del seu mRNA b) A la subunitat 30S c) A la cua de poliA d) Inactiva per fosforilació el ribosoma bacterià a) Estimula la unió del ribosoma a trpE b) Degrada directament l'enzim TrpE al citoplasma c) S'uneix a l'mRNA segrestant el RBS de trpE d) Es forma una forquilla que bloqueja el RBS a) S'aparella amb un sRNA antisentit inhibidor b) S'associa al factor Hfq per ser degradat c) Es fon l'estructura secundària alliberant el RBS d) RyhB no s'expressa i sodB es tradueix ràpidament a) Fur s'inactiva, s'expressa RyhB i sodB es degrada b) Fur reprimeix RyhB i sodB s'acumula c) RyhB activa la traducció de sodB directament d) S'aparella al 5' UTR d'ompF segrestant el RBS a) Indueix la proteòlisi d'OmpF per la proteasa Lon b) Fosforila la proteïna OmpF a la membrana c) Bloqueja directament la cinasa sensor EnvZ d) Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 24 31.

Quin aminoàcid aporta inicialment el tmRNA al ribosoma aturat abans de traduir la seva pauta? 32. Quina condició és necessària perquè RssB interaccioni amb σS i el condueixi a ClpXP? 33. Quin és el mecanisme d'acció exacte de la proteïna SulA durant la resposta SOS? 34. Quin percentatge aproximat de la proteòlisi dependent d'ATP a E. coli és atribuïble a Lon i Clp?

Alanina a) Metionina b) Glicina c) Serina d) Estar desfosforilat a) Estar fosforilat b) Unir-se a un antiadaptador c) Formar un dímer amb LexA d) Degrada la proteasa Lon a) Hidrolitza les subunitats de FtsZ b) Promou l'autocivatge de LexA c) Inhibeix la polimerització de FtsZ d) El 95% a) El 30% b) El 60% c) El 10% d) Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 25 4 Repressió per catabòlit i resposta restrictiva EN ACABAR SABRÀS Distingir operó, reguló i moduló segons el seu nivell d'integració transcripcional. Explicar el mecanisme de repressió per catabòlit i exclusió de l'inductor per EIIA a E. coli. Comparar el control per carboni a E. coli (CRP-cAMP) amb el de B.

subtilis (CcpA-HPr). Analitzar l'activació diferencial de RelA i SpoT i l'efecte de ppGpp sobre la RNA polimerasa. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 35 Com aconsegueix un bacteri aturar ràpidament la producció de ribosomes i activar gens de supervivència davant la inanició sobtada d'aminoàcids? La regulació global constitueix el nivell d'integració més alt en el control de l'expressió gènica bacteriana, coordinant xarxes senceres de gens davant de canvis ambientals dràstics.

ESQUEMA Nivells d'integració transcripcional bacteriana Jerarquia de control genètic: operó, reguló i moduló Per entendre la coordinació transcripcional bacteriana cal distingir tres nivells d'organització estructural i funcional: Operó: grup de gens contigus codificats sota una única unitat transcripcional i regulats de manera coordinada. Solen codificar enzims d'una mateixa ruta metabòlica (com els gens de l'operó de la lactosa). Reguló: conjunt d'operons físicament separats que es troben sota el control de la mateixa proteïna reguladora.

Per exemple, el reguló del glicerol en Escherichia coli comprèn quatre operons Regulació global 4 Repressió per catabòlit i resposta restrictiva 5 Sistemes de dos components i regulació del metabolisme del nitrogen Operó Gens contigus cotranscrits Reguló Operons dispersos amb un mateix regulador Moduló Regulons i operons sota un regulador global Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 26 diferents (responsables del transport i catabolisme tant en condicions aeròbiques com anaeròbiques) tots controlats pel repressor GlpR. Moduló: conjunt ampli d'operons i regulons independents que comparteixen un regulador global comú, superposat als seus controls individuals.

El sistema CRP-cAMP n'és el prototip clàssic. DEFINICIÓ Un regulador global coordina desenes o centenars de transcrits diferents. La inactivació o mutació d'un gen regulador global produeix un efecte pleiotròpic, és a dir, altera simultàniament múltiples fenotips aparentment no relacionats. COMPROVA-HO 36 En què es diferencia fonamentalment un reguló d'un moduló? Repressió per catabòlit en Escherichia coli Quan un bacteri com E. coli disposa de diverses fonts de carboni, selecciona prioritàriament la més eficient des del punt de vista energètic: la glucosa.

La presència de glucosa provoca la inhibició de la transcripció dels operons que degraden substrats alternatius menys rendibles (com ara la lactosa, la galactosa, la maltosa o el glicerol). Aquest fenomen es coneix històricament com a efecte glucosa o repressió per catabòlit. Mecanisme molecular: el complex CRP-cAMP i el sistema PTS El control depèn de la concentració intracel·lular del nucleòtid cíclic adenosina 3',5'-monofosfat (cAMP), sintetitzat per l'enzim citoplasmàtic adenilat ciclasa (o adenil ciclasa) a la cara interna de la membrana a partir d'ATP. El cAMP funciona com una alarmona (un senyal químic intracel·lular d'estrès nutricional).

La proteïna activadora del catabolisme (CRP, de l'anglès Catabolite Repressor Protein, o CAP) és un dímer constitutiu que només adquireix capacitat d'unió al DNA quan s'associa amb cAMP. L'activitat de l'adenilat ciclasa està directament acoblada a l'estat de fosforilació del sistema de fosfotransferasa dependent de fosfoenolpiruvat (sistema PTS): Transport actiu de glucosa (elevada glucosa): el transport per translocació de grup requereix la transferència continuada de fosfats des del PEP passant per EI, HPr, EIIA i EIIB fins a la glucosa entrant (que esdevé glucosa-6-fosfat). Això fa que l'enzim IIA romangui no fosforilat.

En aquest estat, l'enzim IIA desfosforilat interactua físicament amb l'adenilat ciclasa i la inhibeix. Els nivells de cAMP baixen dràsticament i CRP roman inactiu. 1 Esgotament de la glucosa: en aturar-se el flux de transport, el fosfat cedit pel PEP no té acceptor glucídic i queda retingut a la cascada. L'enzim IIA s'acumula en la seva forma fosforilada ( ), la qual deixa d'inhibir l'adenilat ciclasa. L'enzim sintetitza cAMP, que s'uneix a CRP. El complex CRP-cAMP s'associa a seqüències consens riques en motius conservats als promotors diana, corba el DNA i facilita el reclutament de la RNA polimerasa, activant la transcripció dels gens catabòlics alternatius.

2 IIA-P Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 27 Esquema del control de l'adenilat ciclasa segons la fosforilació d'EIIA. Exclusió de l'inductor i creixement diàuxic L'enzim IIA no fosforilat no només inhibeix l'adenilat ciclasa, sinó que també s'uneix directament a permeases i transportadors específics d'altres sucres (com la permeasa LacY per a la lactosa, MalK per a la maltosa, o la glicerol quinasa GlpK), impedint-ne el funcionament. Aquest blocatge directe del transport rep el nom d'exclusió de l'inductor: impedeix que la cèl·lula interioritzi el substrat inductor secundari mentre hi hagi glucosa mediambiental. Quan es cultiva E.

coli amb una barreja de glucosa i lactosa, s'obté una corba de creixement diàuxic: una primera fase de creixement exponencial ràpid a càrrec de la glucosa, seguida d'una fase de latència o aturada transitòria (on la cèl·lula transcriu i tradueix els operons necessaris, especialment la -galactosidasa), i una segona fase exponencial amb un pendent inferior a causa del menor rendiment metabòlic del substrat secundari. ERROR FREQÜENT Confondre quin enzim IIA activa o inhibeix la transcripció: la forma no fosforilada d'EIIA és la que inhibeix tant l'adenilat ciclasa com les permeases alternatives (provocant l'exclusió de l'inductor).

Només quan EIIA està fosforilat (perquè manca glucosa) cessa aquesta inhibició i augmenta el cAMP. β Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 28 COMPROVA-HO 37 Quina conseqüència mecànica té l'acumulació d'enzim IIA desfosforilat sobre l'operó de la lactosa? Repressió catabòlica per carboni (CCR) a Bacillus subtilis En els bacteris Gram-positius, com Bacillus subtilis, no s'utilitza el complex CRP-cAMP. Tot i això, disposen d'un mecanisme anàleg anomenat repressió catabòlica per carboni (CCR, de l'anglès Carbon Catabolite Repression), mediat pel repressor transcripcional CcpA (Catabolite Control Protein A) i la proteïna HPr.

Esquema del mecanisme de repressió CCR per CcpA-HPr a Bacillus subtilis. La proteïna HPr de Gram-positius té dos residus clau de fosforilació amb funcions completament divergents segons l'estat energètic de la cèl·lula: Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 29 Condició metabòlica Lloc de fosforilació d'HPr Enzim implicat Efecte molecular Excés de glucosa (elevats [ATP] i [Fructosa-1,6- bisfosfat]) Serina 46 (Ser46) HPrK (HPr quinasa) utilitzant ATP HPr-(Ser-P) s'uneix al repressor CcpA; el complex s'uneix als elements cre del DNA i reprimeix operons catabòlics.

Manca de glucosa (elevat [Pi] i baix [ATP]) Histidina 15 (His15) Enzim I (EI) del sistema PTS a partir de PEP HPr-(His-P) cedeix fosfat per al transport i fosforilació d'altres sucres (fructosa, cel·lobiosa, mannitol) i activa reguladors per fosforilació. Quan la concentració d'ATP disminueix i s'acumula fosfat inorgànic ( ), l'enzim bifuncional HPrK/P actua com a fosforilasa/fosfatasa, desfosforilant la Ser46 d'HPr i dissolent el complex repressor CcpA- HPr. COMPROVA-HO 38 Quina és la diferència funcional entre fosforilar HPr a la Ser46 o a la His15 en B. subtilis?

La resposta restrictiva i l'alarmona ppGpp Quan la cèl·lula s'enfronta a una privació sobtada de nutrients (manutenció o canvi sobtat d'un medi ric a un medi mínim, anomenat shift-down), s'activa un programa d'emergència anomenat resposta restrictiva o resposta restringent (stringent response). Aquest procés està orquestrat per l'alarmona guanosina tetrafosfat (ppGpp) i la seva variant pentafosfatada (pppGpp), anomenades col·lectivament (p)ppGpp. Durant el xoc nutricional, la síntesi de noves proteïnes s'atura per falta d'aminoàcids lliures, la qual cosa provoca una ràpida acumulació de ppGpp.

Aquesta alarmona atura la transcripció d'RNAs estables (rRNA i tRNA), inhibeix la divisió cel·lular, el transport actiu i la iniciació de la replicació del DNA, mentre estimula rutes per pal·liar la inanició (com la biosíntesi d'aminoàcids, la proteòlisi cel·lular per reciclar residus i factors sigma de fase estacionària). Diferències funcionals entre RelA i SpoT En Escherichia coli, la concentració intracel·lular de ppGpp està determinada per dos enzims codificats per gens independents: P i Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 30 Diagrama de les vies diferencials de síntesi de ppGpp per RelA i SpoT. RelA: proteïna monifuncional associada directament al ribosoma.

Quan un ribosoma en procés de traducció s'atura perquè al seu lloc A entra un tRNA desacil·lat (manca d'aminoàcid), RelA s'activa i sintetitza pppGpp i ppGpp transferint un grup pirofosfat d'un ATP a un GTP o GDP. SpoT: enzim bifuncional capaç tant de sintetitzar com d'hidrolitzar ppGpp. SpoT respon a carències nutricionals diverses independents de l'aturada ribosòmica: limitació de fosfat, ferro, carboni o àcids grassos. En cas de dèficit de lípids, la proteïna transportadora de grups acil (ACP, Acyl Carrier Protein) pateix una transició conformacional i interacciona directament amb SpoT, desplaçant el seu equilibri cap a la síntesi d'alarmona.

Quan els nivells de nutrients tornen a ser suficients, la seva activitat hidrolasa degrada el ppGpp a GDP i pirofosfat. Com que RelA i SpoT són proteïnes funcionalment complementàries, per obtenir una soca completament mancada de ppGpp ( ) cal eliminar mitjançant mutació ambdós gens simultàniament. EXEMPLE Si un cultiu d'E. coli es tracta amb un inhibidor químic de la síntesi d'àcids grassos, RelA no detectarà cap anomalia perquè els nivells d'aminoacil-tRNA són correctes. En canvi, l'acumulació d'ACP desacilat activarà l'activitat sintetasa de SpoT, incrementant els nivells de ppGpp i desencadenant la resposta restrictiva.

ppGpp0 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 31 COMPROVA-HO 39 Quina diferència bàsica hi ha entre el senyal que activa RelA i el que activa SpoT? Mecanisme d'acció de ppGpp: redistribució de la RNA polimerasa L'alarmona ppGpp no actua com un factor de transcripció convencional unint-se al DNA, sinó que s'uneix directament al complex central de la RNA polimerasa (RNAP).

Aquesta unió altera l'afinitat de la polimerasa pels promotors i modifica l'equilibri global transcripcional mitjançant dos models complementaris: Model basat en l'estabilitat del complex obert: els operons d'RNA ribosòmic (rrn) tenen promotors molt ràpids i eficients, però formen complexos oberts extremadament inestables dependents d'elevades concentracions intracel·lulars d'ATP i GTP per iniciar la transcripció. La unió de ppGpp desestabilitza encara més aquests complexos oberts, bloquejant la transcripció dels gens rrn. La polimerasa alliberada passa a tenir afinitat per promotors amb complexos oberts estables, com els de les rutes biosintètiques d'aminoàcids.

Model de competència per factors sigma alternatius: en condicions de creixement òptim, la major part de la RNAP està segrestada als promotors dependents del factor vegetatiu majoritari . La inhibició de la transcripció massiva de gens de creixement per part del ppGpp allibera un fons comú (pool) de polimerasa lliure, que ara pot ser reclutada de manera competitiva per factors alternatius d'estrès, especialment , per transcriure gens de fase estacionària i supervivència. Aquesta reprogramació transcripcional permet al bacteri passar en qüestió de minuts d'un programa dedicat al creixement i la proliferació cap a un perfil defensiu destinat al manteniment cel·lular.

IDEES CLAU Un operó és una unitat policistrònica, un reguló comprèn diversos operons coordinats pel mateix regulador específic, i un moduló agrupa operons i regulons controlats per un regulador global comú. A E. coli, la captació de glucosa manté l'enzim IIA desfosforilat, impedint la síntesi de cAMP i blocant el transport d'altres inductors (exclusió de l'inductor). A B. subtilis, la repressió catabòlica és orquestrada pel repressor CcpA en unir-se a HPr fosforilat en Ser46 per la quinasa HPrK. La resposta restrictiva respon a la inanició mitjançant l'acumulació de l'alarmona ppGpp, sintetitzada per RelA (ribosomes aturats) i SpoT (estrès per nutrients o lípids).

El ppGpp s'uneix a la RNA polimerasa i redirigeix la seva activitat: inhibeix operons rrn inestables i allibera enzim per a la unió de factors sigma alternatius com . σ70 σ σ (RpoS) S σS Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 32 COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 40. Per quina raó l'enzim IIA no fosforilat provoca el fenomen de l'exclusió de l'inductor a E. coli? 41. Com aconsegueix la cèl·lula bacteriana eliminar el ppGpp quan se superen les condicions d'estrès nutricional? 42. Per què els operons que codifiquen rRNA (rrn) són els més afectats negativament per la unió de ppGpp a la RNA polimerasa?

REGULACIÓ GLOBAL 5 Sistemes de dos components i regulació del metabolisme del nitrogen EN ACABAR SABRÀS Distingir els components d'un sistema de transducció de senyals de dos components bacterià. Explicar com el quocient alfa-cetoglutarat/glutamina governa l'estat d'uridilació de PII i l'adenilació de la GS. Descriure el mecanisme d'activació transcripcional pel factor sigma 54 i NtrC-P al promotor glnAp2. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 43 Com sap un bacteri si li falta nitrogen observant només el seu metabolisme intermediari intern? Principis de la transducció de senyals per dos components Els bacteris responen als canvis de l'entorn mitjançant circuits clau anomenats sistemes de dos components.

Aquest mòdul bàsic de senyalització consta de dues proteïnes coordinades per transferència de grups fosfat: Histidina quinasa sensora: habitualment integrada a la membrana cel·lular. Conté un domini d'unió que reconeix un senyal ambiental concret. En detectar l'estímul, s'autofosforila a costa d'ATP en un residu d'histidina. Regulador de resposta efector: localitzat generalment al citoplasma. Rep el grup fosfat de la quinasa en un residu d'aspartat. En fosforilar-se, canvia de conformació i actua sobre l'expressió gènica, comportant-se com a activador o repressor transcripcional.

Sistema Senyal ambiental Histidina quinasa Regulador de resposta Funció transcripcional Arc ArcB ArcA Repressor / Activador O 2 Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 33 Sistema Senyal ambiental Histidina quinasa Regulador de resposta Funció transcripcional Nar Nitrat i nitrit NarX i NarQ NarL / NarP Activador / Repressor Pho Fosfat inorgànic limitant PhoR PhoB Activador Porines Pressió osmòtica EnvZ OmpR Activador / Repressor Ntr Limitació de NtrB ( ) NtrC ( ) Activador ( ) PER RECORDAR-HO Tot i que l'esquema clàssic situa la histidina quinasa a la membrana, en el sistema d'utilització de nitrogen (Ntr) tant NtrB com NtrC són proteïnes completament solubles i citoplasmàtiques.

El senyal no prové del medi extern, sinó de l'estat metabòlic intern de la cèl·lula. COMPROVA-HO 44 En què es diferencia l'arquitectura cel·lular del sistema NtrB-NtrC respecte a sistemes clàssics com EnvZ-OmpR? La glutamina sintetasa i la seva regulació al·lostèrica La glutamina sintetasa (GS), codificada pel gen glnA, és una peça central del metabolisme del nitrogen en Escherichia coli. És un complex multimèric de grans dimensions format per 12 subunitats que catalitza la conversió de glutamat i amoni en glutamina consumint ATP. La seva funció és imprescindible quan la concentració intracel·lular d' és deficient.

Aquest enzim es troba sotmès a un control extremadament precís que opera a tres nivells integrats: retroalimentació al·lostèrica acumulativa, regulació per modificació covalent i control genètic de la seva síntesi. El primer nivell consisteix en una retroalimentació negativa acumulativa: múltiples compostos derivats del nitrogen (com glutamina, triptòfan, histidina, carbamoïl-fosfat, AMP i CTP) s'uneixen cadascun a llocs al·lostèrics específics de les subunitats de la GS. L'efecte inhibidor de cada producte final és independent i s'acumula, de manera que la inhibició total augmenta progressivament a mesura que puja la càrrega de múltiples metabòlits nitrogenats.

Control covalent: cascades d'adenilació i d'uridilació de PII El segon nivell de control de la GS consisteix en una modificació covalent reversible: la transferència o alliberament d'AMP sobre un residu de tirosina de cadascuna de les 12 subunitats. Aquesta reacció és catalitzada per l'adenililtransferasa (ATasa, codificada per glnE), un enzim bifuncional que conté dominis moleculars separats per adenilar i deadenilar. NH 4 + NR II NR I RNApol σ54 NH 4 + Regulació Gènica, Defensa i Quorum Sensing Bacterià 34 Esquema del cicle d'adenilació de GS i d'uridilació de PII.

La direcció d'activitat de l'ATasa està subordinada a la petita proteïna reguladora PII (codificada per glnB), la qual al seu torn pateix una altra modificació covalent mitjançant un cicle d'uridilació: ERROR FREQÜENT Confondre quin enzim fa cada modificació covalent. Recorda que GlnD s'encarrega d'afegir o treure UMP a la proteïna senyal PII, mentre que GlnE (l'ATasa) afegeix o treu AMP directament a la glutamina sintetasa. No és PII qui adenila la GS, sinó qui activa el domini corresponent de GlnE. Avaluació del…