Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB

I 0 flashcards i 10 preguntes més al document.

Text del document

APUNTS BIOLOGIA MOLECULAR I CEL·LULAR DELS MICROORGANISMES Grau en Biotecnologia Universitat de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apunts complets de Biologia Molecular i Cel·lular dels Microorganismes: adaptació a l'estrès ambiental, cinètica enzimàtica i regulació transcripcional.

APREN.AI Índex Paràmetres ambientals 1 Temperatura i adaptacions bacterianes Biofísica del creixement: temperatures cardinals i equació d'Arrhenius Classificació fisiològica i adaptacions estructurals Resposta al xoc tèrmic citoplasmàtic: el circuit de sigma-32 (rpoH) Resposta a l'estrès periplasmàtic: l'eix RseA-RseB i sigma-E Adaptació al fred i aplicacions en enginyeria molecular 2 Resposta a l'oxigen, osmolaritat, pH i pressió Classificació fisiològica segons la dependència d'oxigen Jerarquia d'acceptors d'electrons i reorganització metabòlica Sistemes de control de la respiració: ArcAB, FNR i NarXL Osmolaritat, activitat d'aigua i adaptació hiperosmòtica bifàsica Regulació de les porines de membrana externa pel sistema EnvZ/OmpR Homeòstasi del pH: antiports i descarboxilació d'aminoàcids Resposta a la pressió hidrostàtica: barosensibilitat i barofília Regulació enzimàtica 3 Control al·lostèric en rutes anabòliques i catabòliques Nivells de regulació i cinètica al·lostèrica Control al·lostèric en rutes anabòliques lineals: l'ATCasa Estratègies de regulació en vies anabòliques ramificades Regulació del catabolisme central i càrrega energètica cel·lular 4 Modulació covalent reversible i sistemes sensorials 1.

Modulació per adenilació: el complex regulador de la glutamina sintetasa 2. Fosforilació reversible en rutes centrals i transport 3. Quimiotaxi a Escherichia coli: fosforilació i metilació adaptativa 4.

Regulació per acetilació reversible: el cas de la citrat liasa Regulació transcripcional 5 Arquitectura de l'operó, promotors i maquinària transcripcional Arquitectura de l'operó i nivells d'integració gènica Gens no codificants de proteïna: operons rrn i sRNAs La maquinària transcripcional: estructura i cicle de la RNA polimerasa Mecanismes de terminació de la transcripció Estratègies generals de regulació de la transcripció 6 L'operó de la lactosa i la repressió pel catabòlit Estructura genètica i control negatiu induïble de l'operó lac Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 1 Cinètica de creixement diàuxic Mecanisme de repressió pel catabòlit: el sistema PTS i el complex CAP-AMPc Integració de senyals i expressió basal 7 L'operó triptòfan i mecanismes d'atenuació L'operó triptòfan i el control negatiu reprimible El descobriment de l'atenuació i l'acoblament transcripció-traducció Anatomia de la regió líder 5'-UTR i dinàmica de forquetes Regulació pas a pas: escassetat contra abundància de triptòfan L'atenuació com a estratègia general en altres operons d'aminoàcids Atenuació regulada per la proteïna TRAP a Bacillus subtilis 8 Control positiu per bucle d'ADN a l'operó Ara i activadors a distància (enhancers) Arquitectura de l'operó ara i el caràcter bimodal del regulador AraC El mecanisme de bucle d'ADN i la transició conformacional d'AraC Elements activadors a distància (enhancers) en procariotes El factor sigma-54 i el requeriment bioenergètic del sistema NtrB-NtrC 9 Metilació epigenètica del DNA, factors sigma i circuits de diferenciació Regulació epigenètica per metilació del DNA Factors sigma d'Escherichia coli i especificitat de promotors Diferenciació cel·lular a Bacillus subtilis: la cascada d'esporulació El mecanisme de retard cromosòmic i l'activació compartimentada 10 Reordenament d'ADN i interruptors de RNA (riboswitches) Variació de fase i recombinació específica de lloc Interruptors de RNA (riboswitches) en el control de l'elongació Regulació per tRNA: el mecanisme de la caixa T (T-box) Riboswitches sensors de metabòlits i economia transcripcional 11 Resum per repassar Paràmetres ambientals i respostes d'estrès Regulació de l'activitat enzimàtica Regulació transcripcional: operons i maquinària Mecanismes avançats de control gènic i epigenètica Solucions de les preguntes de repàs Aquests apunts poden contenir errors o omissions.

Són un material de suport i no substitueixen el temari oficial ni el professorat: contrasta la informació important. Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 2 1 Temperatura i adaptacions bacterianes EN ACABAR SABRÀS Distingir les tres temperatures cardinals i analitzar la corba de creixement segons el model d'Arrhenius. Comparar les adaptacions moleculars de lípids i proteïnes en bacteris psicròfils, mesòfils i termòfils. Descriure el mecanisme d'activació transcripcional del factor sigma-32 durant el xoc tèrmic citoplasmàtic. Explicar la cascada sensorial de membrana de sigma-E davant del dany proteic a l'espai periplasmàtic.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 1 Com pot saber un bacteri que la temperatura ha pujat si no disposa de sistema nerviós ni receptors sensorials complexos? Els microorganismes no poden regular activament la seva temperatura interna. Per aquest motiu, qualsevol fluctuació tèrmica de l'entorn incideix directament sobre la cinètica de les reaccions bioquímiques i la integritat estructural de les seves macromolècules.

Paràmetres ambientals 1 Temperatura i adaptacions bacterianes 2 Resposta a l'oxigen, osmolaritat, pH i pressió Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 3 ESQUEMA Arquitectura de les adaptacions tèrmiques bacterianes Biofísica del creixement: temperatures cardinals i equació d'Arrhenius La relació entre la velocitat de creixement bacterià i la temperatura es descriu mitjançant tres valors crítics anomenats temperatures cardinals: Temperatura mínima: per sota d'aquest límit, les membranes cel·lulars perden fluïdesa i es produeix la gelificació dels lípids. Això col·lapsa el transport de nutrients i atura el metabolisme.

Temperatura òptima: punt en què les taxes catalítiques enzimàtiques assoleixen la seva velocitat màxima, produint la taxa de proliferació més alta possible. Temperatura màxima: per sobre d'aquest llindar, es produeix la desnaturalització tèrmica de proteïnes essencials, la inactivació enzimàtica irreversible i la ruptura o lisi de la bicapa lipídica per hiperfluïdesa. L'asimetria clàssica de la corba de creixement reflecteix que la temperatura òptima se situa sempre molt més a prop de la màxima que de la mínima.

En el tram ascendent intermedi, la taxa de creixement segueix la cinètica de l'equació d'Arrhenius: Adaptacions bacterianes a la temperatura Estratègies cel·lulars i fisiològiques globals Adaptació estructural contínua Ajust permanent de macromolècules Homeoviscosita de membrana Balanç saturats/insaturats i èters Estabilitat proteica Ponts d'hidrogen i residus de prolina Respostes a l'estrès tèrmic Inducció de circuits reguladors d'emergència Circuit citoplasmàtic (sigma- 32) Termòmetre d'ARNm i xaperones DnaK Circuit periplasmàtic (sigma-E) Sensat extracitoplasmàtic via RseA/RseB k = Ae RT E a Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 4 On representa la constant de velocitat de la reacció (o la taxa de creixement bacterià), és el factor preexponencial de freqüència, l'energia d'activació, la constant dels gasos ideals i la temperatura absoluta en kèlvins.

En representar el logaritme de la taxa de creixement en funció de l'invers de la temperatura ( ), s'observa una relació lineal en condicions subòptimes. No obstant això, aquesta linealitat es perd completament als extrems a causa de la gelificació o de la desnaturalització cel·lular. A més, en condicions de medi mínim la taxa de creixement és inferior i el temps de generació superior respecte a un medi ric per a qualsevol temperatura considerada. COMPROVA-HO 2 Per què la caiguda de la taxa de creixement és molt més brusca per sobre de la temperatura òptima que per sota d'aquesta?

Classificació fisiològica i adaptacions estructurals Segons el rang de temperatures cardinals en què es desenvolupen de forma òptima, els bacteris es classifiquen en quatre grans grups ecològics: Grup fisiològic Rang òptim típic Exemples representatius Psicròfils (òptim habitual a o menor) Polaromonas vacuolata, Bacillus psychrophilus Mesòfils (òptim habitual a ) Escherichia coli, Salmonella Termòfils (creixement per sobre de ) Geobacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus Hipertermòfils (fins a ) Thermococcus celer, Pyrolobus fumarii, Pyrococcus Gràfica de taxes de creixement i temperatures cardinals en diferents grups bacterians.

Per mantenir la viabilitat cel·lular en aquests nínxols, els microorganismes modifiquen l'estabilitat de les seves proteïnes i la fluïdesa de les seves membranes cel·lulars: k A E a R T 1/T 15 C 4 C 20 45 C 37 C 55 65 C 50 C 80 105 C 113 C Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 5 Estabilització proteica a altes temperatures: augment de la densitat de ponts d'hidrogen interns, increment de residus de prolina (que redueixen la flexibilitat de la cadena polipeptídica) i col·laboració de xaperones moleculars protectores. Cal notar que els procariotes no fotosintètics presenten les temperatures màximes més altes, atesa la marcada termosensibilitat dels fotosistemes.

Homeoviscositat de la membrana: a temperatures altes, les cèl·lules incorporen àcids grassos saturats, lineals i molt empaquetats, amb lípids de major pes molecular per evitar una fluïdesa excessiva. A temperatures baixes, s'introdueixen àcids grassos insaturats amb dobles enllaços que desorganitzen l'empaquetament i preserven la flexibilitat. En arqueus hipertermòfils, la bicapa se substitueix per enllaços èter i estructures isoprenoides altament resistents. PER RECORDAR-HO A mesura que la temperatura ambiental baixa, la relació entre àcids grassos insaturats i saturats a la membrana augmenta progressivament per impedir la gelificació.

COMPROVA-HO 3 Quina modificació lipídica realitza Escherichia coli si el cultiu passa de créixer a 40 °C a fer-ho a 15 °C? Resposta al xoc tèrmic citoplasmàtic: el circuit de sigma-32 (rpoH) Quan bacteris mesòfils com E. coli experimenten un brusc ascens tèrmic (per exemple, de a ), s'activa la resposta al xoc tèrmic (HSR). Aquest mecanisme orquestra la transcripció immediata de proteïnes de xoc tèrmic mitjançant un factor alternatiu d'iniciació transcripcional (per a la funció bàsica de la maquinària transcripcional, vegeu «Regulació transcripcional — Arquitectura de l'operó, promotors i maquinària transcripcional»).

Aquesta resposta citoplasmàtica està governada pel factor sigma-32 ( o ), codificat pel gen rpoH. La seva regulació és doble (a escala de traducció i a escala posttraduccional): 30 C 42 C σH σ32 En condicions basals o baixa temperatura ( ): l'extrem 5' de l'ARNm de rpoH adopta una estructura secundària en forqueta que bloqueja la unió dels ribosomes, fent la traducció molt ineficient. A més, les poques molècules de factor que se sintetitzen són reconegudes ràpidament pel sistema xaperona DnaK/DnaJ/GrpE, el qual les segrega i les lliura a proteases cel·lulars per a la seva degradació immediata.

1 30 C σ32 En condicions de xoc tèrmic ( ): l'elevació tèrmica fon l'estructura secundària de l'ARNm de rpoH (actuant com un termòmetre d'ARN), permetent l'accés massiu dels ribosomes i disparant la traducció. Simultàniament, la calor causa la desnaturalització de nombroses proteïnes citoplasmàtiques; aquestes proteïnes desplegades recluten amb alta afinitat les xaperones DnaK/DnaJ/GrpE. En conseqüència, DnaK s'allibera de . El factor lliure s'estabilitza, s'associa al nucli (core) de la RNA polimerasa i redirigeix l'enzim cap als promotors dels gens del xoc tèrmic.

2 42 C σ32 σ32 Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 6 Esquema del control posttraduccional de sigma-32 per DnaK durant el xoc tèrmic. ERROR FREQÜENT Un error clàssic d'examen és creure que el xoc tèrmic activa la transcripció de rpoH des d'un estat reprimit. En realitat, el gen rpoH es transcriu de forma contínua; el control és purament translacional (desplegament de l'estructura secundària de l'ARNm per calor) i posttraduccional (competència per la xaperona DnaK).

Resposta a l'estrès periplasmàtic: l'eix RseA-RseB i sigma-E Quan l'estrès tèrmic afecta l'embolcall cel·lular i l'espai periplasmàtic, intervé un segon sistema sensorial mediat pel factor sigma-E ( o ), el qual respon a la desnaturalització de proteïnes extracitoplasmàtiques. σE σ24 Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 7 Diagrama de la via de senyalització periplasmàtica RseA-RseB i alliberament de sigma-E.

El circuit opera mitjançant una cascada reguladora codificada en el mateix operó (vegeu «Regulació transcripcional — Arquitectura de l'operó, promotors i maquinària transcripcional»): Estat no estressat: el factor es troba segrestat al costat citoplasmàtic de la membrana interna pel factor anti-sigma transmembrana RseA. Al seu torn, al costat periplasmàtic, la proteïna RseB s'uneix al domini periplasmàtic de RseA, estabilitzant el complex inhibidor. Activació per estrès periplasmàtic: les proteïnes desplegades al periplasma competeixen directament per RseB. RseB es dissocia de RseA per unir-se a les proteïnes alterades.

Això desencadena la degradació proteolítica de RseA i l'alliberament de al citoplasma. El factor lliure s'uneix a la RNA polimerasa per activar la transcripció de gens reparadors de l'embolcall i del seu propi operó (rpoE-rseA-rseB-rseC). COMPROVA-HO 4 Quin és el desencadenant molecular que activa sigma-E al citoplasma malgrat que el dany tèrmic es troba al periplasma? Adaptació al fred i aplicacions en enginyeria molecular Mentre que la resposta al xoc tèrmic soluciona el desplegament accidental per altes temperatures, la vida a temperatures properes a requereix maquinàries de plegament actives en condicions d'energia tèrmica mínima.

Un model fonamental és Oleispira antarctica, un bacteri psicròfil amb òptim de creixement entre 0 i 5 °C. σE σE σE 0 C Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 8 Les xaperones moleculars d'O. antarctica (Cpn60/10, homòlogues del complex GroEL/ES) conserven aproximadament un 75 % de la seva màxima activitat de renaturalització a , mentre que les xaperones de bacteris mesòfils com E. coli requereixen entorns propers a per assolir el mateix rendiment catalític. L'expressió heteròloga dels gens cpn60/10 d'O. antarctica en soques recombinants d'E.

coli permet que aquesta última multipliqui la seva velocitat de creixement a baixes temperatures, obrint camps clau per a la biotecnologia de producció de proteïnes termolàbils a escala industrial. IDEES CLAU Les temperatures cardinals (mínima, òptima i màxima) defineixen els límits biofísics del creixement bacterià i segueixen una cinètica asimètrica d'Arrhenius. L'adaptació tèrmica de les membranes requereix modular la proporció d'àcids grassos saturats davant d'insaturats per garantir l'homeoviscositat. La resposta al xoc tèrmic citoplasmàtic està regulada pel factor sigma-32 (rpoH), controlat per un termòmetre d'ARNm i per la disponibilitat del sistema xaperona DnaK/DnaJ/GrpE.

L'estrès periplasmàtic induït per calor activa el factor sigma-E mitjançant la dissociació del complex sensorial RseA-RseB provocada per proteïnes desplegades a l'embolcall. Les xaperones psicròfiles Cpn60/10 d'Oleispira antarctica mantenen una elevada capacitat de plegament a , millorant el creixement d'E. coli en fred en aplicacions biotecnològiques. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 5. Com actua l'ARNm del gen rpoH com a sensor de temperatura a la cèl·lula? 6. Quina funció mecànica compleixen els residus de prolina en les proteïnes dels organismes hipertermòfils?

PARÀMETRES AMBIENTALS 2 Resposta a l'oxigen, osmolaritat, pH i pressió EN ACABAR SABRÀS Distingir els mecanismes de regulació de la respiració coordinats per ArcAB, FNR i NarXL. Explicar la resposta bifàsica davant del xoc hiperosmòtic i la funció dels soluts osmocompatibles. Descriure el control de les porines OmpC i OmpF mitjançant el sensor EnvZ i el regulador OmpR. Analitzar l'eliminació de protons citoplasmàtics mitjançant el sistema glutamat descarboxilasa i GABA. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 7 Com pot un bacteri neutralitzar un atac àcid extrem sense bombejar protons directament cap a un gradient desfavorable?

0 C 30 C 0 C Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 9 Classificació fisiològica segons la dependència d'oxigen La capacitat dels bacteris per proliferar en presència d'oxigen molecular depèn de la seva dotació d'enzims destoxificants davant espècies reactives. Segons aquest comportament, distingim cinc categories principals: Aerobis estrictes: requereixen necessàriament oxigen per créixer i duen a terme respiració aeròbica (Micrococcus luteus). Anaerobis estrictes o obligats: l'oxigen resulta letal o tòxic a causa de la manca de defenses enzimàtiques protectores (Methanobacterium formicicum).

Anaerobis facultatius: proliferen tant en presència com en absència d'oxigen, optimitzant les seves rutes metabòliques en funció de les condicions (Escherichia coli). Microaeròfils: necessiten oxigen per respirar però toleren només concentracions inferiors a les de l'atmosfera (Spirillum volutans). Aerotolerants: no utilitzen l'oxigen metabòlicament (fermenten sempre), però poden créixer en la seva presència gràcies a enzims com la peroxidasa en lloc de la catalasa (Streptococcus pyogenes).

Jerarquia d'acceptors d'electrons i reorganització metabòlica En bacteris anaerobis facultatius com Escherichia coli, l'ús d'acceptors finals segueix una jerarquia estricta determinada pel potencial redox: Aquesta transició energètica condiciona directament el cicle de Krebs. En condicions d'anaerobiosi estricta, la cèl·lula reprimeix l'enzim -cetoglutarat deshidrogenasa (que no té anàleg funcional sense oxigen). En canvi, el complex succinat deshidrogenasa es reemplaça funcionalment per la fumarat reductasa com a enzim terminal anaeròbic. COMPROVA-HO 8 Quina és la diferència funcional entre l'alfa-cetoglutarat deshidrogenasa i la succinat deshidrogenasa en passar a anaerobiosi?

Sistemes de control de la respiració: ArcAB, FNR i NarXL La tria de les cadenes de transport electrònic està governada per tres sistemes reguladors interconnectats: Oxigen > Nitrat > Fumarat α Sistema de dos components ArcAB (Aerobic Respiration Control): la cinasa sensora de membrana ArcB detecta l'acumulació de transportadors d'electrons reduïts quan escasseja l'oxigen. S'autofosforila i transfereix el grup fosfat al regulador transcripcional citoplasmàtic ArcA.

ArcA fosforilat reprimeix gens del cicle de Krebs (com succinat deshidrogenasa i -cetoglutarat deshidrogenasa) i reprimeix el citocrom o (d'afinitat baixa per oxigen), alhora que indueix el citocrom d (d'afinitat molt alta per oxigen). 1 α Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 10 Esquema del canvi d'estat oligomèric de FNR segons l'oxigen. Regulador FNR (Fumarate and Nitrate Reduction): actua com a sensor directe d'oxigen mitjançant centres de ferro-sofre. Sota condicions reductores o d'anòxia, conté un clúster [4Fe-4S] que promou la seva dimerització i la unió a l'ADN. L'oxigen oxida aquest centre a la forma monomèrica inactiva [2Fe-2S].

La forma dímera activa indueix la transcripció de la fumarat reductasa, la nitrat reductasa, la nitrit reductasa, la DMSO reductasa i el citocrom d, mentre reprimeix el citocrom o. 2 Sistema de dos components NarXL: davant la presència simultània de nitrat i fumarat, el sensor de membrana NarX s'activa per nitrat i transfereix el fosfat a NarL. Aquest repressor/activador indueix l'expressió de la nitrat reductasa (operó narGHIJ) i inhibeix directament l'expressió de la fumarat reductasa (operó frd), prioritzant l'acceptor més eficient. 3 Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 11 Esquema de la cascada regulatòria dels sistemes NarXL i ArcAB.

Sistema Sensor i localització Senyal percebut Diana / Efector Efecte funcional ArcAB ArcB (membrana) Transportadors reduïts a la cadena respiratòria ArcA Inhibeix enzims del cicle de Krebs i citocrom o; activa citocrom d FNR FNR (citoplasma, clúster Fe-S) Absència d'oxigen (estat reductor) FNR (dímer) Activa fumarat, nitrat, DMSO reductases; reprimeix citocrom o NarXL NarX (membrana) Presència de nitrat extracel·lular NarL Activa nitrat reductasa; reprimeix fumarat reductasa COMPROVA-HO 9 Com detecta FNR directament l'oxigen i quina conseqüència té sobre la seva unió a l'ADN?

Osmolaritat, activitat d'aigua i adaptació hiperosmòtica bifàsica L'activitat d'aigua (a_w) mesura la relació entre la pressió de vapor d'un medi i la de l'aigua pura (on ). L'acumulació de soluts redueix aquest paràmetre. Segons el requeriment de soluts, els bacteris es divideixen en no halòfils, halotolerants (com Staphylococcus aureus), halòfils (com Aliivibrio fischeri) i halòfils extrems (sovint arqueus com Halobacterium salinarum). a = w 1 Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 12 L'aigua travessa la membrana plasmàtica lliurement. En medi hipertònic, la pèrdua d'aigua condueix a la plasmòlisi o retracció citoplasmàtica.

Davant un xoc hiperosmòtic, el bacteri desplega una resposta en dues etapes consecutives: PROCÉS Resposta temporal bacteriana a l'estrès hiperosmòtic Regulació de les porines de membrana externa pel sistema EnvZ/OmpR La membrana externa dels bacteris gramnegatius ajusta la seva permeabilitat a través de dues porines principals: OmpF: canal de diàmetre més gran (aprox. 1,16 nm), afavorit en condicions de baixa osmolaritat per maximitzar l'entrada de nutrients. OmpC: canal de diàmetre més reduït (aprox. 1,08 nm), afavorit sota alta osmolaritat per frenar l'entrada de soluts o tòxics. El control transcripcional el realitza el sistema de dos components EnvZ/OmpR.

A osmolaritat alta, la cinasa sensora EnvZ incrementa la fosforilació del regulador citoplasmàtic OmpR. Concentracions altes d'OmpR-P activen la transcripció del gen ompC i reprimeixen la del gen ompF. A osmolaritat baixa, els nivells baixos d'OmpR fosforilat activen exclusivament ompF.

Xoc hiperosmòtic Augment sobtat de soluts al medi extern 1 Entrada ràpida de K+ Importació massiva per transportadors Kdp, Trk i Kup 2 Síntesi de glutamat Acumulació d'anions com a contraió neutralitzador 3 Síntesi d'osmòlits Producció de prolina, trehalosa o betaïna 4 Substitució de sals Reemplaçament de K-glutamat per protegir el metabolisme 5 Resposta primària ràpida: importació immediata de cations K^+ a través de transportadors constitutius i induïbles (Kdp, Trk, Kup). Com que la càrrega positiva alteraria greument el potencial cel·lular, s'acumula de manera coordinada l'anió glutamat com a contraió neutralitzador.

1 Resposta secundària sostinguda: la concentració elevada de sal K-glutamat resulta tòxica per a la fisiologia cel·lular a llarg termini. La cèl·lula substitueix gradualment aquests ions per soluts osmocompatibles (compostos orgànics neutres que no interfereixen amb el plegament macromolecular). Entre ells destaquen la prolina, la betaïna, l'ectoïna, la trehalosa, el glicerol, la sacarosa i el dimetilsulfopropionat.

2 Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 13 ERROR FREQÜENT Confondre el diàmetre de les porines amb la concentració osmòtica que les indueix: recordar que a alta osmolaritat cal protegir la cèl·lula amb el porus petit (OmpC), mentre que a baixa osmolaritat s'expressa el porus gran (OmpF). COMPROVA-HO 10 Quina porina s'expressarà preferentment quan OmpR assoleixi una elevada taxa de fosforilació per EnvZ?

Homeòstasi del pH: antiports i descarboxilació d'aminoàcids Mentre que l'entorn extracel·lular pot oscil·lar entre valors extrems (des d'hàbitats àcids amb pH 1-2 fins a alcalins amb pH 9-11), el citoplasma bacterià manté sempre un pH al voltant de la neutralitat ( , generalment 7,5-7,8). Per mantenir aquesta estabilitat, el bacteri utilitza mecanismes actius segons el medi: Diagrama dels mecanismes de transport i descarboxilació per a l'homeòstasi de pH. Sota estrès alcalí moderat: es posa en marxa l'antiportador , que capta protons externs cap al citoplasma a canvi de sodi. Sota estrès àcid moderat: s'activen antiports com per expulsar protons intracel·lulars en excés.

pH 5 8 Na /H + + K /H + + Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 14 Sota estrès àcid extrem (pH 2-3): actua el sistema de descarboxilases d'aminoàcids associades a transportadors antiport. A E. coli, l'enzim citoplasmàtic glutamat descarboxilasa (GadD) consumeix un protó ( ) en descarboxilar l'aminoàcid glutamat, transformant-lo en àcid gamma-aminobutíric (GABA) i desprenent . L'antiportador membranari GadT importa glutamat extern i exporta GABA, consumint de manera neta un protó citoplasmàtic per cada cicle d'intercanvi. Mecanismes idèntics operen amb la lisina (formant cadaverina) i l'ornitina (formant putrescina).

Resposta a la pressió hidrostàtica: barosensibilitat i barofília La pressió hidrostàtica condiciona la taxa de creixement i la integritat cel·lular en ambients marins profunds, on la pressió creix a raó d'1 atm per cada 10 metres de fondària: Barosensibles: bacteris el creixement dels quals s'inhibeix quan augmenta la pressió, morint a pressions moderades. Representen la gran majoria dels microorganismes de superfície. Barotolerants: organismes capaços de créixer fins a pressions properes a les 300 atm, encara que el seu òptim se situa a pressió atmosfèrica. Baròfils: requereixen pressions hidrostàtiques d'unes 400-500 atm per assolir el seu ritme òptim de duplicació.

Baròfils extrems: organismes confinats a zones abissals amb necessitat de pressions superiors a les 600 atm per sobreviure i multiplicar-se. IDEES CLAU La jerarquia respiratòria en facultatius segueix l'ordre oxigen > nitrat > fumarat, coordinada pels sistemes ArcAB, FNR i NarXL. El regulador FNR detecta oxigen directament mitjançant la destrucció oxidativa del seu clúster actiu a inactiu. La resposta a l'estrès hiperosmòtic és bifàsica: acumulació inicial de i glutamat seguida de la síntesi de soluts osmocompatibles neutres. El sistema EnvZ/OmpR afavoreix la porina estreta OmpC a alta osmolaritat i la porina ampla OmpF a baixa osmolaritat.

Davant de condicions molt àcides, el sistema GadT/GadD neteja protons citoplasmàtics descarboxilant glutamat cap a GABA. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 11. Quin paper compleix el glutamat durant la fase primària de resposta al xoc hiperosmòtic? 12. Com aconsegueix el sistema NarXL que es prioritzi la respiració de nitrat sobre la de fumarat? 13. Com contribueix la glutamat descarboxilasa a neutralitzar el citoplasma bacterià davant d'un pH extremadament àcid? H+ CO 2 [4F e 4S] [2F e 2S] K+ Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 15 Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 14.

Quin factor activa directament la transcripció dels gens de xoc tèrmic al citoplasma d'E. coli? 15. Com mantenen la fluïdesa de membrana els bacteris quan baixa la temperatura? 16. Quina funció fa la proteïna RseB en el sistema de resposta a estrès periplasmàtic? 17. Per què s'utilitzen les xaperones d'Oleispira antarctica en biotecnologia? 18. Quin és l'estat del regulador FNR que s'uneix eficaçment al DNA? 19. Quin enzim del cicle de Krebs s'inactiva completament en anaerobiosi sense tenir enzim substitutiu? 20. A alta osmolaritat, quina porina s'expressa de manera preferent a la membrana externa? 21.

Com s'anomena la molècula produïda per descarboxilació del glutamat per retirar protons en medi àcid?

El factor sigma-70 fosforilat a) El complex DnaK-DnaJ b) El factor sigma-32 lliure c) La proteïna anti-sigma RseA d) Augmentant els àcids grassos insaturats a) Sintetitzant àcids grassos saturats lineals b) Produint enllaços èter d'arqueu c) Eliminant els residus de prolina d) S'uneix a RseA i detecta proteïnes mal plegades a) Traduir l'ARNm de rpoH a la membrana b) Sintetitza nous lípids de membrana c) Degrada directament el factor sigma-E d) Perquè toleren temperatures de 100 °C a) Perquè degraden la membrana externa b) Perquè bloquegen completament la traducció c) Perquè renaturalitzen proteïnes eficaçment a 0 °C d) Dímer fosforilat per ArcB a) Forma oxidada soluble b) Monòmer amb clúster [2Fe-2S] c) Dímer amb clúster [4Fe-4S] d) Succinat deshidrogenasa a) Citrat sintasa b) Alfa-cetoglutarat deshidrogenasa c) Fumarat reductasa d) OmpC pel seu porus estret a) Fumarat reductasa b) OmpF per augmentar nutrients c) GadT per excretar sals d) Cadaverina a) GABA b) Putrescina c) Trehalosa d) Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 16 3 Control al·lostèric en rutes anabòliques i catabòliques EN ACABAR SABRÀS Distingir la resposta ràpida de modulació enzimàtica del control de l'expressió gènica.

Descriure la cinètica i el funcionament al·lostèric de l'ATCasa davant de CTP i ATP. Comparar els quatre patrons de retroinhibició en vies anabòliques ramificades. Calcular la càrrega energètica cel·lular i predir la resposta de vies catabòliques i anabòliques. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 22 Com pot un enzim aturar la seva pròpia via quan ja hi ha prou producte sense que calgui aturar la transcripció del seu gen? Una cèl·lula bacteriana com Escherichia coli conté aproximadament 2.000 enzims que coordinen el seu metabolisme intern davant les fluctuacions del medi.

ESQUEMA Regulació enzimàtica bacteriana Regulació enzimàtica 3 Control al·lostèric en rutes anabòliques i catabòliques 4 Modulació covalent reversible i sistemes sensorials Control de l'activitat Resposta ràpida en proteïnes preexistents Regulació al·lostèrica Interaccions no covalents d'efectors Rutes anabòliques Retroinhibició per producte final Rutes catabòliques Control per intermediaris i energia Modulació covalent Modificacions químiques reversibles Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 17 Nivells de regulació i cinètica al·lostèrica Els bacteris responen als canvis ambientals mitjançant dues estratègies temporals ben diferenciades.

La modulació directa de l'activitat enzimàtica ofereix una resposta immediata, actuant en fraccions de segon sobre proteïnes preexistents. Aquesta alteració pot ser reversible —mitjançant canvis al·lostèrics o modificació covalent (vegeu «Regulació enzimàtica — Modulació covalent reversible i sistemes sensorials»)— o bé irreversible mitjançant proteòlisi. En canvi, el control de l'expressió gènica requereix transcripció i traducció, operant com una adaptació a més llarg termini (vegeu «Regulació transcripcional — Arquitectura de l'operó, promotors i maquinària transcripcional»).

DEFINICIÓ La regulació al·lostèrica és la modificació de la conformació i afinitat catalítica d'un enzim provocada per la unió no covalent d'una molècula efectora a un lloc regulador específic, diferent del centre actiu. A diferència dels enzims no regulats que exhibeixen una cinètica hiperbòlica típica de Michaelis-Menten, els enzims al·lostèrics mostren una corba de velocitat enfront de la concentració de substrat de tipus sigmoïdal. Aquest perfil cooperatiu permet que petites variacions en la concentració de substrat o d'un efector desencadenin canvis dràstics en l'activitat catalítica de la proteïna.

COMPROVA-HO 23 Per què una corba cinètica sigmoïdal confereix un control més sensible que una corba hiperbòlica davant petites fluctuacions de metabòlits? Control al·lostèric en rutes anabòliques lineals: l'ATCasa En les rutes biosintètiques lineals, el model predominant és la inhibició per retroacció o retroinhibició simple (feed-back). En aquest disseny, el producte final de la via actua com a efector al·lostèric negatiu sobre el primer enzim del procés, aturant la despesa de precursors quan el producte ja és abundant a la cèl·lula.

Si es cultiva un bacteri amb una font de carboni marcada i s'afegeix un producte final acabat com un aminoàcid, la síntesi endògena d'aquest compost s'atura a l'instant i s'estalvien recursos metabòlics. El model canònic de control al·lostèric anabòlic és l'aspartat transcarbamilasa (ATCasa), que catalitza el pas compromès inicial de la biosíntesi de pirimidines. Estructuralment, l'ATCasa està formada per un complex de 12 subunitats: 6 subunitats catalítiques organitzades en dos trímers i 6 subunitats reguladores agrupades en tres dímers. Els centres actius i els centres al·lostèrics es localitzen físicament en polipèptids diferents.

Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 18 Gràfica de la cinètica de l'ATCasa amb inhibició per CTP. L'enzim presenta una regulació coordinada per dos nucleòtids distints que competeixen pel mateix lloc regulador: CTP (efector negatiu): és el producte final de la via de les pirimidines. La seva unió desplaça la corba sigmoïdal cap a la dreta (augmenta la Km aparent), disminuint l'afinitat per l'aspartat i frenant la síntesi quan hi ha excés de pirimidines. ATP (efector positiu): actua com a activador al·lostèric.

Desplaça la corba cap a l'esquerra (disminueix la aparent), indicant un estat energètic elevat i una abundància de purines que requereix fabricar pirimidines per equilibrar la síntesi d'àcids nucleics. COMPROVA-HO 24 Quina lògica fisiològica té que l'ATP sigui un activador de l'ATCasa mentre el CTP n'és un inhibidor? Estratègies de regulació en vies anabòliques ramificades Quan un intermediari inicial dóna lloc a diversos productes terminals diferents, una inhibició senzilla pel producte d'una branca provocaria la carència dels altres components.

Els bacteris resolen aquest problema mitjançant quatre arquitectures de control al·lostèric: Estratègia Mecanisme cinètic Exemple característic Enzims isofuncionals Múltiples isoenzims catalitzen el mateix primer pas; cadascun és inhibit específicament per un producte final independent. Isoenzims 1, 2 i 3 de la DAHP sintasa a la ruta d'aminoàcids aromàtics. Retroinhibició acumulativa Un únic enzim disposa de llocs al·lostèrics distints per a cadascun dels productes terminals. Cap inhibidor bloqueja el 100 % de l'activitat per si sol. Glutamina sintetasa (regulada parcialment per AMP, Trp, His, CTP, carbamoïlfosfat i glucosamina-6-P).

K m Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 19 Estratègia Mecanisme cinètic Exemple característic Retroinhibició seqüencial Cada producte final inhibeix el primer pas de la seva pròpia branca, provocant l'acumulació de l'intermediari del punt de bifurcació, que al seu torn inhibeix el primer pas comú. Vies biosintètiques ramificades amb retroacció esglaonada cap a l'inici del tronc comú. Inhibició i activació creuada El producte d'una via inhibeix el seu propi inici mentre que un intermediari o producte d'una via paral·lela n'estimula l'activitat de forma concertada. ATCasa regulada negativament per CTP i estimulada coordinadament per ATP.

Esquema del model de control per enzims isofuncionals. A la biosíntesi d'aminoàcids aromàtics (tirosina, fenilalanina i triptòfan) a partir de fosfoenolpiruvat (PEP) i eritrosa-4-fosfat, intervenen tres isoenzims DAHP sintasa. Cadascun d'ells respon a la presència d'un aminoàcid en concret; només quan convergeix l'acumulació simultània dels tres productes s'anul·la completament la producció de DAHP. ERROR FREQÜENT No confongueu la retroinhibició acumulativa amb els enzims isofuncionals. En els enzims isofuncionals hi ha diversos gens i proteïnes diferents catalitzant la mateixa reacció, cadascun sensible a un efector.

En la retroinhibició acumulativa hi ha una sola espècie enzimàtica que presenta múltiples llocs al·lostèrics independents, de manera que la inhibició total només s'aconsegueix amb la combinació de tots els lligands. COMPROVA-HO 25 Què ocorreria a la síntesi d'aminoàcids aromàtics si només existís una sola DAHP sintasa inhibida exclusivament per tirosina? Regulació del catabolisme central i càrrega energètica cel·lular Mentre que l'anabolisme respon directament als productes finals, la regulació de les rutes catabòliques centrals respon a intermediaris metabòlics clau i a l'estat energètic de la cèl·lula.

Aquestes vies produeixen simultàniament esquelets carbonats precursors, poder reductor i molècules d'ATP. Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 20 Un exemple representatiu és la fosfofructoquinasa de la glicòlisi. Aquest enzim utilitza ATP com a substrat donor de fosfat, però la seva activitat està modulada per altres metabòlits: el fosfoenolpiruvat (PEP), intermediari posterior de la ruta, actua com a inhibidor al·lostèric quan s'acumula. Per contra, l'ADP s'uneix a un lloc al·lostèric regulador específic (diferent del centre catalític de transferència) funcionant com a potent activador quan el nivell energètic disminueix.

L'estat energètic cel·lular es quantifica de manera estandarditzada mitjançant el concepte de càrrega energètica, el qual mesura la fracció de lligams fosfat rics en energia disponibles en el conjunt dels nucleòtids d'adenina: Aquest valor oscil·la entre 0 (tot el pool es troba en forma d'AMP desfosforilat) i 1 (tot el pool és ATP plenament fosforilat). En una cèl·lula bacteriana viable en creixement actiu, la càrrega energètica es manté estrictament tamponada en el rang de 0,87 a 0,95. Gràfica de velocitat de vies segons la càrrega energètica.

L'impacte de la càrrega energètica sobre el metabolisme global és asimètric: Vies regeneradores d'ATP (catabolisme): mantenen taxes altes quan la càrrega energètica és baixa i s'inhibeixen de forma pronunciada a mesura que la càrrega s'apropa a 1. Vies consumidores d'ATP (biosíntesi i creixement): romanen pràcticament inactives a càrregues baixes i s'activen de manera exponencial quan la càrrega energètica supera 0,8. COMPROVA-HO 26 Per què a l'equació de la càrrega energètica la concentració d'ADP es multiplica pel factor 0,5?

C rrega energ tica = a ˋ e ˋ [ATP] + [ADP] + [AMP] [ATP] + 0,5[ADP] Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 21 IDEES CLAU La regulació de l'activitat enzimàtica mitjançant al·losterisme ofereix una resposta immediata i reversible davant les alteracions ambientals. Els enzims al·lostèrics tenen cinètiques de saturació sigmoïdals que els fan extremadament sensibles a petites variacions en els nivells d'efectors. L'ATCasa és el prototip de feed-back anabòlic: formada per 12 subunitats, és inhibida al·lostèricament pel CTP i activada per l'ATP.

Les rutes anabòliques ramificades utilitzen enzims isofuncionals, retroinhibició acumulativa, seqüencial o patrons creuats per evitar el desabastiment de branques metabòliques. La càrrega energètica cel·lular es calcula com i es manté de forma estricta entre 0,87 i 0,95 per preservar la viabilitat. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 27. Com respon l'ATCasa a nivells alts de CTP i quina transcendència té el paper activador de l'ATP? 28. En què es diferencia la cinètica d'una via ramificada regulada per enzims isofuncionals respecte a una regulada per inhibició acumulativa? 29. Què succeeix amb les rutes catabòliques i anabòliques quan la càrrega energètica cau per sota de 0,87?

REGULACIÓ ENZIMÀTICA 4 Modulació covalent reversible i sistemes sensorials EN ACABAR SABRÀS Distingir els mecanismes i donadors de grups químics en adenilació, fosforilació, metilació i acetilació. Descriure el circuit de control de la glutamina sintetasa per UTasa, PII i ATasa segons el balanç nitrogenat. Explicar com la fosforilació d'AceK regula la cruïlla metabòlica entre el cicle de Krebs i el del glioxilat. Diferenciar la resposta ràpida motora (CheA/CheY) de l'adaptació temporal per metilació (CheR/CheB) en quimiotaxi.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 30 Com aconsegueix un bacteri detectar si una concentració de nutrient està augmentant mentre neda cap endavant, si és massa petit per mesurar diferències espacials al llarg del seu propi cos? ([ATP] + 0,5[ADP])/([ATP] + [ADP] + [AMP]) Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 22 A més del control al·lostèric per efectors de baix pes molecular (vegeu «Regulació enzimàtica — Control al·lostèric en rutes anabòliques i catabòliques»), els bacteris empren la modificació covalent reversible per alterar de forma ràpida i específica la conformació, l'activitat o les propietats reguladores de proteïnes clau.

Aquest mecanisme consisteix en la unió o escissió enzimàtica d'un grup químic específic sobre la cadena lateral d'aminoàcids concrets. Els principals tipus de modulació covalent descrits en procariotes comprenen processos diversos com la fosforilació, l'adenilació, la uridilació, la metilació i l'acetilació, cadascun executat per parelles d'enzims antagonistes o per enzims bifuncionals que responen a l'estat energètic o nutricional del medi cel·lular.

Modificació covalent Enzims o proteïnes diana Microorganismes Funció reguladora principal Adenilació Glutamina sintetasa (GS) Escherichia coli i altres Inactivació i sensibilització al feedback acumulatiu Uridilació Proteïna senyalitzadora PII Escherichia coli i altres Transmissió de l'estat de nitrogen cel·lular Fosforilació Isocitrat deshidrogenasa (IDH), PTS, CheA/CheY E. coli i molts bacteris Desviament metabòlic, transport de sucres i motilitat Metilació Proteïnes de quimiotaxi (MCP) Escherichia coli i altres Adaptació sensorial i reinici del sistema de quimiotaxi Acetilació Citrat liasa, proteïna ribosòmica L7 Rhodopseudomonas gelatinosa, E.

coli Activació enzimàtica i prevenció de cicles fútils 1. Modulació per adenilació: el complex regulador de la glutamina sintetasa La glutamina sintetasa (GS) és l'enzim central encarregat de fixar amoni en condicions limitants d'aquest compost i subministra nitrogen per a la biosíntesi de glutamina, nucleòtids i aminoàcids. Estructuralment, la GS està constituïda per un anell oligomèric de 12 subunitats idèntiques. Cadascuna de les 12 subunitats conté un residu de tirosina específic que pot ser modificat mitjançant la unió d'un grup AMP procedent de l'ATP. L'addició covalent de grups AMP és catalitzada per l'enzim bifuncional adenilil-transferasa (ATasa).

L'activitat global de la GS disminueix de manera estrictament progressiva a mesura que augmenta el nombre de subunitats adenilades (0 a 12 residus adenilats). Quan les 12 subunitats estan completament adenilades, l'enzim queda funcionalment desconnectat. DEFINICIÓ L'adenilació és la transferència d'un grup monofosfat d'adenosina (AMP) des de l'ATP cap a una cadena lateral d'aminoàcid d'una proteïna diana, amb alliberament de pirofosfat inorgànic ( ).

Aquesta modificació no tan sols modula la velocitat catalítica basal, sinó que reprograma la resposta al·lostèrica: l'adenilació de la glutamina sintetasa augmenta dràsticament la seva sensibilitat a la retroinhibició acumulativa exercida pels seus productes finals (com AMP, triptòfan, histidina, carbamoïl- P P i Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 23 fosfat i CTP; vegeu «Regulació enzimàtica — Control al·lostèric en rutes anabòliques i catabòliques»). Quan la cèl·lula no necessita assimilar amoni de manera urgent, la forma adenilada respon amb una inhibició potent a la suma d'aquests efectors. Diagrama de la cascada de regulació de la GS per PII i ATasa.

El control del sentit de l'ATasa (adenilació o deadenilació) depèn d'una cascada de senyalització regulada pel quocient intracel·lular , que reflecteix la disponibilitat real d'amoni: COMPROVA-HO 31 Quina conseqüència té sobre la glutamina sintetasa un increment marcat en la relació intracel·lular α-cetoglutarat / glutamina? [α-cetoglutarat]/[glutamina] Detecció metabòlica per la uridilil-transferasa / uridil-removasa (UTasa/UR): Aquest enzim bifuncional percep els nivells relatius d'alfa-cetoglutarat i glutamina.

Una alta concentració de glutamina (excés d'amoni) activa la funció UR (desuridilació), mentre que alts nivells d'alfa- cetoglutarat (amoni limitant) activen la funció UTasa (uridilació). 1 Modificació de la proteïna senyalitzadora PII: Sota condicions d'escassetat d'amoni, la UTasa transfereix UMP des d'UTP a la proteïna PII, generant la forma PII-UMP (o PII-D). En canvi, en abundància d'amoni, la UR retira l'UMP regenerant la forma no modificada PII (o PII-A). 2 Direccionament de l'ATasa: El complex format per PII-UMP activa la capacitat deadenililant de l'ATasa, retirant els grups AMP de la GS (alliberant ) i retornant l'enzim a la seva forma activa no modificada.

Per contra, la forma PII desuridilada indueix l'ATasa a transferir AMP a la GS utilitzant ATP, provocant la inactivació de la GS. 3 P i Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 24 2.

Fosforilació reversible en rutes centrals i transport La fosforilació reversible regula directament processos clau en bacteris, des del transport de nutrients fins a cruïlles metabòliques essencials: El sistema fosfotransferasa (PTS) i la síntesi de senyals El sistema de translocació de grup (PTS) transporta sucres acoblant la seva entrada a través de la membrana amb la seva fosforilació directa mitjançant una cadena de transferències de fosfats: fosfoenolpiruvat (PEP) Enzim I (EI) HPr Enzim IIA (EIIA) Enzim IIB (EIIB) substrat a través d'EIIC. Esquema del flux de fosfats en el sistema transportador PTS.

Quan la glucosa és present al medi, el grup fosfat d'EIIA es transfereix ràpidament cap a la glucosa entrant a través d'EIIB i EIIC, de manera que EIIA roman majoritàriament no fosforilat. En canvi, en absència de glucosa, el transport s'atura i EIIA roman fosforilat (EIIA~P). Aquesta forma fosforilada interactua al·lostèricament amb l'adenilat ciclasa unida a la membrana, estimulant la producció d'AMP cíclic (AMPc), senyal requerit per al complex CAP-AMPc en la desrepressió catabòlica (vegeu «Regulació transcripcional — L'operó de la lactosa i la repressió pel catabòlit»).

Bifurcació entre el cicle de Krebs i el cicle del glioxilat: l'enzim AceK Quan Escherichia coli creix fent servir acetat com a única font de carboni (substrat de dos carbonis), no pot permetre's la pèrdua de dos carbonis en forma de al cicle dels àcids tricarboxílics. Cal desviar l'isocitrat cap al cicle del glioxilat, catalitzat per la isocitrat liasa, per obtenir precursors biosintètics de quatre carbonis com el malat i el succinat.

CO 2 Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 25 Com que la isocitrat deshidrogenasa (IDH) posseeix una afinitat molt superior per l'isocitrat que la isocitrat liasa, la cèl·lula inactiva aproximadament el 75 % de la IDH per evitar que el flux circuli exclusivament pel cicle de Krebs.

Aquesta inactivació s'executa mitjançant la fosforilació reversible d'un residu catalític de la IDH, acció duta a terme per l'enzim bifuncional AceK (isocitrat deshidrogenasa quinasa/fosfatasa): Funció quinasa d'AceK: S'activa quan disminueixen els intermediaris catabòlics i precursors cel·lulars (baixa concentració de glucosa o carència energètica), fosforilant la IDH i inactivant-la, de manera que l'isocitrat acumulat és canalitzat cap a la isocitrat liasa. Funció fosfatasa d'AceK: S'activa al·lostèricament en presència d'alts nivells d'isocitrat, 3- fosfoglicerat o AMP, que reflecteixen necessitat energètica i abundància d'intermediaris.

La desfosforilació reactiva la IDH per reiniciar el cicle de Krebs complet. ERROR FREQÜENT Confondre quin enzim catalitza la fosforilació i quin és fosforilat. AceK és l'enzim bifuncional regulador (té activitat quinasa i fosfatasa a la mateixa cadena polipeptídica), mentre que la IDH és exclusivament el substrat enzimàtic modificat que s'inactiva quan porta el grup fosfat. COMPROVA-HO 32 Per què és imprescindible inactivar la IDH per fosforilació quan el bacteri s'alimenta exclusivament d'acetat? 3.

Quimiotaxi a Escherichia coli: fosforilació i metilació adaptativa La quimiotaxi permet als bacteris nedar cap a concentracions favorables de nutrients (atraients) o allunyar-se de substàncies perjudicials (repel·lents). Escherichia coli presenta flagel·lació perítrica i coordina el sentit de rotació flagel·lar: Sentit antihorari (CCW, counter-clockwise): Els flagels formen un feix compacte que impulsa el bacteri en línia recta, generant una carrera (run). Sentit horari (CW, clockwise): Els flagels se separen i giren de manera descoordinada, provocant un viratge o gir (tumble) que reorienta la cèl·lula a l'atzar.

Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 26 Diagrama del circuit sensorial i motor de quimiotaxi a Escherichia coli. Aquest comportament motor depèn de la integració de dues rutes de modificació covalent estretament acoblades: un circuit ràpid de fosforilació i un circuit d'adaptació temporal per metilació.

PROCÉS Cascada de fosforilació en la resposta quimiotàctica ràpida 1 Absència d'atraient MCP desocupada activa el complex CheW-CheA 2 Autofosforilaci ó de CheA La histidina quinasa s'autofosforila amb ATP 3 Fosforilació de CheY CheA transfereix el fosfat al regulador de resposta CheY 4 Rotació horària (CW) CheY-P s'uneix al motor flagel·lar i indueix el viratge Circuit de fosforilació ràpida (CheA / CheY) Els senyals ambientals són captats per receptors transmembrana denominats proteïnes de quimiotaxi acceptores de metil (MCP), com Tsr, Tar, Trg o Tap, que s'associen al costat citoplasmàtic amb la proteïna adaptadora CheW i la histidina quinasa sensora CheA: En absència d'atraient: CheA s'autofosforila ràpidament consumint ATP.

Immediatament transfereix el fosfat al regulador de resposta CheY. La forma CheY~P difon fins al motor flagel·lar i indueix el gir en sentit horari (CW), produint girs freqüents per explorar l'entorn. La fosfatasa CheZ desfosforila contínuament CheY~P per mantenir la resposta dinàmica. Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 27 En presència d'atraient: La unió de la molècula atraient al domini periplasmàtic del receptor MCP bloqueja l'autofosforilació de CheA. En no generar-se CheY~P, el motor flagel·lar manté la rotació antihorària (CCW) per defecte, provocant carreres prolongades cap al gradient químic favorable.

Circuit de metilació i reinici sensorial (CheR / CheB) Si la cèl·lula es mantingués en una carrera contínua dins d'una concentració saturant d'atraient, perdria la capacitat de detectar augments posteriors de concentració.

Per evitar-ho, les MCP experimenten metilació covalent reversible en residus específics de glutamat gràcies a l'acció de dos enzims: Enzim Funció covalent Estat d'activitat i regulació CheR Metiltransferasa (afegeix grups amb S- adenosilmetionina) Activitat lenta, contínua i constitutiva sobre les MCP CheB Metilesterasa (retira grups de les MCP) Requereix fosforilació per CheA (activa com a CheB~P) Quan l'atraient s'uneix a la MCP, s'inhibeix CheA, de manera que CheB no es fosforila i queda inactiva. Al mateix temps, CheR continua metilant de forma constant els residus de glutamat del receptor.

A mesura que la MCP assoleix un estat altament metilat, la seva conformació s'altera i perd la capacitat de respondre a la concentració d'atraient existent. Això reactiva la conformació d'activació de CheA, restaurant l'autofosforilació de CheA malgrat la presència de l'atraient: el sistema es «reinicia» (reset sensorial), permetent novament la fosforilació de CheY (provocant un gir) i la de CheB (que com a CheB~P desmetilarà les MCP per reajustar el llindar de sensibilitat). COMPROVA-HO 33 Què passaria amb la motilitat d'un mutant de E. coli amb el gen cheA delecionat? 4.

Regulació per acetilació reversible: el cas de la citrat liasa L'acetilació covalent representa un altre mecanisme elegant de control metabòlic procariota, especialment rellevant en bacteris fotosintètics anoxigènics com Rhodopseudomonas gelatinosa.

Aquest organisme disposa de l'enzim citrat liasa, encarregat d'escindir el citrat en oxalacetat i acetat: Aquesta conversió és metabòlicament oposada a la reacció catalitzada per l'enzim del cicle dels àcids tricarboxílics citrat sintasa, la qual condensa oxalacetat amb acetil-CoA per formar citrat i alliberar coenzim A lliure: –CH 3 –CH 3 Citrat Oxalacetat + Acetat Oxalacetat + Acetil-CoA Citrat + CoA Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 28 CAUSES I CONSEQÜÈNCIES Consum d'acetil-CoA La síntesi i escissió simultànies dissipen enllaços d'alta energia Elevat citrat i glutamat Inhibeix la desacetilasa mantenint la citrat liasa activa Prevenció del cicle fútil entre citrat liasa i citrat sintasa Carència de citrat La caiguda de glutamat reactiva la desacetilasa Inactivació de citrat liasa El citrat restant es reserva per a la citrat sintasa del cicle de Krebs Si ambdós enzims operessin simultàniament a velocitats elevades sense un control rígid, es generaria un cicle fútil: un bucle tancat que dissiparia energia i malbarataria coenzim A sense cap guany metabòlic net.

Per impedir aquesta pèrdua energètica, l'activitat de la citrat liasa es troba sota un estricte control per acetilació reversible: La citrat liasa és activa en la seva forma acetilada (forma S-acetil) i completament inactiva quan és desacetilada (forma sulfhidril lliure, SH). L'estat d'acetilació respon directament a la concentració intracel·lular de glutamat. Quan hi ha una elevada concentració de citrat al medi, aquest es converteix en alfa-cetoglutarat i ràpidament en glutamat per acció de la glutamat deshidrogenasa. L'acumulació de glutamat inhibeix la desacetilasa, afavorint que la lligasa mantingui la citrat liasa en la seva forma acetilada funcionalment activa.

Per contra, quan s'esgota el citrat del medi, la concentració interna de glutamat cau, la desacetilasa deixa d'estar inhibida i retira el grup acetil de la citrat liasa. L'enzim queda desactivat, garantint que el citrat restant pugui canalitzar-se sense interferències a través de la citrat sintasa del cicle de Krebs per regenerar la biosíntesi de nous intermediaris cel·lulars. PER RECORDAR-HO Compara l'activació per modificació: la glutamina sintetasa s'inactiva quan s'adenila, mentre que la citrat liasa s'activa quan s'acetila. No associïs sempre la modificació covalent a la inhibició d'un enzim.

Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 29 IDEES CLAU La modificació covalent reversible permet canvis ràpids en l'activitat enzimàtica mitjançant l'addició o eliminació de grups funcionals per enzims antagònics. La glutamina sintetasa conté 12 subunitats que s'inactiven i es fan altament sensibles al feedback acumulatiu a mesura que s'adenilen per l'ATasa en resposta al senyal de PII. El transportador PTS manté fosforilat EIIA en absència de glucosa, desencadenant l'activació de l'adenilat ciclasa i la síntesi d'AMPc. AceK és un enzim bifuncional que fosforila i inactiva la isocitrat deshidrogenasa per desviar l'isocitrat cap al cicle del glioxilat quan es creix en acetat.

A la quimiotaxi, CheA fosforila CheY per induir el gir en sentit horari del flagel, mentre que la metilació/desmetilació de les MCP per CheR i CheB reinicia l'adaptació sensorial. La citrat liasa de Rhodopseudomonas gelatinosa només és activa quan està acetilada, evitant un cicle fútil amb la citrat sintasa en resposta als nivells de glutamat. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 34. Quin paper juga la proteïna senyalitzadora PII en el control de la glutamina sintetasa? 35. Com actua el sistema de metilació CheR/CheB per evitar que el bacteri es dessensibilitzi a concentracions creixents d'un atraient? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 36.

Quin tipus de cinètica caracteritza els enzims regulats per al·losterisme? 37. Quina és la composició de subunitats de l'aspartat transcarbamilasa (ATCasa)? 38. Quin paper exerceix el fosfoenolpiruvat (PEP) sobre la fosfofructoquinasa? 39. Quin és el rang fisiològic estàndard de la càrrega energètica en bacteris viables?

Cinètica sigmoïdal cooperativa a) Cinètica hiperbòlica clàssica b) Cinètica lineal d'ordre zero c) Cinètica exponencial de primer ordre d) 4 subunitats: 2 reguladores i 2 catalítiques a) 12 subunitats: 6 catalítiques i 6 reguladores b) 8 subunitats: 4 catalítiques i 4 reguladores c) 6 subunitats idèntiques amb doble centre d) Coenzim redox d'unió covalent a) Activador al·lostèric de la via b) Inhibidor al·lostèric com a intermediari c) Substrat donor de fosfat alternatiu d) Exactament 1,00 en creixement a) Entre 0,70 i 0,80 b) Entre 0,87 i 0,95 c) Entre 0,50 i 0,65 d) Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 30 40.

Quantes subunitats susceptibles de ser adenilades formen la glutamina sintetasa bacteriana? 41. Quina conseqüència té la fosforilació de la isocitrat deshidrogenasa (IDH) catalitzada per AceK? 42. Quin efecte directe produeix CheY fosforilat (CheY-P) en el motor flagel·lar d'Escherichia coli? 43. En quin estat és catalíticament activa la citrat liasa de Rhodopseudomonas gelatinosa?

8 subunitats a) 6 subunitats b) 12 subunitats c) 4 subunitats d) Inactivació de la IDH a) Inhibició del cicle del glioxilat b) Degradació proteolítica de la IDH c) Activació del cicle de Krebs d) Inversió del gradient de protons a) Rotació antihorària i cursa b) Rotació horària i gir c) Parada del motor basal d) Fosforilada per un enzim quinasa a) Forma acetilada b) Desacetilada en presència d'acetat c) Unida irreversiblement a glutamat d) Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 31 5 Arquitectura de l'operó, promotors i maquinària transcripcional EN ACABAR SABRÀS Distingir entre operó, reguló i moduló segons el seu nivell d'integració genòmica.

Descriure el paper de cada subunitat del core catalític de la RNA polimerasa i del factor sigma a l'holoenzim. Comparar els mecanismes moleculars de la terminació intrínseca i de la terminació depenent de Rho. Classificar els circuits reguladors segons la combinació del tipus de proteïna (positiva o negativa) i la resposta a l'efector (induïble o reprimible). PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 44 Per què els bacteris agrupen múltiples gens funcionals sota un únic promotor en lloc de donar a cada gen el seu propi senyal d'inici? La síntesi de proteïnes requereix una despesa energètica considerable per a la cèl·lula bacteriana.

Regular la transcripció permet estalviar recursos sintetitzant ARN missatger exclusivament quan el producte gènic és necessari. Aquest control transcripcional ofereix respostes sostingudes i a més llarg termini que la modificació d'activitat enzimàtica.

Regulació transcripcional 5 Arquitectura de l'operó, promotors i maquinària transcripcional 6 L'operó de la lactosa i la repressió pel catabòlit 7 L'operó triptòfan i mecanismes d'atenuació 8 Control positiu per bucle d'ADN a l'operó Ara i activadors a distància (enhancers) 9 Metilació epigenètica del DNA, factors sigma i circuits de diferenciació 10 Reordenament d'ADN i interruptors de RNA (riboswitches) Fisiologia i Regulació Molecular Bacteriana — Apunts UB 32 ESQUEMA Estructura del tema: Regulació transcripcional bacteriana Arquitectura de l'operó i nivells d'integració gènica L'expressió dels gens pot ser constitutiva, quan té lloc contínuament sense mecanismes de control específics, o regulada, quan s'activa o es reprimeix segons l'estat fisiològic o l'entorn cel·lular.

DEFINICIÓ Un operó és una unitat transcripcional en la qual la transcripció d'un o diversos gens depèn d'un mateix promotor i elements de control compartits. Quan conté un únic gen s'anomena monocistrònic; si n'agrupa diversos que codifiquen per enzims d'una mateixa ruta metabòlica, s'anomena policistrònic. Dins d'un operó típic es distingeixen regions estructurals i senyals reguladors essencials en el DNA: Promotor: regió d'unió per a la RNA polimerasa, que conté dues caixes conservades a les posicions -35 i -10 respecte a l'inici de transcripció (+1). L'afinitat d'aquestes caixes determina si és un promotor fort o feble.

Operador: seqüència situada generalment downstream (riu avall) del promotor, on s'uneixen proteïnes repressores. Seqüències reguladores: regions situades upstream (riu amunt) que faciliten la interacció amb proteïnes activadores. Seqüència líder (5'-UTR): segment transcrit entre el nucleòtid +1 i el primer codó d'inici de la traducció, anterior al lloc d'unió del ribosoma (seqüència Shine-Dalgarno). Regula l'expressió gènica abans que comenci la síntesi de la proteïna. A l'extrem final…