Pràctiques de laboratori: Bioquímica i Endocrinologia Metabòlica

Activitat 1. Determinació de colesterol total

Al laboratori d'anàlisi clíniques es realitza la determinació quantitativa de colesterol total en sèrum mitjançant el mètode enzimàtic colorimètric (colesterol esterasa / colesterol oxidasa / peroxidasa) amb formació d'un complex de quinonaimina mesurable a 500 nm.

Pipeteu en tubs d'assaig:

S'han pipetejat els tubs segons el protocol (10 µL de mostra o patró en 1,0 mL de reactiu) i, després d'incubar durant 10 minuts a temperatura ambient, s'han obtingut les següents lectures d'absorbància a 500 nm calibrades front al blanc:

Absorbància del patró ($A_{\text{patró}}$): 0,316

Absorbància de la mostra ($A_{\text{mostra}}$): 0,208

Concentració del patró de colesterol: 200 mg/dL (5,18 mmol/L)

a.

Calculeu la concentració de colesterol total a la mostra del pacient expressada en mg/dL.

b.

Indiqueu l'estat clínic del pacient comparant el resultat amb els valors de referència (fins a 200 mg/dL: òptim; 200–239 mg/dL: moderat; > 240 mg/dL: elevat).

Activitat 2. Determinació de colesterol HDL

Per valorar la fracció de colesterol associat a lipoproteïnes d'alta densitat (C-HDL), es realitza una precipitació selectiva de les lipoproteïnes VLDL i LDL emprant fosfotungstat en presència d'ions magnesi.

Blanco

Patrón

Muestra

Agua destilada

$50\ \mu\text{L}$

—

—

Patrón Colesterol HDL (S)

—

$50\ \mu\text{L}$

—

Sobrenadante muestra

—

—

$50\ \mu\text{L}$

Reactivo (B)

$1{,}0\ \text{mL}$

$1{,}0\ \text{mL}$

$1{,}0\ \text{mL}$

Protocol de precipitació i reacció:

Tubo de centrifugació: $0{,}2\ \text{mL}$ de sèrum + $0{,}5\ \text{mL}$ de reactiu de precipitació (volum total = $0{,}7\ \text{mL}$).

Després de centrifugar, es recull el sobrenedant transparent (on resta exclusivament la fracció HDL).

Colorimetria: es barregen $50\ \mu\text{L}$ de sobrenedant amb $1{,}0\ \text{mL}$ de reactiu enzimàtic B.

Absorbància de la mostra a $500\ \text{nm}$: 0,393

Absorbància del patró a $500\ \text{nm}$: 0,350

Concentració del patró de colesterol HDL: $15\ \text{mg/dL}$

a)

Determineu el factor de dilució aplicat durant la fase de precipitació selectiva.

b)

Calculeu la concentració de C-HDL en la mostra original de sèrum (en mg/dL).

c)

Classifiqueu el nivell de risc cardiovascular del pacient en funció del valor obtingut sabent que un nivell < $35\ \text{mg/dL}$ representa un risc elevat i > $60\ \text{mg/dL}$ suposa un risc baix.

Activitat 3. Determinació de transaminases sèriques

Les transaminases són enzims intracel·lulars que augmenten al torrent circulatori com a conseqüència del recanvi tissular o de lesions cel·lulars agudes o cròniques.

Valors de referència de GOT:

Temperatura

Varones

Mujeres

$37\ ^\circ\text{C}$

hasta $40\ \text{U/l}$

hasta $33\ \text{U/l}$

$30\ ^\circ\text{C}$

hasta $26\ \text{U/l}$

hasta $21\ \text{U/l}$

$25\ ^\circ\text{C}$

hasta $18\ \text{U/l}$

hasta $15\ \text{U/l}$

a)

Expliqueu la importància de l'anàlisi de l'aspartat aminotransferasa (GOT/AST) i de l'alanina aminotransferasa (GPT/ALT) en el diagnòstic diferencial de malalties cardíaques i hepàtiques.

b)

En una pacient de sexe femení s'ha avaluat l'activitat sèrica de GOT a $37\ ^\circ\text{C}$, obtenint-se un valor de 24,4 U/l. Interpreteu el resultat tenint en compte els valors de referència de la taula (fins a $33\ \text{U/l}$ per a dones a $37\ ^\circ\text{C}$).

Activitat 4. Determinació espectrofotomètrica de bilirrubina

A la pràctica es quantifiquen les fraccions de bilirubina (directa i total) mitjançant la reacció diazoica d'Ehrlich en presència o absència d'acceleradors (cetrimida).

Blanco Reactivo

Blanco Muestra

Muestra

Patrón

Agua destilada

100 µL

—

—

—

Muestra

—

100 µL

100 µL

—

Patrón (S)

—

—

—

100 µL

Reactivo (AT)

—

1,0 mL

—

—

Reactivo de Trabajo

1,0 mL

—

1,0 mL

1,0 mL

S'ha muntat una sèrie analítica amb blanc de reactiu, blanc de mostra, mostra problema i patró. S'han obtingut les següents lectures d'absorbància a 540 nm:

Absorbància de la mostra ($A_{\text{mostra}}$): 0,148

Absorbància del blanc de mostra ($A_{\text{blanc mostra}}$): 0,089

Absorbància del patró ($A_{\text{patró}}$): 0,291

Concentració del patró de bilirrubina: 4,43 mg/dL

a)

Per quin motiu és imprescindible preparar i restar el 'blanc de mostra' en aquesta determinació?

b)

Calculeu la concentració de bilirrubina a la mostra en mg/dL.

c)

A quina fracció correspon la 'bilirrubina directa' i quins valors de referència té en adults sans?

Activitat 5. Determinació de ferro sèric i capacitat de fixació

La determinació del ferro sèric es fonamenta en l'alliberament de l'ió fèrric unit a la transferrina mitjançant clorur de guanidini, la seva posterior reducció a ió ferrós (Fe 2+) amb hidroxilamina, i la quantificació espectrofotomètrica a 560 nm del complex acolorit soluble que forma amb la ferrozina.

Blanco reactivo

Blanco muestra

Muestra

Patrón

Agua Destilada

200 µL

-

-

-

Muestra

-

200 µL

200 µL

-

Patrón de Hierro

-

-

-

200 µL

Reactivo A

-

1 mL

-

-

Reactivo de trabajo

1 mL

-

1 mL

1 mL

Ferro (serum)

Homes: 65 a 176 µg/dL

Dones: 50 a 170 µg/dL

Nounats: 100 a 250 µg/dL

Infants: 50 to 120 µg/dL

TIBC: 240-450 µg/dL

Ferritina: 30-400 ng/dL homes / 15-200 ng/dL dones

S'obtenen les dades analítiques següents:

Absorbància de la mostra ($A_{\text{mostra}}$): 0,118

Absorbància del blanc de mostra ($A_{\text{blanc mostra}}$): 0,039

Absorbància del patró ($A_{\text{patró}}$): 0,180

Concentració del patró de ferro: 200 µg/dL (35,8 µmol/L)

a)

Calculeu la concentració de ferro sèric de la mostra en µg/dL.

µg/dL

b)

Definiu què és la capacitat total de fixació de ferro (TIBC) i com s'alteren el ferro sèric i el TIBC en una anèmia ferropènica clàssica.

Activitat 6. Estudi comparatiu de la cinètica de glucèmia postprandial

Es monitoritza l'evolució de la concentració de glucosa en sang en dos individus sans durant dues hores (temps: 0, 30, 60, 90 i 120 minuts) després de rebre dos estímuls glucídics diferents:

Individu A (línia vermella): ingesta de sobrecàrrega de glucosa en solució aquosa (glucosa líquida).

Individu B (línia verda): ingesta equivalent en forma de glúcid sòlid complex (galetes).

a.

Descriviu el perfil temporal de la glucèmia observat en l'individu que pren glucosa líquida i justifiqueu les variacions entre els 0 i els 120 minuts.

b.

Compareu aquest perfil amb el de l'individu que ingereix galetes sòlides. Per quines raons fisiològiques i fisicoquímiques es desplacen les corbes en el temps?

Activitat 7. Qüestionari d'autoavaluació de conceptes pràctics

Indiqueu per a cadascuna de les següents 19 afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

Indiqueu per a cadascuna de les següents afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

Activitat 7. Qüestionari d'autoavaluació de conceptes pràctics

Indiqueu per a cadascuna de les següents 19 afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

Indiqueu per a cadascuna de les següents afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

Activitat 7. Qüestionari d'autoavaluació de conceptes pràctics

Indiqueu per a cadascuna de les següents 19 afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

g.

Valors > 30 U/l per a l'activitat alanina transaminasa (ALT, GPT) en sèrum indiquen patologia muscular.

Vertadera

Falsa

Activitat 7. Qüestionari d'autoavaluació de conceptes pràctics

Indiqueu per a cadascuna de les següents 19 afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

Indiqueu per a cadascuna de les següents afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

Activitat 7. Qüestionari d'autoavaluació de conceptes pràctics

Indiqueu per a cadascuna de les següents 19 afirmacions si és Vertadera o Falsa, d'acord amb els procediments de laboratori i els coneixements clínics adquirits:

k.

El sèrum s'obté a partir de la mostra de sang un cop afegit un anticoagulant i centrifugada la mostra.

l.

Com a anticoagulants de la sang utilitzem agents quelants del calci, per exemple EDTA o citrat sòdic.

q.

En una mesura espectrofotomètrica anomenem blanc de reactiu al tub que ens proporciona l'absorbància d'un determinat volum de la solució patró/estàndard.