Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari

I 0 flashcards i 8 preguntes més al document.

Text del document

APUNTS TÈCNIQUES INSTRUMENTALS BÀSIQUES Grau en Biotecnologia Universitat Autònoma de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apunts de Tècniques Instrumentals Bàsiques: espectroscòpia, cromatografia, centrifugació i electroforesi amb fórmules clau i protocols de laboratori.

APREN.AI Índex Aspectes bàsics 1 Seguretat, bones pràctiques i registre de laboratori Registre d'experiments i traçabilitat Bioseguretat, EPIs i documentació química Neteja i condicionament del material de vidre 2 Mesura de massa, volum, aigua purificada i solucions tampó Mesura de massa: ús de la balança analítica Qualitat de l'aigua al laboratori Mesura de volum i tècniques de micropipetatge Emmagatzematge i conservació de reactius químics Fonaments de les solucions tampó i equilibri àcid-base Mesura experimental del pH mitjançant pH-metre Tècniques espectroscòpiques 3 Fonaments de l'absorció i llei de Beer-Lambert Radiació electromagnètica i espectre de la llum Interacció llum-matèria: Diagrama de Jablonski i orbitals Espectres d'absorció i absorció específica de biomolècules Llei de Beer-Lambert i expressió matemàtica Arquitectura de l'espectrofotòmetre i metodologia Limitacions i desviacions de la llei de Beer-Lambert 4 Cuantificació de biomolècules i espectrofluorimetria Quantificació de proteïnes: mètodes directes i indirectes Quantificació d'àcids nucleics i l'efecte hipercròmic Espectrofluorimetria: fotofísica, paràmetres i instrumentació Cromatografia 5 Principis bàsics, cromatografia planar i d'adsorció en columna 1.

Fonaments fisicoquímics i terminologia general 2. Cromatografia planar: paper i capa fina (TLC) 3. Fonaments de la cromatografia en columna 4. Cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) 6 Gel filtració, bescanvi iònic i afinitat Cromatografia de gel filtració (exclusió molecular) Paràmetres volumètrics i càlcul del coeficient de distribució Aplicacions i matrius de gel filtració Cromatografia de bescanvi iònic Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 1 Comportament de càrrega segons el punt isoelèctric (pI) Cromatografia d'afinitat 7 Centrifugació — Fonaments físics, instrumentació i metodologies de separació 1. Fonaments físics de la sedimentació 2.

Instrumentació, components i tipus de rotors 3. Metodologies de separació i aplicacions 8 Electroforesi — Fonaments elèctrics, sistemes de suport i mètodes avançats Fonaments físics i factors determinants de la migració Dissipació tèrmica: efecte Joule Configuració bàsica i polaritat dels equips Matrius de gel: agarosa i poliacrilamida (PAGE) Preparació de mostres, tampons i detecció Metodologies electroforètiques avançades 9 Formulari Aspectes bàsics i dissolucions Espectroscòpia i quantificació Cromatografia Centrifugació Electroforesi Errors típics i precaucions Solucions de les preguntes de repàs Aquests apunts poden contenir errors o omissions.

Són un material de suport i no substitueixen el temari oficial ni el professorat: contrasta la informació important. Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 2 1 Seguretat, bones pràctiques i registre de laboratori EN ACABAR SABRÀS Gestionar correctament el registre d'experiments mitjançant llibreta física o ELN per garantir la traçabilitat. Identificar i aplicar els equips de protecció individual (EPI) i interpretar les fitxes de seguretat química (SDS). Executar el procediment estandarditzat de neteja del material de vidre per evitar interferències analítiques.

PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 1 Per què no n'hi ha prou amb rentar el material de vidre amb aigua d'aixeta després d'utilitzar sabó? El treball experimental rigorós exigeix un registre documental precís, l'adopció de mesures estrictes de protecció personal i una correcta higinització del material per evitar interferències químiques.

Aspectes bàsics 1 Seguretat, bones pràctiques i registre de laboratori 2 Mesura de massa, volum, aigua purificada i solucions tampó Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 3 ESQUEMA Estructura del curs de Tècniques Instrumentals Registre d'experiments i traçabilitat Qualsevol procediment analític o assaig requereix una anotació exhaustiva immediata, independentment de si el resultat obtingut coincideix amb les expectatives teòriques o resulta imprevist. Cal incloure sistemàticament la data d'execució, els paràmetres instrumentals, els protocols detallats i els valors resultants.

DEFINICIÓ La traçabilitat experimental és la capacitat de reconstruir de manera fidedigna l'historial d'un procediment científic. Això garanteix que un altre investigador pugui reproduir exactament l'experiment o que es puguin optimitzar variables determinades durant l'ajust d'un protocol. Aquest seguiment es pot dur a terme mitjançant un quadern físic tradicional o a través d'un Electronic Lab Notebook (ELN), un programari especialitzat que emmagatzema, organitza i custodia de forma digital i detallada tota l'activitat del laboratori. COMPROVA-HO 2 Per què s'ha d'anotar un experiment fins i tot quan els resultats obtinguts no són els esperats?

Bioseguretat, EPIs i documentació química La seguretat personal requereix l'ús obligatori d'equips de protecció individual (EPI). Aquests elements inclouen la bata, els guants, les ulleres de seguretat o pantalles protectores i les mascaretes filtrants. Protecció ocular o facial: Les ulleres protectores o pantalles són d'ús preceptiu sempre que existeixi perill de projeccions líquides o generació de bioaerosols.

Aspectes bàsics Seguretat, registre, mesures i tampons Tècniques espectroscòpiques Absorció, Beer-Lambert i quantificació Cromatografia Planar, columna, exclusió, iònica i afinitat Centrifugació Fonaments, rotors i mètodes de separació Electroforesi Gels de suport, PAGE, agarosa i enfocament Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 4 Guants de protecció: S'han d'emprar per manipular mostres biològiques, cultius amb potencials patògens o reactius amb propietats corrosives. Mascaretes de protecció: Actuen com a barrera davant gotes, aerosols i esquitxades.

L'eficàcia de filtració es mesura enfront de partícules estàndard de mida de 0,3 µm, paràmetre que permet catalogar i distingir el seu grau de protecció. Abans de començar qualsevol manipulació de reactius, és obligatori consultar la fitxa de dades de seguretat (SDS o MSDS, de l'anglès Material Safety Data Sheet). Aquest document detalla exhaustivament les propietats fisicoquímiques de la substància, els riscos per a la salut, les pautes d'actuació i els pictogrames de perillositat associats. ERROR FREQÜENT Un dels errors més greus és sortir de la zona de treball o manipular elements compartits (telèfons mòbils, ordinadors, llibretes, poms de portes o tocar-se el cos) amb els guants posats.

Aquest hàbit dispersa la contaminació química i biològica per espais comuns lliures de perill. Cal retirar-se els guants abans de qualsevol acció aliena a la bancada. COMPROVA-HO 3 Quin paràmetre físic s'utilitza com a referència per avaluar l'eficàcia de filtració de les mascaretes d'ús al laboratori? Neteja i condicionament del material de vidre El material plàstic és freqüentment d'un sol ús, però el vidre es reutilitza contínuament.

Atès que molts assajos requereixen treballar amb quantitats diminutes d'analit (de l'ordre de mil·ligrams, micrograms o nanograms), la presència de contaminants residuals (ions metàl·lics, detergents o restes orgàniques) altera la cinètica de les reaccions i falseja els mesuraments. Per aconseguir una superfície lliure de residus es requereix un protocol seqüencial estricte: Fase de neteja Agent emprat Objectiu principal Rentar inicial Solució de sabó (0,5%) Eliminar matèria orgànica adherida i greixos superficials. Eliminació de matèria orgànica o impureses solubles: Si s'ha utilitzat acetona per dissoldre certs residus orgànics, cal retirar-la primer amb aigua.

Rentar el recipient amb solució aquosa de sabó neutre al 0,5%. 1 Esbandida d'arrossegament: Rentar a fons amb aigua d'aixeta aplicant aproximadament 10 passades per desallotjar la major part del detergent i les partícules suspeses. 2 Desionització final: Esbandir entre 5 i 10 vegades amb aigua destil·lada o desionitzada per extreure les sals minerals i ions propis de l'aigua de la xarxa general. Per a la utilització posterior d'aigua de major puresa, vegeu «Aspectes bàsics — Mesura de massa, volum, aigua purificada i solucions tampó».

3 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 5 Fase de neteja Agent emprat Objectiu principal Primer esbandit Aigua d'aixeta (~10 passades) Arrossegar mecanicament el sabó i la brutícia suspesa. Esbandit final Aigua destil·lada o desionitzada (5-10 passades) Eliminar restes d'ions metàl·lics i sals de l'aigua corrent. PER RECORDAR-HO Cal anar amb compte amb les solucions altament bàsiques: l'exposició continuada a bases fortes té la capacitat d'atacar químicament i ratllar la superfície interior del vidre, alterant les seves propietats i facilitant la retenció de contaminants.

COMPROVA-HO 4 Quina conseqüència té no fer l'esbandit final amb aigua destil·lada o desionitzada al material de vidre? IDEES CLAU La llibreta de laboratori (convencional o ELN) assegura la reproductibilitat dels assajos i la traçabilitat de qualsevol canvi en els protocols. L'ús d'EPIs (mascaretes, guants, ulleres i bata) és indispensable per mitigar els riscos d'esquitxades, aerosols i contacte amb patògens o corrosius. Està prohibit circular o tocar objectes d'ús compartit amb els guants de laboratori per evitar la dispersió de contaminants. La fitxa SDS/MSDS és el document de referència que recull els perills químics i consells de prudència indicats mitjançant pictogrames.

La neteja del vidre requereix sabó al 0,5%, unes 10 esbandides amb aigua d'aixeta i entre 5 i 10 passades d'aigua destil·lada o desionitzada. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 5. Quin avantatge aporta l'ús d'un ELN en comparació amb la llibreta física? 6. Com actuen les bases fortes sobre els recipients de laboratori fets de vidre? Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 6 ASPECTES BÀSICS 2 Mesura de massa, volum, aigua purificada i solucions tampó EN ACABAR SABRÀS Distingir els procediments correctes de pesatge i evitar errors instrumentals a la balança analítica. Diferenciar els tres graus de puresa de l'aigua de laboratori segons la seva resistivitat i ús específic.

Seleccionar la micropipeta idònia segons les propietats físiques de la solució a transvasar. Calcular el pH de solucions tampó mitjançant Henderson-Hasselbalch i identificar els biaixos del pH-metre. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 7 Per què l'aigua purificada de màxima qualitat té una conductivitat gairebé nul·la però la seva resistivitat és extremadament alta? Mesura de massa: ús de la balança analítica La determinació precisa de la massa constitueix el primer pas crític en la preparació de reactius al laboratori químic i biològic. Per a quantitats petites de sòlids s'utilitza la balança analítica, un instrument d'alta sensibilitat dissenyat per registrar variacions d'ordre inferior al mil·ligram.

Els sòlids mai es dipositen directament sobre el plat metàl·lic. Es transfereixen mitjançant una espàtula a una barqueta de pesar (o pesasubstàncies). Abans d'afegir el reactiu, cal prémer el botó de tarat per posar la lectura a zero amb el recipient ja situat a l'interior. Les balances analítiques incorporen una cambra tancada amb portes de vidre corredisses. Aquestes portes han de romandre completament tancades durant el registre per evitar que els corrents d'aire de l'estança indueixin fluctuacions en la mesura.

PER RECORDAR-HO Tot i que les balances analítiques s'utilitzen habitualment per a soluts sòlids, també permeten pesar líquids directament quan es requereix una exactitud superior a la del material volumètric habitual. COMPROVA-HO 8 Per què és imprescindible tancar les portes de la cambra de pesatge abans d'anotar el valor d'una balança analítica? Qualitat de l'aigua al laboratori L'aigua és el dissolvent universal per excel·lència i l'agent principal de rentat.

L'aigua corrent d'aixeta conté múltiples impureses que alteren els assajos químics i biològics: matèria particulada (sorra, sediments), compostos dissolts orgànics, inorgànics o gasos, així com microorganismes i els seus subproductes de Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 7 degradació, anomenats pirògens (principalment el lipopolisacàrid, LPS, d'origen bacterià que indueix febre). Per aquest motiu, cal emprar aigua sotmesa a tractaments de dessalinització i purificació. El control de puresa de l'aigua es basa en paràmetres fisicoquímics i microbiològics concrets: Resistivitat elèctrica: capacitat del líquid d'oposar-se al pas del corrent elèctric, expressada en a 25 °C.

Com menys ions dissolts conté l'aigua, més gran és la seva resistivitat. Conductivitat: paràmetre invers a la resistivitat, expressat en . Carboni orgànic total (TOC): quantitat de matèria orgànica residual, mesurada en parts per bilió (ppb). Comptatge microbià: concentració d'unitats formadores de colònies per mil·lilitre (UFC/mL). Presència de col·loides: partícules en suspensió que provoquen terbolesa i redueixen la resistivitat del medi. Tipus d'aigua Resistivitat (25 °C) Principals aplicacions Tipus 1 (p. ex., Milli-Q) 18,2 MΩ·cm Citometria de flux, assajos sensibles a pirògens, cultius cel·lulars i tissulars.

Tipus 2 1 a 15 MΩ·cm Preparació de tampons, medis de cultiu, química general i espectrofotometria. Tipus 3 < 0,05 MΩ·cm Rentat preliminar de material de vidre i alimentació d'autoclaus. Sistemes integrats com els equips Milli-Q permeten obtenir aigua d'alta puresa (Tipus 2 i Tipus 1) a partir d'aigua d'aixeta mitjançant la combinació seqüencial de diversos mòduls de retenció d'impureses i sensors continus de control. COMPROVA-HO 9 Quina relació matemàtica i física existeix entre la conductivitat i la resistivitat en avaluar la puresa d'una mostra d'aigua?

Mesura de volum i tècniques de micropipetatge El transvasament i dosificació de líquids es realitza mitjançant instruments amb diferents graus de precisió. Els matrassos Erlenmeyer i els vasos de precipitats només ofereixen valors orientatius; en canvi, les provetes, i sobretot les pipetes, permeten un mesurament quantitatiu acurat: Pipeta aforada (o volumètrica): conté una única línia d'aforament calibrada; proporciona la màxima exactitud per a un volum fix determinat. Pipeta graduada (serològica o de Mohr): presenta una escala subdividida al llarg del tub que permet mesurar diversos volums compresos dins de la seva capacitat.

Pipeta Pasteur: instrument de transferència ràpida amb un bulb de goma, caracteritzat per una exactitud molt baixa. Micropipeta: eina mecànica de gran precisió dissenyada per a petits volums (de l'ordre de microlitres), àmpliament utilitzada en biologia molecular. Pel que fa al disseny intern i mecànica d'aspiració, existeixen dos models de micropipeta: MΩ cm μS/cm Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 8 PROCÉS Selecció del tipus de micropipeta segons la mostra COMPROVA-HO 10 Per quin motiu s'ha d'escollir una micropipeta de desplaçament positiu davant d'una mostra de glicerol pur?

Emmagatzematge i conservació de reactius químics L'estabilitat dels productes químics depèn directament de les condicions ambientals en què es guarden. En preparar o rebre dissolucions, cal seguir criteris estrictes: Fotoprotecció: aquells reactius o compostos sensibles a la radiació electromagnètica s'han d'emmagatzemar en flascons de vidre topazi (de color ambre o fosc) per aïllar-los de la llum solar directa. Temperatura: segons les instruccions de seguretat, les dissolucions es conserven a temperatura ambient, refrigerades a la nevera (uns 4 °C) o congelades (-20 °C o -80 °C). Humitat: molts productes sòlids en pols absorbeixen fàcilment la humitat ambiental.

Si s'han emmagatzemat en fred, cal deixar que el flascó s'equilibri a temperatura ambient abans d'obrir-lo per evitar condensacions d'aigua sobre el reactiu abans de pesar-lo. Micropipeta de desplaçament d'aire: la succió s'exerceix a través d'un coixinet d'aire confinat entre el pistó intern i el líquid aspirat. És el sistema estàndard per a solucions aquoses. Com que el vapor del líquid pot penetrar a la tija i contaminar el mecanisme, per a mostres volàtils o perilloses cal utilitzar puntes amb filtre. 1 Micropipeta de desplaçament positiu: el pistó entra en contacte directe amb el líquid dins de la pròpia punta d'un sol ús, sense cap cambra d'aire intermèdia.

S'utilitza per a líquids viscosos o reactius perillosos, ja que impedeix la formació de bombolles i elimina qualsevol risc de contaminació de l'instrument.

2 Tipus de mostra Avaluar viscositat, volatilitat o perillositat 1 Solució aquosa estàndard Densitat i viscositat similars a l'aigua 2 Desplaçament d'aire Utilitza coixinet d'aire; punta estàndard o filtre 3 Líquid viscós o perillós Glicerol, reactius agressius o molt volàtils 4 Desplaçament positiu Pistó intern a la punta sense coixinet d'aire 5 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 9 Tota dissolució química conservada al laboratori ha d'estar obligatòriament retolada amb tres dades essencials: nom i composició química exacta, data de preparació i identificació de la persona responsable de la seva elaboració.

Fonaments de les solucions tampó i equilibri àcid-base Les biomolècules (aminoàcids, pèptids, proteïnes o àcids nucleics) són electròlits dèbils que s'ionitzen parcialment en solució aquosa. Per preservar la seva conformació i funcionalitat, cal controlar el pH mitjançant una solució tampó (o amortidora), capaç de resistir canvis bruscos de pH quan s'afegeixen petites quantitats d'àcid o de base. Esquema d'un parell àcid-base conjugat d'àcid acètic en aigua. Els àcids i bases es classifiquen segons el seu grau de dissociació en aigua: Àcids forts: es dissocien al 100 % (com ara l'àcid clorhídric, ), presenten un valor elevat de i un baix .

Àcids dèbils: es dissocien parcialment establint un equilibri dinàmic entre l'espècie no dissociada i la seva base conjugada: La constant d'acidesa ( ) per a aquest procés es defineix com: Aïllant la concentració de protons i aplicant logaritmes decimals negatius ( ), s'obté l'equació de Henderson-Hasselbalch: En dissenyar un sistema tampó s'han de considerar tres factors: 1. El pKa de l'àcid dèbil: ha de ser proper al pH de treball desitjat per garantir la màxima capacitat amortidora. 2. La concentració total: ha de ser suficient per neutralitzar les fluctuacions sense alterar la força iònica necessària per a l'assaig. 3.

La compatibilitat química: la substància amortidora no ha d'interaccionar ni interferir amb la reacció bioquímica estudiada. Mesura experimental del pH mitjançant pH-metre El pH-metre determina la concentració de protons mitjançant la mesura de la diferència de potencial elèctric entre un elèctrode indicador de vidre i un elèctrode de referència. La conversió del voltatge elèctric en unitats de pH es regeix per l'equació de Nernst: HCl + H O 2 H O + 3 + Cl K a pK a HA H + + A K a K = a [HA] [H ][A ] + log = p pH = pK + a log [HA] [A ] Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 10 On és la constant dels gasos ideals, la temperatura absoluta en kèlvins i la constant de Faraday.

La mesura instrumental depèn de diversos factors que cal controlar estrictament: ERROR FREQÜENT Confondre l'efecte de dilució: tot i que la relació teòrica no canvia en afegir aigua, en diluir una solució estoc concentrada es modifiquen els coeficients d'activitat i l'equilibri de dissociació real. Cal comprovar i reajustar sempre el pH de la solució final diluïda amb el pH-metre, en lloc d'assumir que mantindrà el pH de la solució mare.

Els tres condicionants principals que influeixen en la resposta de l'elèctrode són: Efecte de la temperatura: atès que tant el pendent de Nernst com el valor de (i per tant el ) depenen directament de , cal que el pH-metre disposi de sonda de compensació tèrmica automàtica. Efecte de la concentració: el comportament iònic i el grau de dissociació varien en funció de la concentració total de soluts a la dissolució. Error per sodi (o error alcalí): a valors de pH bàsics o davant de concentracions molt altes d'ions , la membrana de vidre perd selectivitat i respon al sodi a més de l'hidrogen, cosa que pot fer disminuir la lectura del pH fins a 0,5 unitats respecte al valor real.

COMPROVA-HO 11 En quines condicions experimentals és més acusat l'error per sodi d'un pH-metre i com es manifesta la desviació? IDEES CLAU La balança analítica requereix tarar la barqueta buida i mantenir les portes tancades per evitar corrents d'aire que alterin la mesura. L'aigua de Tipus 1 (com la Milli-Q) presenta una resistivitat de a 25 °C i s'utilitza en assajos d'alta sensibilitat com el cultiu tissular i la citometria. Les micropipetes de desplaçament d'aire funcionen amb un coixinet d'aire comprimible, mentre que les de desplaçament positiu utilitzen un pistó en contacte directe, ideal per a mostres viscoses o perilloses.

L'equació de Henderson-Hasselbalch relaciona el pH d'una solució tampó amb el seu i la proporció de base conjugada i àcid dèbil. El pH-metre calcula el pH segons l'equació de Nernst, la qual depèn de la temperatura i està subjecta a l'error de sodi en presència d'alta concentració d'aquest catió. V = E + constant pH F 2,303RT R T F [A ]/[HA] K a pK a T Na+ 18,2 M\textOmega cm pK a Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 11 COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 12. Per què cal verificar el pH després de diluir una solució tampó a partir d'un estoc concentrat si la proporció entre la base i l'àcid no canvia sobre el paper? 13.

Quina diferència funcional existeix entre l'aigua de Tipus 1 i l'aigua de Tipus 3 al laboratori? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 14. Quin diàmetre de partícula s'utilitza per valorar l'eficàcia de les mascaretes? 15. Quina pràctica suposa un risc d'escampar contaminants al laboratori? 16. Quantes passades d'aigua destil·lada o desionitzada es recomanen per netejar el vidre? 17. Quin document cal revisar per conèixer els riscos i pictogrames d'un reactiu? 18. Quina resistivitat elèctrica caracteritza l'aigua pura de Tipus 1 a 25 °C? 19. Quin tipus de micropipeta s'ha d'emprar per dosificar solucions d'alta viscositat? 20.

Quin efecte provoca l'error per sodi en la mesura instrumental del pH? 21. Quina informació és obligatòria en l'etiquetatge d'una solució de laboratori?

10 µm a) 3,0 µm b) 0,3 µm c) 0,03 µm d) Rentar el vidre amb sabó a) Obrir portes amb guants posats b) Consultar la fitxa SDS prèviament c) Registrar les dades en un ELN d) Entre 5 i 10 passades a) No cal utilitzar-ne mai b) Exactament 20 passades c) Només 1 passada ràpida d) La llibreta de laboratori física a) La fitxa SDS o MSDS b) El registre de rentat del vidre c) La llicència de software ELN d) Menys de 0,05 MΩ·cm a) 0,5 MΩ·cm b) 1 a 15 MΩ·cm c) 18,2 MΩ·cm d) Micropipeta de desplaçament d'aire a) Pipeta graduada de Mohr b) Pipeta Pasteur convencional c) Micropipeta de desplaçament positiu d) Disminució de la lectura fins a 0,5 unitats a) Indiferència de l'elèctrode cap al catió sodi b) Augment del pH fins a 0,5 unitats c) Bloqueig immediat de la membrana de vidre d) Composició, data de preparació i responsable a) Preu dels reactius i volum de l'estoc b) Nom del proveïdor i lot de la balança c) Codi de barres i fabricant del recipient d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 12 3 Fonaments de l'absorció i llei de Beer-Lambert EN ACABAR SABRÀS Distingir les regions de l'espectre electromagnètic rellevants per a l'anàlisi bioquímica.

Interpretar les transicions electròniques associades al diagrama de Jablonski i als orbitals moleculars. Calcular concentracions i absorbàncies mitjançant l'equació de la llei de Beer-Lambert. Identificar les limitacions tècniques i desviacions en la mesura espectrofotomètrica d'absorció. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 22 Per què una dissolució que absorbeix llum en la regió blava de l'espectre s'observa visualment de color taronja? Les tècniques espectroscòpiques són mètodes analítics basats en la mesura de la radiació electromagnètica que una substància absorbeix o emet quan s'il·lumina. Aquestes interaccions revelen la composició química i la concentració dels analits presents en una mostra.

Tècniques espectroscòpiques 3 Fonaments de l'absorció i llei de Beer- Lambert 4 Cuantificació de biomolècules i espectrofluorimetria Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 13 ESQUEMA Tècniques espectroscòpiques al laboratori Radiació electromagnètica i espectre de la llum La radiació electromagnètica es propaga com una ona formada per dos components perpendiculars entre si: un vector elèctric i un vector magnètic. Cada tipus de radiació transporta una energia concreta lligada a la seva freqüència i a la seva longitud d'ona. Esquema de l'espectre electromagnètic segons longitud d'ona i freqüència.

L'espectre electromagnètic ordena totes les ones conegudes en funció de l'energia, la freqüència i la longitud d'ona. En el laboratori bioquímic destaquen tres intervals clau: Absorció molecular Interacció llum i analits Fonaments i Beer-Lambert Mesura d'absorbància directa Espectrofotòmetre UV-Vis Monocromador, cubetes i detectors Biomolècules directes Proteïnes (280 nm) i àcids nucleics (260 nm) Quantificació i emissió Mètodes colorimètrics i fluorescència Assajos colorimètrics Mètodes indirectes Biuret i Bradford Espectrofluorimetr Emissió de fotons per fluorescència Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 14 Radiació ultraviolada (UV): comprèn l'interval de 15 nm a 400 nm.

Posseeix energia suficient per induir transicions d'electrons de valència. Llum visible: correspon a la petita franja detectable per l'ull humà, entre 380 nm i 750 nm. Cada matís de color respon a una longitud d'ona específica. Radiació infraroja (IR): abasta des de 700 nm fins a 1 mm, amb menor energia per fotó que el visible. Interacció llum-matèria: Diagrama de Jablonski i orbitals Quan la llum UV o visible travessa una mostra, els fotons amb l'energia adequada són captats pels electrons de la capa externa de les molècules. Els electrons passen del seu nivell fonamental ( ) a un nivell excitat ( , ). El diagrama de Jablonski sintetitza aquests camins energètics.

Després de l'absorció de radiació, la molècula excitada retorna al seu estat fonamental mitjançant diverses vies: Transicions no radiatives: la molècula dissipa energia fent petits salts cap a nivells inferiors sense alliberar radiació electromagnètica. Fluorescència: l'electró retorna directament des de l'estat excitat inicial fins a l'estat basal emetent un fotó de llum (vegeu «Tècniques espectroscòpiques — Cuantificació de biomolècules i espectrofluorimetria»). Diagrama d'orbitals moleculars i transicions electròniques d'absorció.

Aquestes promocions electròniques impliquen diferents tipus d'orbitals moleculars: Orbitals d'enllaç (bonding): orbitals i , que contenen els parells d'electrons ordinaris d'unió química. Orbitals de no enllaç (non-bonding): designats com a , ocupats per parells electrònics lliures o solitaris. Orbitals d'antienllaç (anti-bonding): designats com a i , buits en condicions basals i cap als quals salten els electrons quan absorbeixen energia. COMPROVA-HO 23 Quina diferència energètica hi ha entre una relaxació no radiativa i la fluorescència segons el diagrama de Jablonski?

S 0 S 1 S 2 σ π n σ π Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 15 Espectres d'absorció i absorció específica de biomolècules L'espectre d'absorció reflecteix la proporció de radiació electromagnètica que una substància absorbeix al llarg d'un interval concret de longituds d'ona. Teòricament, com que les molècules incorporen paquets discrets de fotons d'energia definida, l'espectre correspondria a un conjunt de línies discontínues. No obstant això, a la pràctica es produeix una imbricació de nombroses transicions que transforma el perfil en una corba contínua de bandes amples. Aquest perfil és únic per a cada compost químic i permet la seva identificació.

Els màxims de la corba assenyalen les longituds d'ona que la mostra reté amb major eficàcia. En la regió del visible, el color observat per l'analista no és el que la molècula absorbeix, sinó la radiació que transmet, és a dir, el seu color complementari. Un exemple habitual és la vitamina B2, que absorbeix en el rang blau/lila i, per tant, s'observa de color taronja (efecte apreciable a l'orina en cas d'excés vitamínic). DEFINICIÓ L'absorció específica és la propietat que tenen certes biomolècules de captar intensament la radiació a una longitud d'ona característica degut a la seva estructura electrònica interna.

Dins de les biomolècules destaquen dues determinacions directes fonamentals: Proteïnes: mesura basada en els residus d'aminoàcids aromàtics. Els residus de triptòfan (Trp) posseeixen una forta absorció amb un pic característic a 280 nm. Àcids nucleics: presenten una forta banda d'absorció compresa entre els 200 nm i els 300 nm, amb el seu pic màxim situat estrictament a 260 nm. COMPROVA-HO 24 A quines longituds d'ona característiques s'identifiquen el triptòfan de les proteïnes i els àcids nucleics?

Llei de Beer-Lambert i expressió matemàtica La quantificació espectrofotomètrica es fonamenta en la llei de Beer-Lambert, la qual relaciona matemàticament la disminució d'intensitat lumínica amb la concentració de les espècies absorbents i el camí òptic recorregut per la radiació. On els paràmetres queden definits de la següent manera: : absorbància (magnitud adimensional que quantifica la capacitat d'absorció de la dissolució). : coeficient d'extinció molar, propi de cada molècula a una longitud d'ona donada, expressat en . : concentració molar de l'analit en la mostra, expressada habitualment en .

: distància o pas òptic que recorre el feix de llum en el si de la cubeta, expressada en cm (sovint ). Experimentalment, el detector de l'espectrofotòmetre no registra directament l'absorbància, sinó la intensitat del feix incident ( ) i la del feix transmès que aconsegueix sortir ( ).

Aquesta relació defineix la transmitància ( ): A = ε c d A ε M 1 cm 1 c mol/L d d = 1 cm I 0 I T Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 16 L'absorbància es calcula com el logaritme negatiu de la transmitància fraccionària o, si es treballa en percentatge de transmitància ( ): En alguns procediments analítics, els valors de mesura es converteixen mitjançant un factor de conversió que assigna una concentració determinada a una unitat d'absorbància (per exemple, establint que una lectura d' equival a en àcids nucleics).

Arquitectura de l'espectrofotòmetre i metodologia L'espectrofotòmetre és l'aparell encarregat d'il·luminar una mostra amb una radiació d'una longitud d'ona seleccionada i mesurar amb exactitud la fracció d'intensitat absorbida. Esquema dels components interns de l'arquitectura d'un espectrofotòmetre. El trajecte que segueix la radiació a través de l'equip consta de cinc etapes: Per assegurar mesures fiables cal tenir presents determinats aspectes tècnics: Blanc de mostra: sovint les biomolècules estan dissoltes en solucions tampó o aigua que poden tenir una petita absorció residual (vegeu «Aspectes bàsics — Mesura de massa, volum, aigua purificada i solucions tampó»).

El blanc conté exclusivament el dissolvent o tampó sense l'analit. Es col·loca inicialment a l'equip perquè aquest resti la seva lectura i asseguri que l'absorbància final correspongui exclusivament a la substància d'interès. Elecció de les cubetes: les parets del recipient han de presentar una transmitància propera al 100% (absorbància nul·la) a la longitud de treball. A la regió visible es poden fer servir cubetes estàndard de T = I 0 I %T A = log T = 2 log(%T) A = 1 50 μg/ml Font de llum: làmpada que emet el feix radiant continu cap a una lent col·limadora per alinear els raigs.

1 Monocromador: prisma o xarxa de difracció que dispersa el feix continu en les diferents longituds d'ona que el componen. 2 Selector de longitud d'ona: ranura que aïlla exclusivament la longitud d'ona de treball desitjada abans d'incidir en la mostra. 3 Compartiment de mostra (cubeta): recipient on se situa el volum líquid i a través del qual passa la radiació incident ( ). 4 I 0 Detector i pantalla: cèl·lules fotoelèctriques que capten el feix emergent ( ) i transmeten el senyal convertit en xifra digital d'absorbància o transmitància. 5 I Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 17 plàstic o de vidre convencional.

Per contra, a longituds d'ona curtes com la regió ultraviolada, el vidre i els plàstics comuns absorbeixen la radiació (la transmitància decau en picat), de manera que és imprescindible emprar cubetes especials de quars. Format i volum: les cubetes tradicionals operen amb volums d'entre 2 ml i 3 ml. Si la quantitat de mostra és molt reduïda, s'utilitzen equips de microvolum com el NanoDrop UV-VIS, on una gota de només 0,5 µl es diposita sobre un pedestal i es reté mitjançant un braç mecànic per tensió superficial, actuant la pròpia gota com a cambra de mesura. COMPROVA-HO 25 Per què no es poden fer servir cubetes de plàstic o de vidre estàndard per mesurar proteïnes a 280 nm?

Limitacions i desviacions de la llei de Beer-Lambert La relació lineal entre l'absorbància i la concentració no és universal ni il·limitada. Es produeixen desviacions que invaliden el càlcul quantitatiu si no es controlen adequadament. Tipus de desviació Causa principal Comportament observat i solució Física / Òptica Atenuància per terbolesa o partícules en suspensió. La llum no s'absorbeix sinó que es dispersa; cal filtrar o centrifugar la mostra prèviament. Química Canvis en el pH del medi. L'estat d'ionització del cromòfor es modifica segons el pH, alterant el seu espectre i la seva absorbància final. Saturació de concentració Concentracions excessivament altes d'analit.

S'assoleix un llindar on increments de concentració ja no produeixen augments lineals d'absorbància; requereix dilució prèvia. ERROR FREQÜENT Confondre l'absorció molecular amb l'atenuància per dispersió. En dissolucions amb partícules o bacteris en suspensió, l'espectrofotòmetre marca lectures altes d'absorbància no pas perquè els fotons siguin absorbits per transicions electròniques, sinó perquè les cèl·lules dispersen la llum en totes direccions (densitat òptica). Quan es vol quantificar un solut molecular cal eliminar la terbolesa mitjançant centrifugació o filtració abans de prendre la lectura.

Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 18 IDEES CLAU L'espectre electromagnètic abasta la radiació UV (15-400 nm), la llum visible (380-750 nm) i la infraroja (700 nm - 1 mm). L'absorció de radiació UV-visible promou transicions electròniques des d'orbitals d'enllaç ( ) o no enllaç ( ) cap a orbitals buits d'antienllaç ( ). El triptòfan permet la detecció de proteïnes a , mentre que els àcids nucleics absorbeixen de manera màxima a . La llei de Beer-Lambert ( ) relaciona l'absorbància directament amb la concentració i el pas de llum a partir de la transmitància ( ). A la regió UV és indispensable emprar cubetes de quars per evitar l'absorció intrínseca del plàstic o del vidre.

La linealitat es perd per dispersió en mostres tèrboles (atenuància), variacions de pH o per excés de concentració. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 26. Com es calcula matemàticament l'absorbància a partir de la transmitància percentual ( )? 27. Quina funció té el blanc de mostra en una mesura espectrofotomètrica? 28. Per quina raó les mostres tèrboles provoquen lectures anòmalament altes a l'espectrofotòmetre? TÈCNIQUES ESPECTROSCÒPIQUES 4 Cuantificació de biomolècules i espectrofluorimetria EN ACABAR SABRÀS Distingir els mètodes directes i indirectes per a la quantificació de proteïnes. Calcular la concentració d'àcids nucleics a partir de mesures d'absorbància a 260 nm.

Explicar el fonament físic de l'efecte hipercròmic en la desnaturalització del DNA. Descriure el funcionament de l'espectrofluorímetre i la disposició del seu detector a 90°. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 29 Per què cal mesurar la fluorescència en un angle de 90° respecte a la llum d'entrada en lloc de col·locar el sensor al darrere com en l'absorbància? Quantificació de proteïnes: mètodes directes i indirectes La determinació de proteïnes en dissolució es pot dur a terme mitjançant mesura espectrofotomètrica directa o a través d'assajos colorimètrics indirectes. La tria del mètode depèn de la puresa, la quantitat de mostra disponible i la presència d'interferents químics.

σ, π n σ , π 280 nm 260 nm A = ε c d A = log T %T Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 19 El mètode directe aprofita l'absorció en l'ultraviolat proper. Els residus aromàtics, especialment el triptòfan (Trp) i la tirosina, absorbeixen llum amb un màxim d'absorció a 280 nm. Aquesta tècnica presenta una sensibilitat moderada i té el gran avantatge de ser no destructiva. No obstant això, requereix mostres lliures d'àcids nucleics o d'altres compostos que absorbeixin en aquesta mateixa regió espectral. Els assajos colorimètrics indirectes ofereixen una sensibilitat superior.

Aquests mètodes impliquen una reacció química amb reactius específics que generen un producte acolorit detectable en la regió del visible. En canvi, tenen com a desavantatge la destrucció irreversible de la fracció de mostra analitzada i la necessitat d'emprar una corba patró de referència. Taula comparativa i assajos colorimètrics de Biuret i Bradford en placa.

Mètode Principi de reacció Condicions del medi Requisits i característiques Directe (A280) Absorció UV dels anells aromàtics (Trp, Tyr) Tampó neutre o fisiològic No destructiu; sensibilitat moderada; interferència per àcids nucleics Biuret Complex de coordinació entre Cu2+ i enllaços peptídics Medi bàsic (NaOH), i tartrat de sodi Requereix mínim 3 aminoàcids i 2 enllaços peptídics; viratge a color lila Lowry Mètode indirecte basat en el reactiu de Biuret Bàsic Molt sensible; requereix corba patró de referència CuSO 4 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 20 Mètode Principi de reacció Condicions del medi Requisits i característiques BCA Mètode indirecte basat en el reactiu de Biuret Alcalí Alta sensibilitat; requereix corba patró de referència Bradford Unió del colorant Coomassie G-250 a residus bàsics i aromàtics Medi àcid gràcies a l'addició d' Desplaçament espectral (viratge de marró/verd a blau); ràpid i sensible El mètode de Biuret es fonamenta en la complexació dels ions cúprics ( ) amb els àtoms de nitrogen dels enllaços peptídics en medi fortament bàsic gràcies a l'hidròxid sòdic.

El tartrat de sodi s'incorpora com a estabilitzador per evitar la precipitació del coure com a hidròxid. La mostra desenvolupa una coloració lila característica proporcional al nombre d'enllaços peptídics presents. Per la seva banda, el mètode de Bradford empra el colorant blau de Coomassie G-250 en condicions fortament àcides mitjançant àcid fosfòric. En estat lliure àcid, el colorant presenta una tonalitat vermellosa o verdosa. Quan s'uneix mitjançant interaccions hidrofòbiques i electroestàtiques als aminoàcids bàsics (com l'arginina o la lisina) i aromàtics de les proteïnes, la seva forma anònica s'estabilitza i la dissolució adquireix un color blau intens.

La intensitat d'absorbància en el visible resulta directament proporcional a la concentració de la proteïna problema quan es compara amb un patró conegut. COMPROVA-HO 30 Quina condició estructural mínima requereix un pèptid per poder ser detectat satisfactòriament mitjançant el mètode de Biuret? Quantificació d'àcids nucleics i l'efecte hipercròmic Els àcids nucleics presenten un pic màxim d'absorció a 260 nm a causa de la ressonància dels anells aromàtics de les bases nitrogenades (purines i pirimidines). Aquesta tècnica directa no destrueix la mostra i proporciona una sensibilitat elevada.

La principal font d'interferència són les proteïnes cel·lulars, ja que també absorbeixen parcialment a aquesta longitud d'ona. H PO 3 4 Cu2+ Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 21 Taula de paràmetres espectrals i factors de conversió d'àcids nucleics. A través de la llei de Beer-Lambert (vegeu «Tècniques espectroscòpiques — Fonaments de l'absorció i llei de Beer-Lambert»), coneixent els coeficients d'extinció específics ( ), s'estableixen factors de conversió estàndard per a cubetes amb un pas òptic d'1 cm: per a DNA de doble cadena (dsDNA), corresponent a un . per a RNA monocatenari (ssRNA), corresponent a un . per a DNA de cadena simple (ssDNA), corresponent a un .

L'apilament ordenat de les bases nitrogenades a l'interior de la doble hèlix del DNA apantalla la interacció dels anells amb la radiació incident, fet que manté el coeficient d'extinció molar relativament baix. Quan s'aplica calor i s'assoleix la temperatura de desnaturalització tèrmica ( ), els ponts d'hidrogen es trenquen i les dues cadenes se separen. DEFINICIÓ L'efecte hipercròmic és l'increment notable de l'absorbància a 260 nm que experimenta una solució de DNA en desnaturalitzar-se des de la seva conformació nativa de doble cadena (dsDNA) cap a cadenes simples (ssDNA), atès que .

A més de la via directa, els àcids nucleics es poden mesurar mitjançant mètodes indirectes fluorimètrics d'alta sensibilitat. Aquests assajos requereixen l'associació amb fluoròfors orgànics com el bromur d'etidi (EtBr), utilitzat freqüentment en gels d'agarosa, o derivats de la bisbenzimidazola (Hoechst), els quals emeten un senyal luminescent amplificat un cop units a l'àcid nucleic.

ε A = 260 1 50 μg/mL ε = 0,020 (μg/mL) cm 1 1 A = 260 1 40 μg/mL ε = 0,025 (μg/mL) cm 1 1 A = 260 1 33 μg/mL ε = 0,027 (μg/mL) cm 1 1 T m ε < cadena doble ε cadena simple Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 22 COMPROVA-HO 31 Per què una dissolució de DNA desnaturalitzat absorbeix més llum a 260 nm que la mateixa quantitat de DNA bicatenari natiu? Espectrofluorimetria: fotofísica, paràmetres i instrumentació La fotoluminescència engloba els processos d'emissió de radiació lumínica per part d'una molècula prèviament excitada mitjançant l'absorció d'energia radiant (vegeu «Tècniques espectroscòpiques — Fonaments de l'absorció i llei de Beer-Lambert» pel Diagrama de Jablonski).

Segons la naturalesa quàntica de la transició electrònica, es distingeixen dos fenòmens clarament diferenciats: ESQUEMA Mecanismes de relaxació fotoluminescent Paràmetre Fluorescència Fosforescència Transició electrònica Retorn directe entre estats de la mateixa multiplicitat d'espín Transició prohibida que requereix creuament intersistemes cap a un estat triplet Cinètica d'emissió Immediata; cessa en retirar l'excitació lumínica Retardada; pèrdua gradual d'energia amb emissió contínua en la foscor Dependència de la font Emet només mentre la mostra està il·luminada Continua emetent llum després de tallar la font de llum incident L'espectre d'emissió descriu la distribució de longituds d'ona emeses per la substància fluorescent quan es manté fixa l'excitació.

Si aquestes bandes cauen en l'espectre visible, determinen el color percebut; per exemple, el bromur d'etidi intercala en àcids nucleics i excitat amb llum ultraviolada emet una marcada fluorescència ataronjada. L'eficiència energètica d'aquest procés s'avalua mitjançant el rendiment quàntic ( o ), definit quantitativament com: El valor de està condicionat per l'entorn químic de la mostra. Quan una interacció intermolecular disminueix aquest quocient, es parla d'atenuació o quenching. Per contra, si la interacció amb altres molècules o canvis en el medi afavoreixen la relaxació radiativa i n'augmenten el rendiment, el procés es denomina enhancement.

Lluminescència Emissió de fotons després d'absorbir energia Fluorescència Retorn immediat a l'estat basal Fosforescència Emissió lenta i retardada en el temps Q Φ Q = nombre de fotons absorbits nombre de fotons emesos Q Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 23 PROCÉS Trajectòria òptica a l'espectrofluorímetre ERROR FREQÜENT Confondre el quenching amb una pèrdua real o degradació de la biomolècula problema. El quenching és un fenomen purament físic o col·lisional causat per interaccions amb soluts de l'entorn o canvis en el medi que redueixen el rendiment quàntic ( ) sense alterar la quantitat real d'analit present a la cubeta.

Pel que fa al disseny de l'espectrofluorímetre, la seva arquitectura és semblant a la d'un espectrofotòmetre convencional (font de llum, monocromadors i cel·la), però incorpora una diferència clau en la disposició geomètrica: el detector se situa perpendicularment a 90° respecte a la trajectòria del feix d'excitació incident. Aquesta configuració evita que la radiació de la font incideixi sobre el fotodetector, garantint que només es quantifiquin els fotons emesos en totes direccions per la mostra i aconseguint així una sensibilitat molt elevada.

COMPROVA-HO 32 Per què a l'espectrofluorímetre el detector no es col·loca en la mateixa línia òptica que la font de llum com passa a l'espectrofotòmetre?

Font d'il·luminació Emet radiació policromàtica contínua 1 Monocromador d'excitació Selecciona la longitud d'ona absorbent 2 Mostra a la cubeta Absorbeix i emet fluorescència isotròpica 3 Gir òptic a 90° Separa l'emissió de la llum incident 4 Detector Mesura la intensitat de la llum emesa 5 Q Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 24 IDEES CLAU La quantificació directa de proteïnes a 280 nm depèn dels residus aromàtics (principalment triptòfan), mentre que els mètodes indirectes (Biuret, Lowry, BCA, Bradford) empren reaccions químiques colorimètriques.

El reactiu de Biuret necessita medi bàsic (NaOH), ions i un mínim de 2 enllaços peptídics, mentre que el Bradford utilitza blau de Coomassie G-250 en medi àcid amb . Els àcids nucleics absorbeixen a 260 nm amb factors de conversió per cubeta d'1 cm: 50 µg/mL (dsDNA), 40 µg/mL (ssRNA) i 33 µg/mL (ssDNA). L'efecte hipercròmic és l'augment d'absorbància a 260 nm causat per la pèrdua de l'apilament de les bases quan el DNA es desnaturalitza a la seva . A l'espectrofluorímetre, el detector es troba disposat perpendicularment a 90° respecte al feix d'excitació per no registrar la radiació incident procedent de la font. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 33.

Com influeix l'estat d'enllaç de les cadenes en el coeficient d'extinció molar ( ) del DNA a 260 nm? 34. En què es distingeixen la fluorescència i la fosforescència un cop interrompuda la il·luminació? 35. Com es defineix el rendiment quàntic (Q) i quins fenòmens poden modificar-ne el valor? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 36. Quin és l'interval de longituds d'ona que defineix la llum visible? 37. A quina longitud d'ona presenta el seu pic d'absorció màxima el triptòfan (Trp)? 38. Quin material de cubeta és indispensable per mesurar en el rang de l'ultraviolat? 39. Com s'anomena la pèrdua d'intensitat lumínica deguda a la dispersió en suspensions tèrboles?

Cu2+ H PO 3 4 T m ε 380 nm a 750 nm a) 15 nm a 400 nm b) 700 nm a 1 mm c) 200 nm a 300 nm d) 595 nm a) 260 nm b) 280 nm c) 340 nm d) Plàstic estàndard a) Vidre òptic comú b) Quars c) Poliestirè transparent d) Fosforescència a) Atenuància b) Extinció molar c) Fluorescència d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 25 40. A quina longitud d'ona absorbeix principalment el triptòfan en la determinació directa de proteïnes? 41. Si una solució de dsDNA pur presenta A260 = 1 en cubeta d'1 cm, quina és la concentració? 42. Quin component aporta el medi àcid necessari en el mètode colorimètric de Bradford? 43.

Per què el detector de l'espectrofluorímetre se situa a 90° respecte al feix incident? 595 nm a) 280 nm b) 340 nm c) 260 nm d) 50 µg/mL a) 20 µg/mL b) 33 µg/mL c) 40 µg/mL d) Sulfat de coure a) Tartrat de sodi b) Hidròxid de sodi c) Àcid fosfòric d) Per evitar registrar la llum d'excitació a) Per augmentar el camí òptic a 10 cm b) Per maximitzar l'efecte hipercròmic de l'analit c) Per afavorir el quenching col·lisional d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 26 5 Principis bàsics, cromatografia planar i d'adsorció en columna EN ACABAR SABRÀS Distingir els mecanismes fisicoquímics de repartiment i adsorció en la retenció d'anàlits.

Calcular i interpretar el factor de retard (Rf) en cromatografia en capa fina (TLC). Definir els paràmetres hidràulics d'una columna cromatogràfica, incloent V0 i Ve. Comprendre la funció de les bombes d'alta pressió en els sistemes de HPLC. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 44 Per què en una tira de paper absorbent tacada de tinta negra apareixen diferents colors quan l'aigua hi puja per capil·laritat? La cromatografia agrupa un conjunt de mètodes físics de separació en què els components d'una mescla es distribueixen entre dues fases diferents. Els compostos a analitzar o purificar s'anomenen anàlits.

Aquest procés permet aïllar substàncies aprofitant les diferències en les seves propietats fisicoquímiques. ESQUEMA Classificació dels mètodes cromatogràfics Cromatografia 5 Principis bàsics, cromatografia planar i d'adsorció en columna 6 Gel filtració, bescanvi iònic i afinitat Cromatografia planar Suport bidimensional pla Cromatografia en paper Fase estacionària d'aigua sobre cel·lulosa Capa fina (TLC) Gel de sílice sobre suport rígid Cromatografia en columna Sorbent confinat en tub cilíndric Columna per gravetat Flux induït pel pes de l'eluent HPLC Flux forçat per alta pressió Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 27 1.

Fonaments fisicoquímics i terminologia general Tot procés cromatogràfic requereix la interacció coordinada de dos elements essencials: Fase mòbil: fluid (líquid o gas) que flueix a través del sistema i arrossega la mostra al llarg del recorregut. Fase estacionària (o sorbent): sòlid o líquid immobilitzat sobre un suport que reté selectivament els anàlits. Quan la fase mòbil es mou a través del sorbent, es produeix el desenvolupament. Els components que estableixen interaccions febles amb la fase estacionària avancen ràpidament. Per contra, els anàlits amb forta afinitat pel sorbent queden retinguts i migren a menor velocitat.

El líquid que emergeix de l'extrem del sistema cromatogràfic s'anomena efluent. DEFINICIÓ Segons l'objectiu de la separació, distingim dues escales de treball: Cromatografia analítica: processa quantitats molt petites de mostra amb l'objectiu d'identificar o quantificar els components. Cromatografia preparativa: processa grans quantitats de mescla amb la finalitat de purificar i aïllar compostos per a aplicacions posteriors. Atesa la naturalesa de la interacció amb la fase estacionària, es distingeixen dos mecanismes primaris: COMPROVA-HO 45 Si un anàlit presenta un coeficient de repartiment KD molt baix, com serà la seva velocitat d'avanç respecte al front de solvent? 2.

Cromatografia planar: paper i capa fina (TLC) En la cromatografia planar, el medi estacionari es troba disposat en una superfície plana o làmina. El moviment de la fase mòbil pot ser descendent (afavorit per la gravetat) o ascendent (mitjançant capil·laritat). Les dues variants principals són la cromatografia en paper i la cromatografia en capa fina (TLC, de l'anglès Thin Layer Chromatography). Cromatografia de repartiment: la separació es basa en la solubilitat diferencial dels anàlits entre dos líquids immiscibles (un d'ells immobilitzat sobre un suport inert). S'aplica típicament a sucres, lípids i aminoàcids.

El paràmetre clau és el coeficient de repartiment ( ): 1 K D K = D Concentraci de l'an lit en la fase m bil o ˊ a ˋ o ˋ Concentraci de l'an lit en el sorbent o ˊ a ˋ Cromatografia d'adsorció: el sorbent sòlid disposa d'un nombre finit de punts d'unió específics. Els anàlits s'hi uneixen mitjançant forces reversibles (enllaços iònics, ponts d'hidrogen o atraccions hidrofòbiques). És l'estratègia predominant per a macromolècules com proteïnes o àcids nucleics. 2 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 28 Tècnica planar Suport i fase estacionària Característiques i aplicacions Paper Suport de cel·lulosa polar; la fase estacionària és l'aigua lligada a les fibres.

Separació de baixa resolució per a molècules polars. Capa fina (TLC) Capa de gel de sílice adherida a una làmina de vidre, plàstic o alumini. Major precisió i velocitat; excel·lent per a petites molècules i control de reaccions. La polaritat dels solvents (fase mòbil) determina la força d'elució: Solvents polars pròtics: posseeixen àtoms d'hidrogen units a elements molt electronegatius (com l'aigua o alcohols), capaços de cedir protons i establir ponts d'hidrogen. S'uneixen fortament a la sílice o a la cel·lulosa. Solvents polars apròtics: presenten dipols nets originats per enllaços entre àtoms electronegatius i electropositius no protònics, sense protons àcids disponibles.

Solvents apolars: formats per àtoms d'electronegativitat similar (com els hidrocarburs). No competeixen amb el sorbent polar i arrosseguen preferentment compostos hidrofòbics. Procediment experimental i càlcul del factor de retard La realització pràctica d'una TLC segueix una seqüència estructurada: El paràmetre quantitatiu que caracteritza cada compost sota unes condicions donades és el factor de retard (Rf): ERROR FREQÜENT Un error clàssic d'examen és invertir la fracció o mesurar des de la vora inferior de la placa en comptes de fer-ho des de la línia d'aplicació inicial.

Com que cap substància no pot avançar més enllà del front del solvent, el valor de mai no pot ser superior a 1 ni inferior a 0 ( ). A més, és una magnitud adimensional que no depèn de la llargada total de la placa si es mesura correctament fins al front. COMPROVA-HO 46 En una TLC amb fase estacionària polar de gel de sílice i un solvent poc polar, quin anàlit tindrà el valor de Rf més elevat: un de molt polar o un d'apolar? Aplicació de la mostra: es diposita un petit volum puntual sobre la línia base mitjançant un capil·lar o micropipeta. 1 Desenvolupament: la placa s'introdueix verticalment en una cambra saturada de vapor del solvent.

L'eluent puja per capil·laritat arrossegant els anàlits segons la seva afinitat. 2 Revelat o detecció: si els compostos no tenen color propi, s'inspeccionen sota llum ultraviolada (fluorescència) o es polvoritzen reactius químics (específics o reactius universals orgànics). 3 R = f = d solvent d an lit a ˋ dist ncia recorreguda pel solvent a ˋ dist ncia recorreguda per l'an lit a ˋ a ˋ R f 0 R f 1 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 29 3. Fonaments de la cromatografia en columna A la cromatografia en columna, la fase estacionària s'introdueix dins d'un tub cilíndric de vidre, plàstic o metall.

La fase mòbil líquida flueix a través del llit sòlid per acció de la gravetat o impulsada per una pressió externa. Esquema d'una columna d'adsorció que mostra la separació progressiva de components. El protocol operatiu requereix familiaritat amb els paràmetres geomètrics i hidràulics del sistema: Empaquetament: procés d'omplir homogeniament la columna amb la suspensió del sorbent, evitant bombolles o discontinuïtats. Càrrega: dipòsit curós de la mostra concentrada a la superfície superior del llit cromatogràfic. Elució: pas continu de la fase mòbil per transportar i separar els anàlits al llarg de la matriu.

Volum del llit: volum geomètric total ocupat pel sorbent i el solvent dins de la columna. Volum residual o buit ( ): volum líquid d'eluent que omple els espais intersticials de la columna lliures de fase estacionària. Volum d'elució (Ve): quantitat de fase mòbil necessària per transportar un anàlit determinat des del punt d'aplicació fins a la seva sortida de la columna. PER RECORDAR-HO Els anàlits que no mantenen cap interacció amb el sorbent abandonen la columna immediatament després d'haver passat el volum buit ( ). Qualsevol compost que interaccioni amb el llit requerirà un volum d'elució estrictament superior ( ). 4.

Cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) La cromatografia d'altes prestacions (HPLC, de l'anglès High Performance Liquid Chromatography) representa l'evolució instrumental automatitzada de la cromatografia en columna clàssica. En reduir dràsticament la mida de partícula del sorbent, la resistència hidràulica augmenta de forma exponencial. Per superar aquesta limitació física, l'equip incorpora bombes mecàniques d'alta pressió capaces d'impulsar el solvent de manera controlada i reproduïble a través de columnes metàl·liques segellades.

El sistema disposa de detectors en línia altament sensibles a l'efluent, la qual cosa permet una identificació i quantificació excel·lent tant per a concentracions traça com per a mescles complexes de gran dificultat de resolució. COMPROVA-HO 47 Quin és el motiu principal pel qual la cromatografia HPLC necessita operar a pressions elevades? V 0 V = e V 0 V > e V 0 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 30 IDEES CLAU La cromatografia separa anàlits basant-se en la seva distribució diferencial entre una fase mòbil i una fase estacionària (sorbent).

Segons la finalitat, s'estableix la distinció entre cromatografia analítica (petites quantitats, identificació/quantificació) i preparativa (aïllament i purificació). Els mecanismes bàsics són el repartiment (solubilitat relativa regida per ) i l'adsorció (enllaços reversibles sobre punts d'unió finits). En la cromatografia planar (TLC i paper), el factor de retard es quantifica com i el seu valor resta acotat entre 0 i 1. El volum d'elució ( ) mesura el volum de fase mòbil consumit per extreure un anàlit concret de la columna. L'HPLC empra bombes d'alta pressió per forçar el fluid a través de partícules de sorbent molt fines, aconseguint alta resolució i automatització.

COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 48. En què es diferencia fonamentalment una separació per repartiment d'una per adsorció? 49. Com es defineix el volum buit (V0) en una columna cromatogràfica i com es relaciona amb el volum d'elució d'una molècula sense retenció?

CROMATOGRAFIA 6 Gel filtració, bescanvi iònic i afinitat EN ACABAR SABRÀS Distingir el principi de separació per mida de la gel filtració respecte a l'electroforesi en gel Calcular el coeficient de distribució (Kav) d'un analit a partir dels seus volums d'elució Preveure la càrrega elèctrica neta d'una proteïna i la seva unió a bescanviadors iònics segons el pH i el seu pI Identificar els parells lligand-diana utilitzats a la cromatografia d'afinitat PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 50 Si una matriu cromatogràfica està plena de porus microscòpics, per quina raó les molècules gegants tarden menys a travessar la columna que les molècules diminutes?

En la separació i purificació de macromolècules biològiques s'utilitzen tècniques cromatogràfiques basades en propietats estructurals i químiques concretes. Mentre que els conceptes fonamentals de la cromatografia en columna es descriuen a «Cromatografia — Principis bàsics, cromatografia planar i K D R = f d /d an lit a ˋ solvent V e Tècniques Instrumentals Bàsiques: Resum i Formulari 31 d'adsorció en columna», l'aïllament precís de proteïnes requereix explotar característiques com la mida molecular, la càrrega elèctrica neta o la bioespecificitat mitjançant la gel filtració, el bescanvi iònic i l'afinitat.

Cromatografia de gel filtració (exclusió molecular) La cromatografia de gel filtració, anomenada també cromatografia d'exclusió molecular, permet separar les molècules d'una mostra segons la seva mida i pes molecular. La fase estacionària està formada per una matriu porosa amb canals interns d'una mida definida. En aplicar la mostra líquida, les molècules que superen la mida dels porus no poden penetrar-hi i es veuen obligades a circular exclusivament pels espais buits que queden entre les partícules del suport. En canvi, les molècules de menor mida entren als porus, experimenten un camí hidrodinàmic molt més llarg i queden retingudes durant més temps.

En la gel filtració, les molècules més grans surten de la columna abans que les petites. Això es deu al fet que recorren un…