Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari

I 0 flashcards i 5 preguntes més al document.

Text del document

APUNTS TÈCNIQUES INSTRUMENTALS BÀSIQUES Grau en Biotecnologia Universitat Autònoma de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apunts del 1r parcial de Tècniques Instrumentals Bàsiques (Biotecnologia UAB): tampons, espectroscòpia UV-Vis, cromatografia, electroforesi i centrifugació.

APREN.AI Índex 1 Procediments bàsics de laboratori: pesada, aigua, volumetria i tampons Pesada experimental i ús de la balança analítica Paràmetres de puresa i tipus d'aigua de laboratori Transferència volumètrica de líquids i emmagatzematge Dissolucions tampó, equació de Henderson-Hasselbalch i mesura de pH Càlcul de dilucions a partir de solucions estoc 2 Fonaments d'espectroscòpia UV-Visible i llei de Beer-Lambert L'espectre electromagnètic i les transicions electròniques Espectres d'absorció de biomolècules Formulació de la llei de Beer-Lambert Determinació instrumental: transmitància i absorbància 3 Mètodes de separació per cromatografia en columna Cromatografia de filtració en gel (exclusió molecular) Columnes de dessalat i detecció d'eluats Resines i materials de fase estacionària Cromatografia de bescanvi iònic Cromatografia d'afinitat i HPLC 4 Electroforesi: principis físics i factors d'influència Principis físics de la mobilitat electroforètica Funció del tampó d'electroforesi Efecte Joule i llei d'Ohm al sistema electroforètic 5 Centrifugació: fonaments físics, rotors i ultracentrifugació Fonaments de la força centrífuga Força centrífuga relativa (RCF) i revolucions per minut Components instrumentals i fraccions resultants Tipus de rotors Ultracentrifugació 6 Formulari Laboratori general, tampons i dilucions Espectroscòpia UV-Visible Cromatografia en columna Electroforesi Centrifugació Valors clau i errors típics Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 1 Solucions de les preguntes de repàs Aquests apunts poden contenir errors o omissions.

Són un material de suport i no substitueixen el temari oficial ni el professorat: contrasta la informació important. Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 2 1 Procediments bàsics de laboratori: pesada, aigua, volumetria i tampons EN ACABAR SABRÀS Diferenciar els graus de puresa de l'aigua de laboratori i les seves aplicacions. Calcular el pH i la proporció de components d'un tampó mitjançant Henderson-Hasselbalch. Determinar el volum de solució estoc necessari per a una dilució analítica. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 1 Per què no podem mesurar el volum exacte d'un àcid fort concentrat fent servir directament una pipeta graduada sobre una balança?

Pesada experimental i ús de la balança analítica La mesura precisa de massa per a la preparació de solucions requereix l'ús d'una balança analítica electrònica. Mai s'han de dipositar reactius químics directament sobre el plat de pesada per evitar corrosions i contaminacions creuades. S'utilitza paper d'alumini o barquetes de plàstic (weigh boats), tarant prèviament el recipient abans de carregar el solut sòlid. Paràmetres de puresa i tipus d'aigua de laboratori La qualitat de l'aigua emprada com a reactiu o dissolvent condiciona la reproductibilitat dels assajos biològics.

El control de qualitat avalua diferents magnituds crítiques: Resistivitat: oposició d'un líquid a la conducció del corrent elèctric ( ). Per a l'aigua pura a , el valor teòric és de . Conductivitat: expressada en , inversament proporcional a la resistivitat. Carboni orgànic total (TOC): mesurat en parts per bilió (ppb). Càrrega bacteriana: unitats formadores de colònies per mil·lilitre (UFC/mL). Presència de col·loides: partícules microscòpiques en suspensió causants de terbolesa. Qualitat Resistivitat ( ) Aplicacions principals Tipus 1 (Ultrapura) Citometria de flux, cultius cel·lulars i tissulars, tècniques sensibles a pirògens.

Tipus 2 (Purificada) Formulació de tampons químics, reactius generals i assajos espectrofotomètrics. Tipus 3 (Bàsica) Neteja de material de vidre i alimentació d'autoclaus. MΩ cm 25 C 18,2 MΩ cm μS/cm 25 C 18,2 MΩ cm 1-15 MΩ cm < 0,05 MΩ cm Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 3 Els sistemes d'obtenció inclouen l'intercanvi iònic, l'osmosi inversa (idònia per a grans volums) i la destil·lació. Els equips integrats moderns (com els sistemes Milli-Q) produeixen aigua Tipus 1 o Tipus 2 a partir d'aigua de xarxa combinant osmosi inversa, làmpades ultraviolades per a oxidar compostos orgànics i eliminar microorganismes, ultrafiltres i sensors de puresa en continu.

ERROR FREQÜENT En espectroscòpia UV, l'aigua produïda únicament per intercanvi iònic pot retenir traces de matèria orgànica residual que interfereixen absorbint en l'ultraviolat. Per a mesures a és obligatori utilitzar aigua destil·lada o aigua Tipus 1 tractada amb UV. COMPROVA-HO 2 Quina diferència funcional existeix entre l'aigua Tipus 1 i la de Tipus 3 en un laboratori biològic? Transferència volumètrica de líquids i emmagatzematge La dispensació de volums líquids depèn de la precisió requerida. La pipeta aforada o volumètrica posseeix un únic enrasament fix i proporciona la precisió més elevada.

En contrast, la pipeta graduada (serològica o de Mohr) disposa d'una escala dividida per mesurar fraccions variables dins d'un interval, però amb una incertesa experimental superior. Per a petits volums s'utilitzen micropipetes automàtiques, mentre que les pipetes Pasteur es reserven per a transferències qualitatives sense calibratge. Les solucions preparades s'etiqueten sempre indicant el nom del compost i la seva concentració, la data d'elaboració i l'autor. Es conserven freqüentment refrigerades a per frenar la degradació química i el creixement microbià. Les dissolucions congelades han de preveure l'expansió del volum d'aigua.

El tancament dels recipients es fa amb taps hermètics o amb pel·lícula extensible d'hidrocarburs (Parafilm), tenint en compte que aquest film de cera es dissol en presència de solvents orgànics no polars com el cloroform o l'acetona. Dissolucions tampó, equació de Henderson-Hasselbalch i mesura de pH Una solució tampó o amortidora manté el pH relativament constant davant de petites addicions d'àcids o bases fortes. Està constituïda per un àcid feble (HA) i la seva base conjugada ( ).

L'equilibri de dissociació es regeix per: Aplicant logaritmes i transformant segons s'obté l'equació de Henderson-Hasselbalch: Les molècules polipròtiques (com l'àcid fosfòric o l'àcid cítric) presenten tants valors de com protons poden alliberar progressivament. La capacitat tamponant es defineix com la quantitat d'àcid o base forta necessària per modificar en una unitat el pH del sistema; és màxima quan (és a 260 280 nm 4 C A K = a [HA] [H ][A ] + (1) p = log pH = pK + a log = [HA] [A ] pK + a log [ cid] a ˋ [base] (2) pK a pH = pK a Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 4 dir, ).

PER RECORDAR-HO Criteris per triar un amortidor biològic: seleccionar una substància amb un , mantenir una concentració total de , i assegurar que no interaccioni amb l'assaig (com el tampó fosfat, que pot inhibir certs enzims o precipitar cations polivalents com el calci). La mesura potenciomètrica del pH s'efectua submergint un elèctrode combinat de vidre en la solució problema. El sistema es basa en l'equació de Nernst, que relaciona la diferència de potencial elèctric mesurada amb el pH: Diagrama d'intervals de pH i pKa de diversos amortidors biològics. Càlcul de dilucions a partir de solucions estoc Sovint és poc pràctic pesar i preparar reactius des de zero a cada experiment.

Es preparen solucions estoc concentrades que es dilueixen segons el factor requerit complint la relació de conservació de matèria: En una dilució 1:10 (o 1 a 10) per aconseguir finals, es mesura de la solució estoc i s'enrasa amb solvent fins als totals. [A ] = [HA] pK dins de l'interval pH ± a treball 1 0,005 a 0,5 M V = E + constant pH F 2,303RT (3) V C = 1 1 V C 2 2 (4) 10 mL 1 mL 10 mL Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 5 COMPROVA-HO 3 Quants valors de pKa presenta l'ió fosfat i per quin motiu estructural?

ESQUEMA Classificació de l'aigua purificada de laboratori IDEES CLAU La balança analítica requereix recipients de pesada químicament compatibles i tara prèvia a la lectura. L'aigua Tipus 1 (ultrapura) té una resistivitat de a 25\text{ }^\boldsymbol{\text{\text{°}}}\text{C}. La pipeta volumètrica ofereix més precisió que la graduada gràcies al seu disseny calibrat a un únic volum fix. L'equació de Henderson-Hasselbalch ( ) determina la relació àcid/base conjugada necessària per fixar el pH. La preparació de dissolucions de treball a partir d'estocs es calcula mitjançant . COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 4. Què succeeix si intentem segellar un matràs que conté cloroform utilitzant Parafilm? 5.

Quin interval de pH cobreix de forma eficaç una substància amortidora amb un valor de pKa conegut? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 6. Quina resistivitat té l'aigua ultrapura de Tipus 1 a 25 °C? Tipus 1 (Ultrapura) 18,2 Mohm·cm; cultius i citometria Tipus 2 (Purificada) 1-15 Mohm·cm; tampons i espectrofotometria Tipus 3 (Bàsica) <0,05 Mohm·cm; neteja i autoclau 18,2 M\textohm cm pH = pK + a log([A ]/[HA]) V C = 1 1 V C 2 2 100 MΩ·cm a) Entre 1 i 15 MΩ·cm b) Menys de 0,05 MΩ·cm c) 18,2 MΩ·cm d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 6 7. Quin tipus de pipeta ofereix major precisió de mesura volumètrica? 8.

A quina concentració total de tampons se sol treballar en assajos habituals? 9. Com es calcula el volum necessari d'una solució estoc per fer una dilució? 2 Fonaments d'espectroscòpia UV-Visible i llei de Beer- Lambert EN ACABAR SABRÀS Interpretar transicions electròniques utilitzant el diagrama de Jablonski. Calcular absorbàncies, concentracions o camins òptics amb la llei de Beer-Lambert. Convertir valors instrumentals de transmitància en absorbància òptica. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 10 Per què una solució de clorofil·la es veu de color verd si el clorofil·la absorbeix fotons de llum?

L'espectre electromagnètic i les transicions electròniques L'espectroscòpia d'absorció estàndard analitza com la matèria interacciona amb la radiació en les regions de l'ultraviolat (UV) i del visible ( ). Quan un feix de radiació travessa la mostra, els fotons amb l'energia associada coincident amb la diferència entre dos nivells quàntics són absorbits, provocant transicions electròniques dels electrons de les capes externes des de l'estat fonamental ( ) fins a estats excitats ( ).

Pipeta graduada de Mohr a) Pipeta serològica b) Pipeta aforada o volumètrica c) Pipeta Pasteur de plàstic d) Superior a 2 M a) Menor a 0,001 M b) De 1 a 10 mM exactament c) De 0,005 a 0,5 M d) V1 = C1 / (V2 · C2) a) V1 = (V2 · C1) / C2 b) V1 = V2 · C1 · C2 c) V1 = (V2 · C2) / C1 d) longituds d'ona de 10 a 10 nm 2 3 S 0 S 1 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 7 Diagrama de Jablonski il·lustrant absorció, transicions no radiatives i emissió de fluorescència. El diagrama de Jablonski descriu aquests processos: inclou nivells vibracionals associats a cada estat electrònic.

L'absorció condueix l'electró a subnivells vibracionals excitats; posteriorment té lloc una relaxació o transició no radiativa cap al nivell vibracional zero de , des d'on el retorn a pot donar lloc a l'emissió de fluorescència ( ) a una longitud d'ona superior. Espectres d'absorció de biomolècules Com que cada nivell electrònic disposa de múltiples subnivells vibracionals i rotacionals, l'absorció molecular no es manifesta com a línies aïllades sinó en forma de bandes amples de pic arrodonit. Àcids nucleics (ADN i ARN): presenten una absorció màxima a 260 nm, deguda als anells aromàtics de les bases nitrogenades purines i pirimidines.

Proteïnes: mostren el seu màxim d'absorció característic a 280 nm, propietat originada pels residus d'aminoàcids aromàtics (triptòfan, tirosina i fenilalanina). En el rang visible (400-700 nm), el color que percep l'ull humà correspon estrictament a la llum transmesa o reflectida que no ha estat absorbida pel cromòfor (com s'observa amb les clorofil·les a i b, que absorbeixen preferentment blau i vermell, transmetent verd). S 1 S 0 hν Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 8 Espectres d'absorbància de les clorofil·les a i b en la regió visible.

Formulació de la llei de Beer-Lambert Quan un feix de llum monocromàtica d'intensitat incident penetra en una cel·la d'espessor òptic , la intensitat decreix exponencialment en funció de la concentració de l'analit absorbint. On els paràmetres representen: : absorbància (magnitud adimensional). : coeficient d'extinció molar, expressat en . : concentració de la substància en dissolució (mol/L). : camí òptic o gruix del pas de llum de la cubeta (habitualment 1 cm). I 0 d c A = ϵ c d (5) A ϵ L mol cm 1 1 c d Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 9 Atenuació exponencial de la intensitat lumínica incident en travessar la cubeta.

Determinació instrumental: transmitància i absorbància Els detectors espectrofotomètrics registren físicament la transmitància ( ), que és la fracció de llum incident que aconsegueix travessar la mostra: L'absorbància es calcula mitjançant la relació logarítmica negativa de la transmitància: Quan el valor de transmitància es dona en percentatge ( ), l'expressió matemàtica de conversió directa és: ERROR FREQÜENT Confondre transmitància amb absorbància és un error recurrent: mentre que la transmitància decreix de manera exponencial a mesura que augmenta la concentració, l'absorbància és directament proporcional a la concentració de l'analit en el rang lineal de la llei de Beer-Lambert.

COMPROVA-HO 11 Si una mostra té una transmitància del 10 %, quina absorbància mesura l'espectrofotòmetre?

T T = I 0 I (6) A = log T = log = I 0 I log I I 0 (7) %T = (I/I ) 100 0 A = 2 log(%T) (8) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 10 PROCÉS Procés d'absorció i desactivació electrònica 1 Estat fonamental (S0) Electrons a la capa de menor energia 2 Absorció de fotó UV/Vis Promoció a nivell vibracional excitat en S1 3 Transició no radiativa Relaxació al nivell basal de S1 4 Emissió de fluorescència Retorn a S0 emetent llum a major longitud d'ona IDEES CLAU Les excitacions electròniques sota radiació UV-Visible desplacen electrons de capes exteriors a nivells d'energia superiors. Els àcids nucleics s'analitzen pel seu pic d'absorbància a 260 nm i les proteïnes a 280 nm.

L'espectre d'absorció és ample a causa de la superposició de múltiples nivells vibracionals associats a cada estat electrònic. La llei de Beer-Lambert estableix la proporcionalitat lineal . L'absorbància s'obté a partir de la transmitància mesurada segons . COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 12. A quines longituds d'ona característiques es quantifiquen respectivament els àcids nucleics i les proteïnes? 13. Quina unitat de mesura té el coeficient d'extinció molar (ε)? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 14. A quina longitud d'ona tenen el seu pic característic d'absorbància els àcids nucleics? 15. Què representa el paràmetre d a la llei de Beer-Lambert (A = ε · c · d)? 16.

Quina és la relació matemàtica entre l'absorbància (A) i el percentatge de transmitància (%T)? A = ϵcd A = log T = 2 log(%T) 340 nm a) 595 nm b) 260 nm c) 280 nm d) La densitat òptica del dissolvent a) El diàmetre dels soluts b) El gruix del pas de llum c) La dispersió de la llum incident d) A = 2 - log(%T) a) A = 100 - %T b) A = log(%T) - 2 c) A = %T / 2 d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 11 17. En el diagrama de Jablonski, què representa el procés de fluorescència? 3 Mètodes de separació per cromatografia en columna EN ACABAR SABRÀS Calcular el coeficient de partició Kav a partir de volums d'elució.

Diferenciar les matrius polimèriques de dextrana, agarosa i poliacrilamida. Predir el comportament d'una proteïna en intercanvi iònic en funció del seu punt isoelèctric. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 18 En una columna d'exclusió molecular, per què les molècules gegants elueixen més de pressa que les diminutes? Cromatografia de filtració en gel (exclusió molecular) La cromatografia de filtració en gel separa les molècules en dissolució exclusivament segons la seva mida i pes molecular. La columna està empaquetada amb una matriu porosa insoluble envoltada per una fase mòbil aquosa.

Les molècules de gran mida que superen el límit d'exclusió no poden penetrar en la xarxa de porus i elueixen primer pel volum buit ( ). Les molècules de mida petita o mitjana penetren en els porus de les partícules del gel, recorren un camí intern més llarg i elueixen més tard, a un volum d'elució major ( ). El coeficient de distribució o fracció de porus disponibles per a un analit concret ( ) es defineix com: On és el volum total geomètric de la columna i el volum de mostra s'estableix com a la diferència entre el volum geomètric i el volum líquid. Columnes de dessalat i detecció d'eluats Una aplicació directa de la filtració en gel és el dessalat de preparats proteics.

S'utilitza una columna amb un diàmetre de porus molt gran: les proteïnes s'exclouen totalment i s'elueixen ràpidament al volum buit (detectades per absorbància a 280 nm). Les sals, molt més petites, queden retingudes a l'interior dels porus i surten molt després (detectades per conductivitat). Tot i que la diàlisi també aconsegueix dessalar solucions, la filtració en gel resulta un procés molt més àgil.

Salt des de S0 a un nivell vibracional superior a) Pèrdua d'energia interna per xocs moleculars b) Retorn radiatiu amb emissió de fotó des de S1 a S0 c) Canvi d'espín cap a un estat triplet d) V 0 V e K av K = av V V t 0 V V e 0 (9) V t Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 12 Resines i materials de fase estacionària L'elecció del suport defineix el rang de fraccionament i el límit d'exclusió molecular: Suport cromatogràfic Composició estructural Característiques i reactius Dextrana (ex. Sephadex) Polisacàrid natural format per unitats de glucosa unides per enllaços . Comercialitzat ja polimeritzat; s'hidrata directament amb aigua abans de l'empaquetament.

Agarosa Polímer lineal de D-galactosa i 3,6-anhidro-L-galactosa. Format per calefacció i posterior refredament (enllaços per ponts d'hidrogen). Té porus grans i límits d'exclusió alts; pot col·lapsar a altes pressions. Poliacrilamida Copolímer sintètic d'acrilamida monomèrica i bisacrilamida com a entrecreuador. Polimerització catalitzada per persulfat d'amoni (APS, oxidant) i TEMED. Porus petits, ideal per a pèptids i analits de baix pes molecular. Mescles mixtes Combinació controlada d'agarosa i poliacrilamida. Combina la flexibilitat mecànica de l'acrilamida evitant el col·lapse del gel d'agarosa.

Cromatografia de bescanvi iònic La cromatografia d'intercanvi iònic és una tècnica d'adsorció basada en interaccions electroestàtiques reversibles entre soluts carregats i els grups funcionals fixats covalentment a la matriu tridimensional. Intercanviadors catiònics: posseeixen grups funcionals de càrrega negativa a la resina i intercanvien o retenen cations de la mostra. Intercanviadors aniònics: disposen de grups funcionals positius i intercanvien o uneixen anions. Es classifiquen en forts o febles en funció de si mantenen la càrrega ionitzada en un rang ampli de pH o si la seva força iònica depèn del pH del medi.

La matriu de suport se sol sintetitzar a base de poliestirè per a analits petits i estables, mentre que per a biomolècules grosses i sensibles s'utilitzen derivats de dextrana o agarosa. El control del pH respecte al punt isoelèctric (pI) de la proteïna determina la seva fixació: DEFINICIÓ El punt isoelèctric (pI) és el valor de pH en el qual la càrrega elèctrica neta global d'una biomolècula és zero (igual nombre de càrregues positives que negatives). A , l'ió hidrogen addicional s'uneix als grups ionitzables i la proteïna adopta càrrega positiva neta; a , predomina la càrrega negativa neta.

Per desenganxar i eluir els analits retinguts es fa passar un gradient d'una solució salina concentrada (alta força iònica) que competeix pels centres actius de la resina, o bé es varia el pH del medi. La regeneració de la fase estacionària es completa rentant l'excés de sals amb dos volums de columna de C -C 1 6 pH < π pH > π Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 13 tampó inicial. Cromatografia d'afinitat i HPLC La cromatografia d'afinitat aprofita l'alta especificitat biològica entre un analit i un lligand unit covalentment a la resina. Els parells habituals inclouen interaccions anticòs-antigen, enzim-substrat o lligand-receptor cel·lular.

Els components que no s'uneixen s'eliminen al rentat, i la biomolècula d'interès s'elueix específicament competint amb solucions del lligand lliure o mitjançant canvis reversibles de pH. La cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) empra bombes que impulsen el solvent a alta pressió a través de columnes amb fases estacionàries de partícules molt petites i extremadament denses. Aquest disseny redueix la difusió i atorga una resolució molt superior, facilitant la quantificació de traces a nivell de parts per trilió (ppt) amb gran reproductibilitat analítica. COMPROVA-HO 19 Quina càrrega neta tindrà una proteïna amb pI = 5,0 si es troba en un tampó a pH = 7,4?

PROCÉS Passos del procés de dessalat en filtració en gel 1 Injecció de la mescla Mostra de proteïna amb elevada concentració de sals 2 Pas per porus grans Proteïnes queden excloses del volum intern 3 Elució de proteïnes Surt primer al volum mort (senyal UV a 280 nm) 4 Elució de sals Surt posteriorment (senyal per conductivitat) IDEES CLAU A la filtració en gel, les molècules grans s'exclouen i elueixen al volum mort ( ), mentre que les petites elueixen més tard. El paràmetre mesura la fracció de porus accessibles. Els intercanviadors catiònics tenen una matriu amb grups negatius i retenen analits positius. A les proteïnes tenen càrrega neta positiva, i a tenen càrrega neta negativa.

L'HPLC aplica alta pressió a columnes denses per aconseguir resolució a nivell de traces (parts per trilió). COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 20. Quina substància químicament oxidant catalitza la polimerització dels gels de poliacrilamida juntament amb el TEMED? 21. Com s'elueixen les proteïnes retingudes electroestàticament en una columna d'intercanvi iònic? V 0 K = av (V e V )/(V 0 t V ) 0 pH < pI pH > pI Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 14 Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 22. Quin compost elueix primer en una columna de filtració en gel? 23. De quins monòmers està compost el polisacàrid agarosa? 24.

Quina càrrega tenen els grups funcionals fixats en una resina de bescanvi catiònic? 25. Quin és l'avantatge clau de l'HPLC respecte a la cromatografia en columna clàssica? 4 Electroforesi: principis físics i factors d'influència EN ACABAR SABRÀS Relacionar la velocitat electroforètica amb la càrrega, el camp i la fricció. Calcular la mobilitat electroforètica en funció del camp elèctric. Analitzar l'impacte de l'escalfament per efecte Joule en la separació de proteïnes. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 26 Què succeiria amb les bandes d'una electroforesi si apugem el voltatge al màxim per acabar abans?

Principis físics de la mobilitat electroforètica L'electroforesi consisteix en el transport de partícules carregades en un medi aquós sota la influència d'un camp elèctric extern.

La velocitat de migració ( ) s'expressa segons el balanç entre la força motriu elèctrica i la resistència friccional del medi: La molècula amb menor mida a) La molècula amb major pes molecular b) L'ió de sal més petit c) El solut més hidròfil d) Poliestirè reticulat a) Glucosa unida per C1 i C6 b) D-galactosa i 3,6-anhidro-L-galactosa c) Acrilamida i bisacrilamida d) Zwitteriònica a) Càrrega positiva b) Són completament neutres c) Càrrega negativa d) Separació únicament segons densitat a) Ús exclusiu de solvents volàtils b) Alta resolució i sensibilitat fins a traces c) Menor pressió hidràulica de treball d) v v = f E q (10) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 15 On els paràmetres representen: : càrrega neta de la biomolècula.

: intensitat del camp elèctric aplicat (mesurat en V/cm). : coeficient friccional, determinat per la massa, la conformació geomètrica de la molècula i la mida mitjana dels porus de la matriu del suport. La mobilitat electroforètica ( ) és la relació entre la velocitat de desplaçament i el camp elèctric: En establir la diferència de potencial, els anions (càrrega negativa) migren cap a l'ànode (+), mentre que els cations (càrrega positiva) es desplacen en direcció al càtode (-). Funció del tampó d'electroforesi La solució tampó actua com a vehicle conductor que transmet el camp elèctric gràcies a la presència dels seus ions en dissolució.

L'ajust del pH és fonamental per mantenir l'estabilitat estructural dels analits i definir la seva càrrega neta global, ja que el grau d'ionització depèn directament de la concentració de protons del medi. Efecte Joule i llei d'Ohm al sistema electroforètic El corrent que circula pel circuit d'electroforesi obeeix a la llei d'Ohm: Segons aquesta expressió, en augmentar el voltatge s'incrementa el corrent i la velocitat de separació. No obstant això, part de l'energia elèctrica es dissipa en forma de calor per l'anomenat efecte Joule: ERROR FREQÜENT Creure que augmentar lliurement el voltatge estalvia temps sense perjudicar el resultat.

Una generació excessiva de calor provoca efectes greus: desnaturalització tèrmica de proteïnes làbils, increment incontrolat de la difusió de les bandes i disminució de la viscositat del tampó. Això fa baixar la resistència ( ); a voltatge constant ( ), la intensitat ( ) augmenta acceleradament generant més calor tèrmica en un bucle que arruïna la resolució. Per minimitzar aquests problemes es dissenyen formats horitzontals o verticals dotats de sistemes de refrigeració activa o s'utilitza una font amb control de corrent continu per assegurar velocitats de separació homogènies. COMPROVA-HO 27 Cap a quin elèctrode migrarà una molècula amb càrrega neta negativa durant una cursa electroforètica?

q E f u u = E v (11) = I ΔV R ΔV = I R (12) P = I R 2 (13) R V I Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 16 CAUSES I CONSEQÜÈNCIES Camp elèctric intens Augment de corrent a través de la solució Dissipació de potència Producció de calor segons P = I²R Efecte Joule en electroforesi Desnaturalització Inestabilitat tèrmica de proteïnes Pèrdua de resolució Major taxa de difusió molecular IDEES CLAU La velocitat de migració depèn directament de la càrrega neta i del camp elèctric, i inversament del coeficient de fricció ( ). Els anions migren cap a l'ànode (+) i els cations cap al càtode (-). El tampó manté el pH estable (fixant la càrrega dels analits) i transmet el corrent elèctric.

La potència dissipada en forma de calor segueix l'expressió (efecte Joule). L'augment de temperatura indueix difusió de mostres, desnaturalització de proteïnes i alteracions en el corrent elèctric. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 28. Què representa el coeficient friccional f en l'equació de la velocitat electroforètica? 29. Per quin motiu una pujada de temperatura fa augmentar la intensitat si el voltatge es manté fix? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 30. Com es defineix la mobilitat electroforètica (u)? 31. A quin elèctrode es desplacen els cations durant l'electroforesi? 32. Quina conseqüència té l'efecte Joule en una electroforesi de proteïnes?

v = Eq/f P = I R 2 u = I · R a) u = E · q b) u = v · f c) u = v / E d) A l'ànode (+) a) Cap a cap, romanen immòbils b) A l'elèctrode de referència c) Al càtode (-) d) Increment de la viscositat del tampó a) Augment de la resistència del gel b) Risc de desnaturalització tèrmica c) Reducció de la taxa de difusió d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 17 33. Segons la llei d'Ohm, quina equació relaciona el voltatge, la intensitat i la resistència? 5 Centrifugació: fonaments físics, rotors i ultracentrifugació EN ACABAR SABRÀS Calcular la força centrífuga relativa (RCF) a partir de les rpm i el radi.

Formular la massa efectiva considerant la densitat del medi i el volum específic. Diferenciar les aplicacions del rotor basculant i el rotor d'angle fix. PENSA-HI ABANS DE LLEGIR 34 Per què dues centrífugues girant a les mateixes revolucions per minut (rpm) poden produir resultats de sedimentació completament diferents? Fonaments de la força centrífuga La centrifugació aplica un camp de forces centrífugues per accelerar la separació de partícules en suspensió segons la seva mida, forma i diferència de densitat respecte al solvent.

En sotmetre una partícula a rotació a una velocitat angular a una distància radial de l'eix, experimenta una força centrífuga ( ): On és l'acceleració centrífuga i representa la massa efectiva de la partícula. Aquesta massa efectiva corregeix l'empenta de flotabilitat exercida pel solvent: On és la massa real de la partícula, és el seu volum específic parcial (volum desplaçat per unitat de massa afegida) i és la densitat del solvent o medi.

Força centrífuga relativa (RCF) i revolucions per minut Als protocols de laboratori, la força centrífuga s'expressa de manera normalitzada com a múltiple de l'acceleració de la gravetat terrestre ( ) mitjançant la força centrífuga relativa (RCF, anomenada habitualment «nombre de vegades la gravetat»): Per relacionar les revolucions per minut (rpm) amb el radi de gir ( mesurat en centímetres) s'utilitza l'expressió analítica: ΔV = I · R a) ΔV = I² · R b) ΔV = I / R c) ΔV = q / f d) ω r F F = m ω r = 2 m a c (14) a c m m = m 0 m ρ = 0 v ˉ m (1 0 ρ) v ˉ (15) m 0 v ˉ ρ g RCF = g F (16) r Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 18 Aquesta conversió matemàtica o l'ús de nomogrames gràfics permet reproduir protocols de centrifugació entre centrífugues amb rotors de diferent diàmetre.

Components instrumentals i fraccions resultants L'equip consta bàsicament d'un motor, un eix de transmissió i un rotor que allotja els tubs (formats adaptats com els tubs tipus Eppendorf utilitzats en microcentrífugues). Després d'un cicle de centrifugació la mostra se separa habitualment en dues fases: Precipitat o sediment (pellet): agregat de components densos empaquetats al fons del tub. Sobrenadant: fase líquida clarificada que conté les molècules i partícules que no han sedimentat sota aquestes condicions.

Tipus de rotors La geometria del rotor condiciona la velocitat màxima permesa i la trajectòria de sedimentació: Tipus de rotor Orientació i característiques Comportament de separació Rotor d'angle fix Tubs allotjats en cavitats mecanitzades amb una inclinació fixa. El radi a la base és superior al de la part superior ( ), provocant . Permet assolir velocitats elevades. Les partícules col·lideixen amb la paret i llisquen cap al fons, formant un sediment compacte (pellet). Rotor basculant (swinging bucket) Els portatubs pengen lliurement i pivoten cap a la posició horitzontal durant la rotació activa.

El camp centrífug és paral·lel a l'eix del tub; idoni per separar bandes en gradients de densitat sense formar un pellet aixafat contra les parets. Rotor vertical («de tambor») Els tubs romanen completament verticals en tot moment. Trajectòria de sedimentació molt curta a través del diàmetre del tub; útil per a separacions ultraràpides en gradients. PER RECORDAR-HO En el rotor d'angle fix, com que el radi inferior és més gran que el superior ( ), la força centrífuga a la punta del tub és més gran que a la boca, impulsant amb força les partícules més grans cap al fons.

Ultracentrifugació Les ultracentrífugues constitueixen la instrumentació més complexa i avançada del laboratori de fraccionament subcel·lular. Poden assolir velocitats de gir d'entre 20.000 i 150.000 rpm, generant acceleracions centrífugues de fins a 1.500.000 g. A aquestes velocitats extremes, la fricció de les peces amb les molècules de l'aire generaria temperatures molt elevades capaços de desnaturalitzar les mostres biològiques.

Per resoldre aquest problema s'incorporen dues millores claus: una bomba de buit que extreu l'aire de la cambra del rotor RCF = (rpm) r (1,119 10 ) 2 5 (17) r > inf r sup F > c,inf F c,sup r > inf r sup Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 19 per eliminar el fregament, combinada amb un sistema integrat de refrigeració. COMPROVA-HO 35 Quina finalitat té la bomba de buit incorporada a les ultracentrífugues? ESQUEMA Classificació dels rotors de centrífuga IDEES CLAU La força centrífuga sobre una partícula depèn de la seva massa efectiva, la velocitat angular al quadrat i el radi ( ). La massa efectiva inclou la correcció de flotabilitat: .

La RCF mesura l'acceleració relativa a la gravetat segons . El rotor d'angle fix forma pellet ràpidament i suporta altes velocitats; el basculant manté fases planes en gradients de densitat. Les ultracentrífugues (fins a 150.000 rpm i 1.500.000 g) necessiten buit i refrigeració per dissipar l'escalfament per fregament. COMPROVA EL QUE HAS APRÈS 36. En què es diferencia el pellet del sobrenadant després d'una centrifugació? 37. Per què en un rotor d'angle fix la força centrífuga és superior a la part inferior del tub? Test Encercla la resposta correcta. Les solucions són al final. 38. Com varia la força centrífuga en augmentar la velocitat angular (ω)?

Rotor d'angle fix Tubs inclinats fixos; r_inf > r_sup; forma pellet ràpid Rotor basculant Pivota horitzontal; ideal per gradients de densitat Rotor vertical Tubs verticals; recorregut mínim a través del diàmetre F = mω r 2 m = m (1 0 ρ) v ˉ RCF = (rpm) r (1,119 10 ) 2 5 És independent de la velocitat a) Proporcional al quadrat (ω²) b) Disminueix inversament amb ω c) De manera lineal amb ω d) Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 20 39. Quin tipus de rotor és el més idoni per a separacions en gradients de densitat? 40. Quin camp centrífug relatiu màxim aproximat poden assolir les ultracentrífugues? 41. Què expressa el terme ρ a la fórmula de la massa efectiva de sedimentació?

6 Formulari Laboratori general, tampons i dilucions Fórmula o procediment Significat dels símbols Quan s'usa pH: acidesa; : força de l'àcid; : base conjugada; : àcid feble. Càlcul i formulació de tampons químics (Henderson- Hasselbalch). : volums inicial i final; : concentracions de la solució. Preparació de dissolucions de treball a partir de solucions estoc. : potencial elèctric; : potencial de referència; : gasos; : temperatura absoluta; : Faraday. Mesura potenciomètrica del pH amb elèctrode de vidre (Nernst). Preparació de tampó Pesada en balança analítica (amb barqueta) Dissolució en aigua pura Ajust de pH amb elèctrode Enrasament volumètric final.

Procediment estàndard de preparació de reactius tamponats. Espectroscòpia UV-Visible Fórmula o procediment Significat dels símbols Quan s'usa : absorbància (adimensional); : coeficient d'extinció molar ( ); : concentració (mol/L); : pas òptic (cm, sovint 1 cm). Quantificació de concentració d'analits en dissolució (Beer- Lambert).

Rotor continu d'acer a) Rotor d'angle fix b) Rotor d'angle cec c) Rotor basculant (swinging bucket) d) Fins a 10.000 g a) Fins a 50.000 g b) Fins a 20.000.000 g c) Fins a 1.500.000 g d) El volum específic de la mostra a) La densitat del solvent o medi b) El coeficient de fregament c) El radi de gir del rotor d) pH = pK + a log [HA] [A ] pK a [A ] [HA] V 1 C = 1 V 2 C 2 V , V 1 2 C , C 1 2 V = E + constant pH F 2,303RT V E constant R T F A = ε c d A ε L mol 1 cm 1 c d Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 21 Fórmula o procediment Significat dels símbols Quan s'usa : transmitància; : intensitat transmesa; : intensitat incident.

Fracció de llum transmesa registrada pel fotodetector. : absorbància; : transmitància en fracció molar; : percentatge de transmitància. Conversió directa de transmitància experimental a absorbància. Cromatografia en columna Fórmula o procediment Significat dels símbols Quan s'usa : fracció de porus disponibles; : volum d'elució de l'analit; : volum mort/buit; : volum total geomètric. Determinació del coeficient de partició en filtració en gel. Dessalat en columna de gel Injecció de la mescla proteïna-sal Proteïnes surten a (detectades a 280 nm) Sals surten retingudes (detectades per conductivitat). Separació ràpida de sals en preparats macromoleculars.

Elució en bescanvi iònic Unió a resina segons càrrega ( ) Rentat de molècules no unides Elució augmentant la força iònica (gradient salí) o modificant pH Regeneració amb 2 volums de columna de tampó. Fraccionament de proteïnes per interacció electroestàtica. Electroforesi Fórmula o procediment Significat dels símbols Quan s'usa : velocitat de migració; : camp elèctric (V/cm); : càrrega neta; : coeficient de fricció hidrodinàmic. Càlcul de la velocitat de desplaçament d'una partícula. : mobilitat electroforètica; : velocitat; : camp elèctric aplicat. Definició de la mobilitat electroforètica independent del camp.

: diferència de potencial; : intensitat de corrent; : resistència elèctrica del medi. Comportament elèctric del sistema electroforètic (llei d'Ohm). : potència dissipada en forma de calor; : corrent; : resistència. Avaluació de l'escalfament del medi (efecte Joule). T = I 0 I T I I 0 A = log T = 2 log(%T) A T %T K = av V V t 0 V V e 0 K av V e V 0 V t V 0 pH π v = f E q v E q f u = E v u v E ΔV = I R ΔV I R P = I 2 R P I R Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 22 Centrifugació Fórmula o procediment Significat dels símbols Quan s'usa : força centrífuga; : massa efectiva; : velocitat angular (rad/s); : radi de gir; : acceleració centrífuga.

Determinació de la força centrífuga absoluta sobre la partícula. RCF: força centrífuga relativa (en ); rpm: revolucions per minut; : radi en centímetres. Conversió de rpm a acceleració gravitatòria relativa per estandarditzar protocols. : massa efectiva; : massa real; : volum específic parcial; : densitat del solvent. Correcció de la massa per empenta de flotabilitat del solvent. Valors clau i errors típics Paràmetre o situació Valor o comportament correcte Error freqüent Aigua Tipus 1 (Ultrapura) Resistivitat teòrica de a . Utilitzar aigua purificada només per intercanvi iònic en UV (conté traces orgàniques absorbents). Detecció espectroscòpica Àcids nucleics: ; Proteïnes: .

Confondre màxims d'absorció entre proteïnes i àcids nucleics. Tampó i capacitat amortidora Interval útil: unitat de pH. Treballar a pH allunyat del , on la capacitat tamponant és pràcticament nul·la. Segellat amb Parafilm Compatible únicament amb solucions aquoses. Segellar recipients amb dissolvents orgànics no polars (cloroform, acetona), que el dissolen. Càrrega i punt isoelèctric (pI) Si : càrrega positiva neta; si : càrrega negativa neta. Confondre la càrrega de la biomolècula amb la del grup funcional de la resina. Voltatge en electroforesi Augmentar voltatge genera calor ( ), disminueix viscositat i augmenta difusió.

Creure que apujar el voltatge manté el corrent constant sense desnaturalitzar les mostres. F = m ω 2 r = m a c F m ω r a c RCF = (rpm) 2 r (1,119 10 ) 5 g r m = m (1 0 v ˉ ρ) m m 0 v ˉ ρ 18,2 MΩ cm 25 C 260 nm 280 nm pK ± a 1 pK a pH < π pH > π P = I R 2 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 23 Solucions de les preguntes de repàs 1. Perquè els canvis de densitat i la corrosió del plat per vapors o gotes alteren greument la balança, a més de la imprecisió volumètrica inherent de la pipeta graduada respecte al mètode aforat. 2.

La de Tipus 1 té màxima puresa (18,2 MΩ·cm) per a assajos sensibles com cultius o citometria; la de Tipus 3 és de baixa qualitat (<0,05 MΩ·cm) reservada a rentat i autoclau. 3. Presenta 3 valors de pKa perquè és una espècie polipròtica capaç de protonar-se i desprotonar-se successivament tres vegades. 4. El Parafilm és una pel·lícula de cera basada en hidrocarburs que es dissol immediatament en entrar en contacte amb dissolvents orgànics no polars com el cloroform o l'acetona. 5. El rang de màxima capacitat tamponant comprèn l'interval de unitats de pH. 6. d) 18,2 MΩ·cm. L'aigua Tipus 1 assoleix el límit teòric de resistivitat de 18,2 MΩ·cm a 25 °C. 7. c) Pipeta aforada o volumètrica.

La pipeta aforada conté un únic aforament i està dissenyada per a la màxima precisió analítica. 8. d) De 0,005 a 0,5 M. L'interval de concentració habitual per garantir capacitat amortidora suficient oscil·la entre 0,005 M i 0,5 M. 9. d) V1 = (V2 · C2) / C1. Aïllant de l'equació V1 · C1 = V2 · C2 s'obté directament V1 = (V2 · C2) / C1. 10. Perquè absorbeix selectivament les longituds d'ona corresponents al blau i al vermell, deixant passar sense absorbir la fracció de l'espectre corresponent al verd. 11. A = 2 - log(10) = 2 - 1 = 1,0 d'absorbància. 12. Els àcids nucleics presenten el màxim d'absorció a 260 nm i les proteïnes a 280 nm. 13. S'expressa en . 14. c) 260 nm.

Les bases nitrogenades dels àcids nucleics presenten un màxim d'absorció marcat a 260 nm. 15. c) El gruix del pas de llum. El terme d és el camí òptic o gruix de la cubeta, convencionalment fixat en 1 cm. 16. a) A = 2 - log(%T). Com que %T = T · 100, A = -log(T) = -log(%T / 100) = 2 - log(%T). 17. c) Retorn radiatiu amb emissió de fotó des de S1 a S0. La fluorescència és l'emissió radiativa que acompanya la transició des de l'estat excitat singlet S1 cap a l'estat fonamental S0. 18.

Perquè les molècules grans no poden penetrar dins els porus de les partícules del gel i viatgen directament per l'espai buit extern, mentre que les petites queden frenades recorrent el laberint intern de la resina. 19. Tindrà càrrega negativa neta, perquè el pH de la solució és superior al seu punt isoelèctric (pH > pI), i per tant s'unirà a un bescanviador aniònic. 20. El persulfat d'amoni (APS), que actua com a agent oxidant iniciador de radicals lliures. 21. Augmentant la força iònica del medi mitjançant una solució concentrada de sals que competeix amb la resina, o bé modificant el pH. 22. b) La molècula amb major pes molecular.

Les partícules més grosses no caben dins els porus del gel, prenen el camí més curt i elueixen al volum buit. pK ± a 1 L mol cm 1 1 Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 24 23. c) D-galactosa i 3,6-anhidro-L-galactosa. L'agarosa és un polímer natural constituït per subunitats alternades de D-galactosa i 3,6-anhidro-L-galactosa. 24. d) Càrrega negativa. Una resina de bescanvi catiònic disposa de grups funcionals negatius per atreure i retenir cations. 25. c) Alta resolució i sensibilitat fins a traces. L'elevada pressió aplicada sobre llits cromatogràfics fins i homogenis atorga una resolució molt superior. 26.

La calor excessiva per efecte Joule desnaturalitzaria les mostres i dilataria les bandes per difusió tèrmica, arruïnant la nitidesa de la separació. 27. Migrarà cap a l'ànode, ja que l'ànode és l'elèctrode positiu (+) en una cel·la d'electroforesi. 28. Representa la resistència al moviment que ofereix el medi, condicionada per la massa i forma de la molècula i per la mida dels porus del suport. 29. Perquè la calor redueix la viscositat del tampó, fet que redueix la resistència elèctrica ( ) i fa augmentar automàticament la intensitat ( ). 30. d) u = v / E. La mobilitat electroforètica és la relació entre la velocitat de migració i la intensitat del camp elèctric aplicat. 31. d) Al càtode (-).

Els cations tenen càrrega positiva i són atrets electroestàticament pel càtode negatiu. 32. c) Risc de desnaturalització tèrmica. La calor dissipada (P = I² · R) pot desnaturalitzar les proteïnes solubles i eixamplar les bandes per difusió. 33. a) ΔV = I · R. La diferència de potencial és directament proporcional a la intensitat del corrent per la resistència: ΔV = I · R. 34. Perquè la força de sedimentació (RCF) depèn directament del radi del rotor: a major radi, la força centrífuga aplicada sobre el tub és substancialment més alta malgrat mantenir les mateixes rpm. 35.

Elimina l'aire de la cambra per reduir la fricció mecànica amb el rotor, evitant que la mostra s'escalfi a temperatures extremes. 36. El pellet és el sediment acumulat al fons format pels components més densos o grans, mentre que el sobrenadant és la solució líquida clara romanent. 37. Perquè la distància radial a l'eix de gir és superior a la base del tub respecte a la part superior ( ). 38. b) Proporcional al quadrat (ω²). L'expressió física de la força centrífuga és F = m · ω² · r, variant amb el quadrat de la velocitat angular. 39. d) Rotor basculant (swinging bucket).

El rotor basculant orienta els tubs en paral·lel al camp centrífug, evitant la fricció amb les parets i preservant les bandes del gradient. 40. d) Fins a 1.500.000 g. Les ultracentrífugues funcionen fins a 150.000 rpm, arribant a valors de camp centrífug de fins a 1.500.000 g. 41. b) La densitat del solvent o medi. En l'equació de massa efectiva m = m0 - m0 · v̄ · ρ, la variable ρ representa la densitat del solvent líquid. R I = V /R r > inf r sup Tècniques Instrumentals Bàsiques: Apunts i Formulari 25