Problemes de Bioquímica i Metabolisme

Exercici 5. Inhibició competitiva de la succinat deshidrogenasa

El malonat actua com un inhibidor de tipus competitiu del succinat en la reacció catalitzada per l'enzim succinat deshidrogenasa.

Representeu raonadament com serien les rectes obtingudes en una gràfica de dobles recíprocs ($1/v_0$ enfront de $1/[\text{succinat}]$, Lineweaver-Burk) a tres concentracions diferents de malonat ($C_1 < C_2 < C_3$). Indiqueu quin comportament presenten la $V_{\max}$ i la $K_m$ aparent en cadascuna de les condicions.

Exercici 6. Termodinàmica de la isomerització de glucosa-fosfat

Els valors d'energia lliure estàndard d'hidròlisi ($\Delta G^{\circ\prime}$) de la glucosa 1-fosfat i de la glucosa 6-fosfat són, respectivament, de $-21\text{ kJ/mol}$ i $-14\text{ kJ/mol}$. Considerem la reacció d'isomerització reversible catalitzada per la fosfoglucomutasa:

Dada:

$R = 8{,}315\cdot 10^{-3}\text{ kJ/(mol}\cdot\text{K)}$

a)

Quin és el valor de la constant d'equilibri ($K_{\text{eq}}^{\prime}$) a $25\text{ }^{\circ}\text{C}$ per a aquesta reacció d'isomerització escrita en el sentit de transformació de glucosa 1-fosfat a glucosa 6-fosfat?

b)

Si es prepara una barreja que conté inicialment una concentració $1\text{ M}$ de glucosa 6-fosfat i $1\text{ mM}$ de glucosa 1-fosfat, quina serà la direcció termodinàmicament afavorida de la reacció a $25\text{ }^{\circ}\text{C}$?

Exercici 7. Equilibri químic de la reacció de l'hexoquinasa

Considereu la reacció catalitzada per l'enzim hexoquinasa:

ATP + glucosa $\rightleftharpoons$ ADP + glucosa-6-fosfat

Coneguts els valors de les energies lliures estàndard d'hidròlisi de l'enllaç fosfat de l'ATP ($-30{,}5\text{ kJ/mol}$) i de la glucosa-6-fosfat ($-13{,}8\text{ kJ/mol}$), calculeu les concentracions finals d'equilibri de tots els reactius i productes si s'incuba a $25\text{ }^\circ\text{C}$ una mescla amb concentracions inicials de $40\text{ mM}$ d'ATP i $20\text{ mM}$ de glucosa en presència d'hexoquinasa.

Dades: $R = 8{,}315\cdot 10^{-3}\text{ kJ/(mol}\cdot\text{K)}$, $T = 298\text{ K}$ ($RT = 2{,}478\text{ kJ/mol}$).

Exercici 10. Bioenergètica redox de la succinat deshidrogenasa

A la matriu mitocondrial, la concentració de succinat és 10 vegades superior a la de fumarat. Calculeu quina és la relació mínima necessària entre les concentracions de coenzims $[\text{FAD}]/[\text{FADH}_2]$ perquè la reacció catalitzada per la succinat deshidrogenasa esdevingui exergònica a temperatura fisiològica ($37\text{ }^\circ\text{C}$):

succinat + FAD $\rightleftharpoons$ fumarat + FADH$_2$

Dades dels potencials estàndard de reducció a pH 7 ($E^{\circ\prime}$):

Oxidant · Reductor · Nombre d'electrons ($n$) · $E^{\circ\prime}\text{ (V)}$

Fumarat · Succinat · $2\text{ e}^-$ · $+0{,}031$

FAD · FADH$_2$ · $2\text{ e}^-$ · $-0{,}22$

Constants: $F = 96{,}5\text{ kJ/(mol}\cdot\text{V)}$, $R = 8{,}315\cdot 10^{-3}\text{ kJ/(mol}\cdot\text{K)}$, $T = 310\text{ K}$ ($RT = 2{,}577\text{ kJ/mol}$).

Exercici 11. Potencials de reducció i energia lliure ascorbat-etanol

Es mescla una dissolució que conté deshidroascorbat 0,2 M i ascorbat 0,2 M amb una altra dissolució que conté acetaldehid 0,01 M i etanol 0,01 M a 25 °C i pH 7.

Les semireaccions de reducció i els seus potencials estàndard són:

$$\text{deshidroascorbat} + 2\text{H}^+ + 2\text{e}^- \rightarrow \text{ascorbat} \quad (E_0' = +0,06\text{ V})$$$$\text{acetaldehid} + 2\text{H}^+ + 2\text{e}^- \rightarrow \text{etanol} \quad (E_0' = -0,163\text{ V})$$

Dades: $F = 96,5\text{ kJ}/(\text{mol}\cdot\text{V})$, $RT = 2,477\text{ kJ}/\text{mol}$ a 25 °C.

a)

Calculeu $\Delta E^{0\prime}$ i $\Delta G^{0\prime}$ per a la transferència d'electrons entre aquests dos parells redox.

b)

Escriviu l'equació de la reacció neta termodinàmicament favorable que tindrà lloc i calculeu el seu valor real d'$\Delta G'$ a partir de les concentracions indicades.

Exercici 20. Espectrofotometria d'intermediaris del cicle de Krebs

En un extracte de teixit lliure de proteïnes, es van determinar determinats metabòlits del cicle dels àcids tricarboxílics mitjançant assajos espectrofotomètrics basats en la formació de NADH a 340 nm. La reacció d'anàlisi es va dur a terme en un volum total final d'1 mL, en una cubeta amb 1 cm de pas òptic, afegint successivament els enzims indicats a 0,1 mL de l'extracte.

Es van registrar les següents lectures d'absorbància a 340 nm un cop acabada cada reacció:

Components · Tub 1 · Tub 2 · Tub 3 · Tub 4

Extracte (0,1 mL) · + · + · + · +

$\text{NAD}^+$ (0,2 $\mu\text{mol}$) · + · + · + · +

Malat deshidrogenasa · - · + · + · +

Fumarasa · - · - · + · +

Succinat deshidrogenasa · - · - · - · +

Absorbància a 340 nm · 0,002 · 0,312 · 0,415 · 0,933

Dada: Coeficient d'extinció molar del NADH a 340 nm: $\Delta\varepsilon_{340} = 6200\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$.

a)

Quins productes intermediaris s'estan determinant a partir dels increments d'absorbància en afegir cadascun dels enzims?

b)

Quina quantitat (en $\mu\text{mols}$) hi havia de cadascun dels metabòlits en els 0,1 mL d'extracte assajat?

$\mu\text{mol}$

$\mu\text{mol}$

$\mu\text{mol}$

Exercici 21. Determinació espectrofotomètrica acoblada de creatina

Es vol determinar la concentració d'una dissolució incògnita de creatina. Per fer-ho, es disposa inicialment d'una mescla de reacció de 2,6 mL de volum que conté els enzims piruvat quinasa i lactat deshidrogenasa, a més de NADH, ADP i fosfoenolpiruvat (PEP). L'absorbància inicial d'aquesta mescla a 340 nm en cubeta d'1 cm de pas òptic és d'1,2 unitats.

A continuació s'afegeixen a la cubeta 60 µL de la mostra incògnita de creatina i 200 µL d'una solució de creatina fosfoquinasa (volum final = 2,86 mL). S'incuba a temperatura ambient durant 30 minuts fins que la reacció s'atura completament i l'absorbància a 340 nm assoleix un valor estable de 0,2 unitats.

Les reaccions acoblades que tenen lloc són:

$$\text{Creatina} + \text{ATP} \xrightarrow{\text{Creatina fosfoquinasa}} \text{Fosfocreatina} + \text{ADP}$$

$$\text{PEP} + \text{ADP} \xrightarrow{\text{Piruvat quinasa}} \text{Piruvat} + \text{ATP}$$

$$\text{Piruvat} + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{Lactat DH}} \text{Lactat} + \text{NAD}^+$$

Calculeu la concentració molar (en mM) de creatina a la solució inicial incògnita sabent que $\varepsilon_{340\text{ (NADH)}} = 6200\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$.

Exercici 22. Control respiratori i nivells de NADH en mitocondris

En una preparació de mitocondris fortament acoblats i en estat aerobi estacionari, es van realitzar mesures d'absorbància a 340 nm per avaluar el contingut de NADH intramitocondrial després d'efectuar addicions successives a la suspensió:

Addicions · Mostra 1 · Mostra 2 · Mostra 3 · Mostra 4

Mitocondris · + · + · + · +

Tampó fosfat · + · + · + · +

MgCl 2 · + · + · + · +

Malat · - · + · + · +

ADP · - · - · + · +

Oligomicina · - · - · - · +

Absorbància a 340 nm · 0,001 · 0,140 · 0,080 · 0,140

Indiqueu què s'està mesurant a 340 nm i expliqueu detalladament des del punt de vista bioquímic el comportament observat en cadascuna de les 4 condicions experimentals.

Exercici 23. Mesura de glucosa per reaccions enzimàtiques acoblades

Es vol determinar la concentració d'una solució problema de glucosa mitjançant un assaig espectrofotomètric acoblat a 340 nm. Es parteix d'un volum inicial de 2,6 mL d'una barreja amb piruvat quinasa, lactat deshidrogenasa (LDH), NADH, ADP i fosfoenolpiruvat (PEP). L'absorbància inicial d'aquest medi és d'1,2 unitats.

S'hi afegeixen 60 μL de la dissolució incògnita de glucosa i 200 μL d'una dissolució d'hexoquinasa (volum total = 2,86 mL). Es deixa reaccionar durant 30 minuts fins a estabilització de la lectura, obtenint un valor d'absorbància a 340 nm de 0,5 unitats.

Tenint en compte que &epsilon; 340 (NADH) = 6200 M -1 cm -1 i l = 1 cm, determineu la concentració de glucosa a la dissolució inicial.

Exercici 24. Bioenergètica del transport electrònic entre FADH2 i coenzim Q

El potencial estàndard de reducció del coenzim Q (ubiquinona, UQ) és de $+0{,}05\text{ V}$, i el del parell $\text{FAD}/\text{FADH}_2$ és de $-0{,}22\text{ V}$. Demostreu, fent servir aquests valors, que l'etapa d'oxidació del $\text{FADH}_2$ pel coenzim Q a la cadena de transport electrònic allibera teòricament suficient energia per produir la síntesi d'un mol d'ATP en condicions estàndard ($\Delta G^{\circ\prime}$ per a la hidròlisi de l'ATP $= -30{,}5\text{ kJ/mol}$; $F = 96{,}5\text{ kJ/(mol}\cdot\text{V)}$).

1.

Per què s'utilitza l'expressió «teòricament»? Es produeix síntesi directa d'ATP durant aquesta transferència electrònica en la cadena respiratòria?

2.

Exercici 25. Perfil de consum d'oxigen en suspensió mitocondrial

En un experiment utilitzant un elèctrode de Clark connectat a una cambra de reacció amb mitocondris aïllats en medi tampó isotònic, s'efectuen addicions successives en l'ordre que s'indica a continuació:

Preveieu i justifiqueu detalladament com evoluciona la concentració d'oxigen dissolt ([O₂]) en funció del temps després de cadascuna de les 8 addicions consecutives.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.