Pràctica 3. Qüestionari d'electroforesi de proteïnes en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Pregunta 1. Funció del SDS i del beta-mercaptoetanol

Expliqueu detalladament quin paper exerceixen el dodecilsulfat sòdic (SDS) i el β-mercaptoetanol en la preparació de mostres per a una electroforesi tipus SDS-PAGE.

Pregunta 2. Glicerol i escalfament de les mostres

Responeu a les següents qüestions relatives al tampó de càrrega ( loading buffer) i al tractament tèrmic de les mostres:

a)

Per quina raó s'afegeix glicerol o sacarosa a la composició del tampó de càrrega?

b)

Per què és necessari sotmetre la mostra a una temperatura superior a 90 °C un cop s'ha afegit el tampó de càrrega?

c)

Quines conseqüències tindria escalfar la mostra prèviament a la incorporació del tampó de càrrega?

Pregunta 3. Ordre d'addició dels components del gel

Durant la preparació dels gels de poliacrilamida (SDS-PAGE), determinats components s'han d'afegir en un ordre molt concret i just al final del procediment. Indiqueu quins són aquests reactius i justifiqueu el motiu pel qual no es poden incorporar des del començament.

Pregunta 4. Polaritat de migració en SDS-PAGE

Cap a quin elèctrode (ànode o càtode) migren les proteïnes sotmeses a una electroforesi en gel SDS-PAGE? Justifiqueu breument la resposta en funció de les càrregues elèctriques adquirides.

Pregunta 5. Migració en suport no restrictiu

Suposeu que, un cop afegit el tampó de càrrega a les mostres i després d'haver-les bullit, l'electroforesi es dugués a terme en un suport no restrictiu (sense efecte tamís molecular). A quina velocitat es mourien les proteïnes? Raoneu la resposta considerant quatre fraccions proteiques de mides diferents: molt petites (aprox. 10 kDa), petites (20-30 kDa), grans (50-70 kDa) i molt grans (més de 110 kDa).

Pregunta 6. Marcador de pes molecular

Què és un patró o marcador de pes molecular en electroforesi de proteïnes i quina utilitat té la seva inclusió al gel?

Pregunta 7. Percentatge d'acrilamida segons la mida

En funció de quin criteri es modifica el percentatge total d'acrilamida en formular un gel d'SDS-PAGE? Justifiqueu com s'escull en funció del rang de pesos moleculars de les mostres a analitzar.

Pregunta 8. Perfil electroforètic de llets

Si sotmetéssim a una electroforesi SDS-PAGE mostres de llet sencera de vaca (carril 1), llet semidesnatada de vaca (carril 2) i beguda de soja (carril 3):

a.

Quines diferències i semblances caldria esperar entre els carrils de les llets de vaca (carrils 1 i 2)?

b.

Quin perfil s'observaria al carril corresponent a la beguda de soja (carril 3)?

Justifiqueu la resposta basant-vos en la composició nutricional i proteica de cadascuna.

Pregunta 9. Càlcul i interpretació de l'Rf

Expliqueu breument el procediment per calcular la mobilitat relativa ($R_f$) d'una proteïna en un gel d'SDS-PAGE. Quins paràmetres cal mesurar sobre la imatge del gel?

A partir de la imatge proporcionada, exemplifiqueu el càlcul de l'$R_f$ per a la banda indicada a la figura amb una distància recorreguda de $48\text{ mm}$ quan el front del gel ha migrat $84\text{ mm}$.

Pregunta 10. Anàlisi d'un dímer proteic

Es vol verificar la puresa i l'estructura d'un complex proteic d'interès biològic format per dos monòmers iguals de 15 kDa cadascun units per ponts disulfur (representats a la figura en tons porpra i verd):

Indiqueu i justifiqueu:

a.

Quines bandes s'espera observar al carril 1 si la mostra es tracta amb tampó de càrrega que conté $\beta$-mercaptoetanol ?

b.

Quines bandes s'espera observar al carril 2 si la mostra es carrega amb un tampó que no conté $\beta$-mercaptoetanol ?

c.

Quin percentatge d'acrilamida seria el més aconsellable emprar per formular aquest gel. Raoneu la resposta.