Pràctica 2. Espectrofotometria i recta de calibratge de glucosa

Context

Aquesta pràctica té com a objectiu familiaritzar-se amb les tècniques d'espectrofotometria d'absorció molecular en el rang visible. Mitjançant la reacció enzimàtica de la glucosa oxidasa/peroxidasa es genera el cromògen quinonaimina. S'analitza el seu espectre per definir la longitud d'ona de treball, s'elabora una recta de calibratge amb patrons coneguts i es quantifica la concentració de glucosa en una mostra de sèrum equí.

Pregunta 1. Espectre d'absorció de la quinonaimina

Després de mesurar una solució patró de glucosa (1 mg/mL) sotmesa a la reacció cromogènica, s'obtenen els valors d'absorbància següents a diferents longituds d'ona:

Longitud d'ona (nm)

Absorbància

350 · 0,357

400 · 0,275

450 · 0,412

500 · 0,599

550 · 0,449

600 · 0,232

650 · 0,064

Representeu gràficament l'espectre d'absorció traçant l'absorbància en funció de la longitud d'ona.

Pregunta 2. Regió espectral i longitud d'ona màxima

A partir de les dades obtingudes en l'espectre d'absorció:

a.

Identifiqueu a quina regió de l'espectre electromagnètic s'ha dut a terme l'assaig.

b.

Indiqueu el valor de la longitud d'ona de màxima absorció ($\lambda_{\text{màx}}$) característica del compost quinonaimina.

Pregunta 3. Justificació del calibratge del blanc

Expliqueu de manera raonada quina és la funció de la solució de blanc en espectrofotometria i per quin motiu és imprescindible ajustar-lo a zero novament cada vegada que es canvia la longitud d'ona de mesura.

Pregunta 4. Càlcul de dilucions patró i lectures

Per establir la corba de calibratge es disposa d'una solució patró de glucosa concentrada a $10\text{ mg/mL}$. Es demana:

a. Calcular els volums de solució concentrada i d'aigua necessaris per preparar 6 patrons d'1 mL cadascun, amb concentracions compreses entre 0 i $2\text{ mg/mL}$, i completar la taula de dilucions següent:

[Glucosa] (mg/mL)

Volum de glucosa (10 mg/mL) (mL)

Volum d'H 2 O (mL)

0

0,5

1

1,25

1,75

2

b. Un cop afegit el reactiu enzimàtic i mesurada l'absorbància a 500 nm per a dues sèries diferents (Corba A i Corba B), s'han registrat les següents lectures:

[Glucosa] (mg/mL)

Absorbància (500 nm)

Corba A

Corba B

0

0,025

0,039

0,5

0,123

0,042

1

0,205

0,111

1,25

0,330

0,149

1,75

0,423

0,189

2

0,527

0,652

Pregunta 5. Validesa de la llei de Lambert-Beer

A partir de la representació gràfica de les dues sèries de patrons realitzades en un full de càlcul:

a)

Indiqueu si ambdues corbes compleixen la llei de Lambert-Beer i justifiqueu la resposta analitzant els paràmetres de regressió lineal ($R^2$ i equació de la recta).

b)

Doneu una explicació raonada sobre quina ha pogut ser la causa de les discrepàncies trobades entre la preparació de les mostres de la corba A i de la corba B.

Pregunta 6. Quantificació de glucosa sèrica i diagnòstic

S'analitza una mostra de sèrum sanguini procedent d'un cavall i s'obté una lectura d'absorbància de $0{,}170$ a $500\text{ nm}$.

a)

Emprant la recta de calibratge vàlida obtinguda amb les absorbàncies netes corregides respecte al blanc ($y = 0{,}2485x - 0{,}0221$), determineu la concentració de glucosa de la mostra en $\text{mg/mL}$ i en $\text{mg/100 mL}$.

b)

Sabent que el rang de referència fisiològic normal de glucèmia en cavalls se situa entre $55$ i $90\text{ mg/100 mL}$, formuleu una conclusió diagnòstica sobre l'estat clínic de l'animal.