Pràctica 3. Separació de proteïnes per electroforesi SDS-PAGE

Context

L'electroforesi en gel de poliacrilamida en presència de SDS (SDS-PAGE) és una tècnica fonamental per a la separació i caracterització de proteïnes en funció exclusivament de la seva massa molecular relativa ($M_r$). El tractament previ de les mostres amb SDS homogeneïtza la densitat de càrrega per unitat de massa, mentre que l'addició d'agents reductors com el $\beta$-mercaptoetanol trenca els ponts disulfur intercatenaris i intracatenaris.

Pregunta 1. Identificació de bandes i fonament de l'SDS-PAGE

A partir del gel d'electroforesi obtingut a la pràctica, responeu breument a les següents qüestions:

a.

Identifiqueu la posició de la caseïna a la mostra de llet sencera i analitzeu quines bandes proteiques apareixen exclusivament a la mostra de beguda de soja en comparació amb la llet sencera.

b.

Quina funció té el gel d'apilament ( stacking gel) en un sistema discontinu?

c.

Cap a quin elèctrode migren les proteïnes durant l'electroforesi i a què es deu aquest sentit de migració?

d.

Quin gel presentarà un poder de resolució superior per separar proteïnes de baix pes molecular: un gel d'acrilamida al 7,5 % o un al 15 %? Raoneu la resposta.

Pregunta 2. Càlcul de la massa molecular de la beta-caseïna

A partir de la imatge digitalitzada del gel d'electroforesi, s'han mesurat mitjançant anàlisi d'imatge les distàncies de migració de les bandes del patró de pesos moleculars i de la proteïna problema (β-caseïna):

La mobilitat relativa ($R_f$) es calcula com:

$$R_f = \frac{\text{distància migrada per la proteïna}}{\text{distància migrada pel front del colorant}}$$

Les dades obtingudes per a les proteïnes del patró són les següents:

Banda

Distància (px)

$R_f$

$M_r$ (kDa)

$\log(M_r)$

1 · 35,355 · 0,0609 · 250 · 2,3979

2 · 68,029 · 0,1173 · 150 · 2,1761

3 · 105,171 · 0,1813 · 100 · 2,0000

4 · 139,230 · 0,23997 · 75 · 1,8751

5 · 216,592 · 0,3733 · 50 · 1,6990

6 · 286,393 · 0,4936 · 37 · 1,5682

7 · 404,317 · 0,6969 · 25 · 1,3979

8 · 464,349 · 0,8003 · 20 · 1,3010

9 · 549,263 · 0,9467 · 15 · 1,1761

10 (front) · 580,194 · 1,0000 · — · —

a)

Representeu la recta de calibratge de $\log(M_r)$ enfront del coeficient de migració relativa ($R_f$) i indiqueu la seva equació de regressió lineal.

b)

Sabent que la banda corresponent a la β-caseïna va migrar una distància de 368,049 píxels ($R_f\text{ experimental} = 0,63$), determineu la seva massa molecular estimada ($M_r$) i valoreu la fiabilitat del resultat obtingut.

Pregunta 3. Anàlisi electroforètica d'una proteïna dimèrica

Es disposa d'una proteïna homodimèrica formada per dues cadenes idèntiques unides entre si per ponts disulfur intercatenaris, tal com s'indica a la representació estructural. Cada monòmer té una massa molecular de 15 kDa:

a)

Representeu de forma esquemàtica el patró de bandes que s'observaria en un gel de SDS-PAGE en dues condicions diferents: carril 1, preparat amb tampó de càrrega amb $\beta$-mercaptoetanol; i carril 2, en absència d'agent reductor.

b)

Indiqueu i justifiqueu quin percentatge d'acrilamida triaríeu per resoldre adequadament ambdues condicions.

Pregunta 4. Preparació i càrrega de mostres de llet

Es volen carregar en dos carrils d'un gel SDS-PAGE exactament 20 μg de proteïna total procedent de mostres comercials de llet sencera i de beguda de soja. El volum que es dipositarà a cada pouet serà de 15 μL, però es preparen 30 μL de mescla total per evitar problemes d'evaporació o pèrdues durant el tractament tèrmic.

Segons la informació nutricional de les etiquetes:

Llet sencera: 3,0 g de proteïna per cada 100 mL.

Beguda de soja: 3,3 g de proteïna per cada 100 mL.

Es disposa d'un tampó de càrrega concentrat 6x ( gel loading buffer) i de tampó PBS per ajustar el volum.

a)

Calculeu el volum de cada mostra (llet sencera i beguda de soja) que s'ha de prendre per preparar els 30 μL de mescla de càrrega.

b)

Calculeu el volum de tampó de càrrega 6x requerit.

c)

Detalleu la composició final dels 30 μL de mescla per a cada mostra abans de carregar els 15 μL al gel (indiqueu el volum de PBS afegit en cadascuna):