Pràctica 1: Determinació de la concentració de glucosa per espectrofotometria

Pregunta 1. Espectre d'absorció de la quinonaimina

Per tal de determinar la longitud d'ona idònia de treball, s'ha preparat una mostra problema mesclant $20\ \mu\text{L}$ de solució patró de glucosa de $1\ \text{mg/mL}$ amb $1\ \text{mL}$ de reactiu enzimàtic de color, juntament amb un tub de blanc fotomètric ($20\ \mu\text{L}$ de $\text{H}_2\text{O}$ destil·lada i $1\ \text{mL}$ de reactiu). Després d'incubar ambdues solucions en bany maria a $37\ ^\circ\text{C}$ durant 10 minuts, s'han pres les lectures d'absorbància corresponents entre $350\ \text{nm}$ i $650\ \text{nm}$, posant a zero l'aparell amb el blanc abans de cada mesura.

A continuació es detallen els registres d'absorbància obtinguts:

Longitud d'ona (nm)

Absorbància (UA)

350 · 0,445

400 · 0,412

450 · 0,381

500 · 0,739

550 · 0,529

600 · 0,160

650 · 0,022

Representeu gràficament l'espectre d'absorció (absorbància enfront de la longitud d'ona) per al cromogen quinonaimina.

Pregunta 2. Regió espectral i pic d'absorbància màxima

A continuació es detallen els registres d'absorbància obtinguts:

Longitud d'ona (nm)

Absorbància (UA)

350 · 0,445

400 · 0,412

450 · 0,381

500 · 0,739

550 · 0,529

600 · 0,160

650 · 0,022

A partir de les dades espectrals de la quinonaimina obtingudes anteriorment, responeu a les següents qüestions:

a.

En quina regió de l'espectre electromagnètic s'ha realitzat l'escombrat espectral?

b.

A quina longitud d'ona exacta se situa el màxim d'absorció d'aquest cromòfor?

Pregunta 3. Necessitat del calibratge amb el blanc

Per quina raó tècnica és fonamental preparar un tub en blanc i recalibrar (posar a zero) l'espectrofotòmetre cada vegada que es canvia la longitud d'ona de mesura?

Pregunta 4 (Part 2). Preparació de dilucions patró de glucosa

Per construir la recta patró es disposa al laboratori d'una solució estoc concentrada de glucosa a $10\text{ mg/mL}$. Cal preparar sis dilucions estàndard amb concentracions compreses entre $0$ i $2\text{ mg/mL}$ en aigua destil·lada ($\text{H}_2\text{O}$), fixant un volum final d'$1\text{ mL}$ per a cadascuna.

Completeu la taula indicant els volums necessaris (en mL) de solució estoc de glucosa i d'aigua destil·lada per a cada patró:

[Glucosa] (mg/mL) · mL de glucosa (10 mg/mL) · mL H 2 O

0

0,5

1

1,25

1,75

2

Pregunta 4 (Part 3). Recta de calibratge i llei de Lambert-Beer

Seguint el procediment de mesura a la longitud d'ona seleccionada (500 nm), es van mesclar $20\ \mu\text{L}$ de cadascun dels patrons preparats amb $1\ \text{mL}$ de reactiu, incubant a $37\ ^\circ\text{C}$ durant 10 minuts.

S'han recollit les següents lectures d'absorbància:

[Glucosa] (mg/mL) · Absorbància a 500 nm (UA)

0 · 0,006

0,5 · 0,433

1 · 0,739

1,25 · 0,842

1,75 · 1,342

2 · 1,739

a)

Representeu la recta de calibratge mitjançant un full de càlcul i indiqueu l'equació de regressió lineal i el coeficient de determinació ($R^2$).

b)

Es compleix la llei de Lambert-Beer en aquest interval de concentracions? Justifiqueu la resposta basant-vos en els paràmetres estadístics.

Pregunta 5. Determinació de glucosa en sèrum equí i diagnòstic

Es vol determinar la concentració de glucosa en una mostra de sèrum de cavall seguint el protocol analític establert ($20\ \mu\text{L}$ de sèrum + $1\ \text{mL}$ de reactiu, $10\ \text{min}$ a $37\ ^\circ\text{C}$, mesura a $500\ \text{nm}$):

S'han realitzat dues lectures independents de la mostra de sèrum:

Absorbància 1 = 0,366

Absorbància 2 = 0,371

a)

Calculeu l'absorbància mitjana de la mostra.

b)

Emprant l'equació de la recta patró ($y = m \cdot x + n$), determineu la concentració de glucosa expressada en mg/mL i posteriorment en mg/100 mL (o mg/dL).

Nota: Utilitzeu l'equació obtinguda a la recta de calibratge ($y = 0{,}8147x - 0{,}0325$).

c)

Tenint en compte que els nivells basals fisiològics de glucosa en cavalls se situen entre 55 i 90 mg/dL, establiu quin diagnòstic clínic suggereix el resultat obtingut i comenteu les possibles causes biològiques.