Aufgabe Vorschlag A - Aufgabe 2 (2.4) · Abitur Hessen Biologietechnik LK 2022
Thema: Gentechnische Verfahren und transgene Organismen · Aus der Prüfung LK (2022)
Aufgabenstellung
Beim Diabetes mellitus Syndrom unterscheidet man zwischen dem Diabetes Typ-I und dem Diabetes Typ-II. Der Diabetes Typ-I ist eine so genannte Autoimmunerkrankung, bei dem sich die körpereigene Abwehr gegen Zellen richtet, in diesem Fall gegen die -Zellen der Bauchspeicheldrüse. In Folge der vernichteten -Zellen kann der Typ-I-Diabetiker kein Insulin mehr produzieren. Die Menschen mit Diabetes-Typ-I-Syndrom sind somit auf die Zufuhr von Insulin angewiesen. Insulin ist notwendig, um Glukose aus dem Blut in Zellen aufnehmen zu können. Insulin wird inzwischen fast ausschließlich biotechnologisch hergestellt. Beim Diabetes-Typ-II-Syndrom sind die -Zellen intakt. Häufig fehlen bei diesem Diabetes-Typ Insulinrezeptoren an den Zielzellen.
Die Synthese des Insulins in den -Zellen beginnt mit der Translation der m-RNA und endet mit der Abgabe ins Zytoplasma. Das so genannte Proinsulin enthält neben der A-Kette und der B-Kette noch ein C-Peptid. Das Proinsulin kann sich im Endoplasmatischen Retikulum falten und wird dann in den Golgi-Apparat aufgenommen. Die Abspaltung des C-Peptids erfolgt durch membranständige Proteasen.
Das im Blut zirkulierende Insulin wird in der Leber und den Nieren enzymatisch abgebaut. Dadurch beträgt die Halbwertszeit von Insulin etwa 7 bis 15 Minuten. Das gleichzeitig von den -Zellen abgegebene C-Peptid besitzt eine 10-mal höhere Halbwertszeit. Der Nachweis von Insulin und auch vom C-Peptid kann durch einen Immunoassay (ELISA) erbracht werden.
Material 5: Insulinmolekül
geändert nach: https://www.euroclinix.net/de/diabetes/insulin (abgerufen am 20.08.2019).
Material 6: Teilabschnitt ELISA
Hinweis: HRP ist die Abkürzung für die Meerrettichperoxidase, von englisch horseradish.
geändert nach: https://www.mybiosource.com/learn/wp-content/uploads/2017/06/Sanwich-ELISA.jpg (abgerufen am 23.08.2019).
2.4 Insulin soll biotechnologisch mit gentechnisch veränderten E. coli Stämmen hergestellt werden. Das für Insulin codierende Gen soll durch eine cDNA gewonnen werden. Zur Selektion der geeigneten Bakterienzellen werden zwei verschiedene Antibiotika eingesetzt.
Zeigen Sie die Schritte (beginnend bei der Herstellung der cDNA) bei der biotechnologischen Produktion von Insulin mit den genannten Vorgaben auf und fertigen Sie beschriftete Skizzen zum vorliegenden Selektionsverfahren an.
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Ihre Angaben wurden gespeichert. Vergleichen Sie Ihre Beschreibung und Skizzen mit den untenstehenden Lösungshinweisen und Kriterien.
Lösung
Nach den offiziellen Korrekturhinweisen
Zeigen Sie die Schritte (beginnend bei der Herstellung der cDNA) bei der biotechnologischen Produktion von Insulin mit den genannten Vorgaben auf.
Lösung: 1. cDNA-Herstellung: - Isolierung der mRNA des Insulingens aus den -Zellen der Bauchspeicheldrüse. - Synthese eines Einzelstrang-cDNA-Moleküls mittels Reverser Transkriptase. - Denaturierung des mRNA-cDNA-Doppelstrangs und Synthese des zweiten cDNA-Strangs mittels DNA-Polymerase zum doppelsträngigen „Insulin“-cDNA-Molekül. - Anfügen von kohäsiven Enden (*sticky ends*), passend zu den Schnittstellen des Plasmid-Vektors. 2. Klonierung & Transformation: - Konstruktion eines Expressionsvektors mit zwei Antibiotika-Resistenzgenen als Markergene. - Schneiden eines der Resistenzgene mit einem passenden Restriktionsenzym, sodass komplementäre *sticky ends* entstehen (Insertionsinaktivierung). - Vektor enthält einen bakteriellen Promotor. - Transformation der Plasmide in *E. coli*-Zellen (z. B. durch Elektroporation). 3. Kultivierung & Aufreinigung: - Selektion der rekombinanten Bakterienzellen mithilfe der Markergene. - Weiterkultivierung der Bakterienzellen mit eingebauter „Insulin“-cDNA in geeignetem Nährmedium (Optimierung von Nährstoffen, Temperatur, pH-Wert, Sauerstoffeintrag). - Expression von Proinsulin, anschließende Extraktion und Aufreinigung. - Posttranslationale Modifikationen: Faltung der Ketten, Oxidation der Cystein-Reste (Ausbildung von Disulfidbrücken), Abspaltung des C-Peptids zum nativen Insulin.
Fertigen Sie beschriftete Skizzen zum vorliegenden Selektionsverfahren an.
Lösung: Skizzenaufbau und Beschriftung des Selektionsverfahrens: - Bakterientypen: - Typ A: Rekombinantes Plasmid mit Fremdgen (Klonierung erfolgreich, Resistenzgen 2 wie Kanamycin durch Insertion zerstört; Resistenzgen 1 wie Ampicillin intakt). - Typ B: Rezirkularisiertes Plasmid ohne Fremdgen (beide Antibiotikaresistenzen bleiben erhalten). - Typ C: Zelle ohne Plasmid (nicht transformiert, keine Antibiotikaresistenz). - Stempeltechnik (Replica Plating): - Platte 1 (Vollmedium mit Ampicillin): Zellen vom Typ A und B wachsen (Koloniebildung), Zellen vom Typ C sterben ab (kein Wachstum). - Platte 2 (Selektivnährmedium mit Kanamycin / Überstempeln): Nur Zellen vom Typ B wachsen weiter. Kolonien vom Typ A und C zeigen kein Wachstum. - Identifikation: Die Kolonien, die auf der Ampicillin-Platte wuchsen, aber auf der Kanamycin-Platte fehlen (Typ A), sind die gesuchten Klone mit inseriertem Insulingen und werden von der Masterplatte isoliert.
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Aufgabe Vorschlag B - Aufgaben 1.5 und 1.6 · LK 2021 ›