Pregunta 1. Explica de manera concisa el fundamento físico-químico y el mecanismo de separación de la cromatografía de…
Técnicas bioquímicas y de biología molecular
Contexto
La cromatografía engloba un conjunto de técnicas de separación basadas en la distribución diferencial de los componentes de una mezcla entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil que fluye a través de ella. En esta sesión de laboratorio se aplican dos modalidades fundamentales: la cromatografía de repartición en capa fina (TLC sobre celulosa) para caracterizar mezclas de aminoácidos según su polaridad relativa, y la cromatografía de filtración en gel (exclusión molecular sobre matriz porosa de Sephadex G-25) para discriminar compuestos en función de su tamaño y peso molecular relativo.
1. Pregunta 1. Fundamento de la cromatografía de repartición y de gel-filtración
Explica de manera concisa el fundamento físico-químico y el mecanismo de separación de las dos modalidades cromatográficas empleadas en la práctica:
a)
b)
Pregunta 2. A partir de la placa cromatográfica de aminoácidos tras revelado con ninhidrina: a) Indicar la distancia…
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Pregunta 2. Esquema de migración, cálculo de Rf e identificación en mezcla
A partir de la placa cromatográfica de celulosa obtenida en el laboratorio tras el revelado con ninhidrina:
a)
Indica la distancia migrada por el frente del disolvente y las distancias de avance registradas para los aminoácidos patrón: Leucina (Leu), Arginina (Arg), Metionina (Met) y Prolina (Pro).
b)
Calcula el factor de retardo () correspondiente a cada uno de los patrones ensayados.
c)
Describe la coloración observada tras la reacción con ninhidrina justificando la diferencia mostrada por la Prolina.
d)
Analiza la calle correspondiente a la mezcla incógnita ( Mix) e identifica qué aminoácidos pueden distinguirse claramente en comparación con los patrones individuales.
Pregunta 3. Identifica la composición y naturaleza química de la fase móvil y la fase estacionaria en el ensayo de…
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Pregunta 3. Fases móvil y estacionaria en la cromatografía en capa fina
En el ensayo de cromatografía en capa fina efectuado para separar aminoácidos, identifica:
a.
La composición y naturaleza química de la fase móvil utilizada.
b.
La naturaleza y el soporte que constituyen la fase estacionaria.
Pregunta 4. Justifica razonadamente el comportamiento de migración de los aminoácidos en la placa de celulosa: cuáles…
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Pregunta 4. Relación entre polaridad y velocidad de migración de los aminoácidos
Justifica razonadamente el comportamiento de migración de los aminoácidos en la placa de celulosa:
a.
¿Qué aminoácidos avanzan con mayor rapidez, los más polares o los más apolares?
b.
Explica el motivo basándote en la interacción de los solutos con la fase móvil y la fase estacionaria.
Pregunta 5. Interpretación del perfil de elución en columna Sephadex G-25 para azul de dextrano y dicromato potásico:…
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Pregunta 5. Cromatograma de elución de azul de dextrano y dicromato potásico
En la cromatografía de exclusión molecular sobre columna de Sephadex G-25 se depositó una mezcla coloreada formada por azul de dextrano y dicromato potásico. A continuación se muestra el perfil de elución obtenido (absorbancia frente al número de tubo/fracción recogida):
a)
Indica en qué orden y en qué fracciones eluyen ambos componentes.
b)
¿Cuál de las dos sustancias posee mayor peso molecular y cómo se relaciona esto con el volumen de elución obtenido?
Pregunta 6. Explicar el procedimiento experimental para estimar con precisión el peso molecular de una biomolécula…
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Pregunta 6. Estimación del peso molecular de una molécula mediante gel-filtración
Explica el procedimiento experimental que permitiría estimar con precisión el peso molecular de una biomolécula incógnita empleando una columna de cromatografía de gel-filtración.
