Qüestionaris de seminaris: Tecnologia del DNA i Biologia Molecular

Seminari 1: Qüestions 1-8. Propietats i tipus d'extrems d'enzims de restricció

Contesteu a les següents preguntes indicant si les afirmacions són veritables (V) o falses (F), o triant l'opció o opcions correctes entre les proposades. Podeu consultar la taula adjunta amb les dianes de restricció:

a.

El DNA té una estabilitat química tan elevada que no requereix cap precaució específica durant la seua manipulació al laboratori. (V / F)

V

F

b.

Els enzims de restricció de tipus II es classifiquen com a:

1. Nucleases

2. Exonucleases

3. Endonucleases

c.

L'activitat dels enzims de restricció consisteix a trencar els enllaços d'hidrogen establerts entre bases complementàries. (V / F)

V

F

d.

Com a norma general, les endonucleases de restricció reconeixen i escindeixen seqüències palindròmiques. (V / F)

V

F

e.

En una doble hèlix de DNA, els palíndroms consisteixen en repeticions invertides situades a la mateixa cadena. (V / F)

V

F

f.

Indiqueu quin o quins dels següents enzims generen extrems protuberants en 3':

1. EcoRV

2. PstI

3. EcoRI

g.

Indiqueu quin o quins dels següents enzims generen extrems protuberants en 5':

1. BamHI

2. EcoRI

3. HindIII

h.

Indiqueu quin o quins dels següents enzims produeixen extrems roms:

1. ClaI

2. PvuII

3. HaeIII

2. Seminari 1: Taula d'extrems generats per endonucleases

A partir de la informació de les dianes i punts de tall (on / indica tall a la cadena superior i \ a la cadena inferior; N = qualsevol nucleòtid), completeu la darrera columna de la taula especificant el tipus d'extrem que genera cada enzim (rom, protuberant 5' o protuberant 3'):

Nom de l'enzim · Bacteri d'origen · Diana i punt de tall

(N= qualsevol nt.) · Tipus d'extrems

3. Seminari 1: Qüestions 9-11. Compatibilitat d'extrems i lligació

a)

Els extrems generats per digestió amb BamHI i EcoRI són compatibles entre si i es poden unir directament mitjançant una ligasa. Si s'escau, representeu l'aparellament. (V / F)

BamHI i EcoRI generen extrems compatibles directament lligables:

b)

Els extrems de DNA generats amb PvuII i EcoRV són compatibles i poden lligar-se covalentment. (V / F)

Extrems generats amb PvuII i EcoRV poden lligar-se covalentment:

c)

En el producte resultant d'una reacció de lligació, en quins dels següents casos es regeneren amb certesa les dianes de restricció originals?

Seminari 1: Pregunta 12. Tipus de seqüències repetides i estructura

Observeu les tres seqüències de doble cadena que es mostren a continuació:

a)

Anomeneu cadascun dels tres tipus de seqüències representades segons la seua disposició.

b)

Indiqueu quina d'aquestes tres seqüències té la capacitat d'adoptar estructures secundàries intramoleculars (com ara bucles o forquilles) quan les cadenes se separen.

Seminari 1: Qüestions 13-21. Propietats de les DNA polimerases

Respon les següents afirmacions sobre les propietats i funcions de les DNA polimerases (V/F o tria l'opció correcta):

a. Les DNA polimerases són capaces d'iniciar la síntesi de novo d'una cadena de DNA simplement incorporant el primer desoxirribonucleòtid complementari al motlle.

b. En assajos in vitro només és possible emprar fragments de RNA com a encebadors ( primers) per a les DNA polimerases.

c. Les DNA polimerases sintetitzen i allarguen les cadenes de DNA exclusivament en direcció 5' cap a 3'.

d. Una DNA polimerasa pot elongar una cadena en creixement encara que aquesta no dispose d'un grup 3'-hidroxil lliure.

e. En condicions fisiològiques in vivo, les DNA polimerases incorporen amb una freqüència molt alta bases no complementàries a la cadena motlle.

f. En experiments in vitro s'utilitza el fragment Klenow de la DNA polimerasa I pel fet que manca totalment de qualsevol activitat exonucleasa.

g. L'activitat exonucleasa 5' a 3' de la DNA polimerasa escindeix enllaços fosfodièster a partir de l'extrem 5'-fosfat de les cadenes de DNA.

h. L'activitat exonucleasa 3' a 5' de la DNA polimerasa degrada el DNA eliminant nucleòtids des d'un extrem 3'-OH lliure.

i. L'activitat responsable de la correcció d'errors ( proofreading) de la DNA polimerasa I és:

1

L'activitat exonucleasa 5' a 3'

2

L'activitat exonucleasa 3' a 5'

Seminari 2: Qüestions 1-9. Principis de l'electroforesi en gel d'agarosa

Avalueu la veracitat de les següents afirmacions relatives a l'electroforesi d'àcids nucleics i l'anàlisi de fragments de restricció (V / F):

.

Seminari 2: Pregunta 10. Mapa de restricció lineal i circular

La digestió completa d'un fragment de DNA lineal de 4 Kb mitjançant els enzims BamHI i HindIII (digestions simples i doble) genera els fragments recollits a la taula:

HindIII · BamHI · HindIII/

BamHI

2,8 Kb · 1,8 Kb · 1,8 Kb

1,2 Kb · 1,3 Kb · 1 Kb

· 0,9 Kb · 0,9 Kb

· · 0,3 Kb

a)

D'acord amb aquestes dades, determineu quin dels dos esquemes (A o B) reflecteix l'ordenació correcta de les dianes al DNA lineal:

A

Opció A:

B

Opció B:

b)

Suposeu ara que aquesta mateixa molècula de 4 Kb fóra circular tancada amb les mateixes distàncies relatives entre dianes. Deduïu quins fragments es generarien en les digestions simple i doble, completeu la taula de restricció corresponent i situeu les dianes a l'esquema circular:

Escriviu la mida dels fragments obtinguts (ex. 4 Kb, 2,7 Kb, etc.):

HindIII · BamHI · HindIII/

BamHI

Seminari 2: Pregunta 11. Interpretació de gel d'agarosa i mapa de restricció

Es digereix un fragment lineal de DNA d'1.100 pb amb els enzims EcoRI i HindIII en digestions senzilles i dobles. Els productes es carreguen en un gel d'agarosa al costat d'un marcador de pes molecular format per bandes de: 2000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 i 100 pb.

a.

Comproveu el patró electroforètic i deduïu la mida aproximada dels fragments generats, omplint la taula següent (en pb, en ordre decreixent per columna):

EcoR I · Hind III · Eco RI / Hind III

pb

· pb

· pb

pb

· pb

· pb

· · pb

b.

Indiqueu el nombre de dianes i fragments resultants per a cada enzim:

1. Quantes dianes d'EcoRI conté el fragment inicial?

2. Quants fragments genera la digestió amb EcoRI?

3. Quantes dianes d'HindIII hi ha?

4. Quants fragments genera HindIII?

c.

Identifiqueu quina de les tres propostes de mapa (A, B o C) representa fidelment la disposició de les dianes:

A

B

C

Seminari 2: Pregunta 12. Localització de dianes d'AatII en una seqüència

L'enzim de restricció AatII reconeix i talla la seqüència palindròmica 5'-G A C G T C-3' (talla després de la T: 5'-GACGT/C-3').

Considereu el següent fragment de DNA de 600 parells de bases:

1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG

51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC

101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCA

151 CGCGTGGAGC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT

201 AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC

251 TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG

301 TTCCCATAGT AACGTCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG

351 TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC

401 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT

451 ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC

501 GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA

551 TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA a)

Localitzeu a quines posicions es troben les dianes de restricció per a AatII (5'-GACGT C-3') compreses entre els nucleòtids 251 i 350.

b)

Si aquest DNA lineal es digereix completament amb l'enzim AatII tenint en compte aquestes dues dianes, quants fragments es generen i quina és la seua mida aproximada?

Seminari 4: Qüestions 1-8. Fonaments de vectors plasmídics i clonatge

Indiqueu la resposta correcta o el valor de veritat (V / F) per a les següents afirmacions sobre clonatge molecular:

a.

Els plasmidis emprats de forma habitual com a vectors en tècniques de clonació són molècules lineals de DNA de doble cadena.

V

F

b.

Si l'objectiu experimental és clonar un fragment de DNA petit (mida inferior a 10 Kb), quin dels següents vectors s'utilitza preferentment?

.

c.

Els vectors plasmídics presenten habitualment nombroses dianes repetides per als enzims de restricció més utilitzats per facilitar el procés d'inserció.

V

F

d.

Per inserir un fragment de DNA amb una orientació unívoca i definida (clonació dirigida), cal digerir ambdós extrems del vector i del fragment amb el mateix enzim de restricció.

V

F

e.

Quan s'introdueix un fragment de DNA d'interès a l'interior de la seqüència codificant d'un gen marcador d'un vector, aquest gen queda generalment inactivat.

V

F

f.

Si la intenció final del clonatge és expressar una proteïna funcional a la cèl·lula hoste, no cal que la inserció es realitze de forma dirigida.

V

F

g.

Un cultiu bacterià portador d'un plasmidi que posseeix un gen intacte de resistència a l'ampicil·lina creixerà en un medi complementat amb aquest antibiòtic.

V

F

h.

Un bacteri que conté un plasmidi amb el gen de resistència a l'ampicil·lina interromput per la inserció del fragment clonat és capaç de proliferar en presència d'ampicil·lina.

V

F

Seminari 4: Pregunta 9. Inactivació insercional al plasmidi pBR322

El plasmidi pBR322 conté un gen de resistència a l'ampicil·lina (amb una diana única per a Pst I) i un gen de resistència a la tetraciclina (amb dianes per a BamH I i Sal I). La diana per a EcoR I es troba fora d'ambdós gens de resistència, tal com es mostra a la figura:

Avalueu el creixement bacterià esperat (V / F) per a cada cas quan s'introdueix un fragment de DNA forà:

.

Seminari 4: Qüestions 10-16. Eficiència, selecció recombinant i vectors fàgics

Responeu a les qüestions següents indicant la veracitat de cada afirmació (V / F):

a.

L'eficiència de la reacció de lligació entre un fragment de DNA i el vector és del 100%, de manera que no cal utilitzar cap procediment de selecció o cribratge del clon recombinant.

V

F

b.

El gen bacterià lacZ present en nombrosos vectors codifica per a l'enzim β-galactosidasa.

V

F

c.

En un vector que utilitza el gen lacZ com a marcador i conté un polilligador a la seua seqüència (alfa-complementació), les colònies transformades recombinants que contenen la inserció es reconeixen fàcilment pel seu color blau en plaques amb X-gal i IPTG.

V

F

d.

En relació amb l'elecció d'enzims de restricció per inserir un fragment de DNA en un vector:

1.

Es pot emprar qualsevol enzim que talle simultàniament el fragment i el vector i origine extrems compatibles.

V

F

2.

Abans d'escollir l'enzim de restricció que genera extrems complementaris, cal conèixer amb precisió el nombre de dianes que posseeix l'enzim tant a l'insert com al vector.

V

F

3.

Sempre resulta convenient escollir un enzim que tinga múltiples dianes internes al vector.

V

F

e.

Un clar avantatge dels vectors plasmídics respecte als vírics és que les cèl·lules hostes no requereixen cap tractament previ per a la transformació.

V

F

f.

El clonatge basat en la infecció de bacteris amb partícules del fag λ presenta una eficiència molt més elevada que la transformació convencional de cèl·lules competents amb plasmidis.

V

F

g.

Els fags λ utilitzats directament com a vectors de clonació s'empaqueten com a molècules de DNA lineal de doble cadena.

V

F