Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR

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APUNTES INGENIERÍA GENÉTICA Grado en Biología Universidad de Barcelona AprenAI 2026-2027 Resumen de ingeniería genética: hibridación (blots, FISH, microarrays), PCR y qPCR, clonación molecular y edición genómica con CRISPR-Cas9.

APREN.AI Índice 1 Técnicas de detección basadas en hibridación Fundamento de la hibridación de ácidos nucleicos Técnicas clásicas de transferencia: Southern Blot y Northern Blot Hibridación in situ y micromatrices (microarrays) 2 Amplificación de ácidos nucleicos: PCR convencional y cuantitativa Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Ciclo térmico de amplificación Modalidades y aplicaciones de la PCR 3 Recombinación, clonación génica y edición con CRISPR-Cas9 Herramientas moleculares del ADN recombinante Proceso de clonación in vivo y vectores de expresión Edición genómica mediante el sistema CRISPR-Cas9 4 Resumen para repasar Técnicas de detección basadas en hibridación Amplificación de ácidos nucleicos: PCR Recombinación genética y edición genómica Soluciones de las preguntas de repaso Estos apuntes pueden contener errores u omisiones.

Son un material de apoyo y no sustituyen al temario oficial ni al profesorado: contrasta la información importante. Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 1 1 Técnicas de detección basadas en hibridación AL ACABAR SABRÁS Describir las tres etapas del ciclo de hibridación molecular en ácidos nucleicos. Diferenciar los procedimientos de Southern blot y Northern blot según el sustrato analizado. Interpretar los resultados de un ensayo de micromatrices según el código de colorimetría fluorescente. PIÉNSALO ANTES DE LEER 1 ¿Cómo es posible hallar una secuencia de ADN específica entre millones de pares de bases de un genoma complejo sin secuenciarlo entero?

Fundamento de la hibridación de ácidos nucleicos La hibridación molecular consiste en el apareamiento específico entre dos cadenas simples de ácidos nucleicos con orígenes distintos, guiado por complementariedad de bases nitrogenadas. Para identificar la secuencia de interés se emplea una sonda, definida como un fragmento corto de nucleótidos marcado con fluoróforos, radioisótopos o enzimas reveladoras. El procedimiento estándar para analizar cadenas bicatenarias de ADN comprende tres fases consecutivas: PARA RECORDARLO El ARN no necesita la etapa térmica inicial de desnaturalización debido a que es una molécula monocatenaria en su estructura primaria estándar.

Técnicas clásicas de transferencia: Southern Blot y Northern Blot Estas metodologías permiten evaluar la presencia física, el tamaño molecular y la abundancia relativa de fragmentos nucleotídicos concretos. Parámetro Southern Blot Northern Blot Molécula diana ADN ARN Desnaturalización: se aplica calor a unos 95 °C para romper los puentes de hidrógeno y separar la doble hélice en cadenas sencillas. 1 Hibridación o renaturalización: se reduce la temperatura tras incorporar la sonda marcada. Dicha molécula compite con la hebra original y se acopla selectivamente a la secuencia complementaria de la muestra.

2 Detección: se registra la señal generada por el marcaje (emisión luminosa, colorimétrica o radiactiva), delimitando la posición del fragmento diana. 3 Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 2 Parámetro Southern Blot Northern Blot Digestión previa con enzimas de restricción Sí, obligatoria No requerida Separación física Electroforesis en gel (por tamaño) Electroforesis en gel (por tamaño) Soporte de transferencia Membrana sólida (ej. nitrocelulosa) Membrana sólida (ej.

nitrocelulosa) Visualización final Bandas detectadas mediante sonda Bandas detectadas mediante sonda Durante la electroforesis en gel, las moléculas de menor tamaño avanzan más rápido y alcanzan mayor distancia. Una vez transferidas las bandas a la membrana porosa, se añade la sonda marcada para localizar la posición exacta del fragmento de interés. COMPRUEBA 2 ¿Por qué se omite el uso de enzimas de restricción al preparar un Northern blot? Hibridación in situ y micromatrices (microarrays) La hibridación in situ conserva la estructura morfológica de la muestra para determinar la distribución espacial de los ácidos nucleicos.

La variante denominada FISH (hibridación in situ fluorescente) utiliza fluoróforos unidos a sondas que hibridan directamente sobre cromosomas extendidos. Resulta de gran utilidad diagnóstica ante pérdidas cromosómicas y deleciones. Por su parte, la hibridación in situ tisular detecta la localización de un ARNm determinado en cortes histológicos, señalando qué poblaciones celulares transcriben un gen específico. Las micromatrices de ADN (microarrays) efectúan hibridaciones genómicas comparadas a escala global entre dos condiciones biológicas (por ejemplo, tejido sano frente a tumoral).

Para muestras de ARN mensajero, este se convierte primero en ADN complementario (ADNc) mediante la enzima transcriptasa inversa, asegurando una mayor estabilidad química durante el ensayo. Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 3 PROCESO Fases de un ensayo de microarray transcriptómico Cada muestra de ADNc se marca con un fluoróforo distintivo (frecuentemente rojo y verde) y se incuba sobre un soporte sólido con miles de sondas génicas fijadas. La lectura de las señales ópticas se interpreta de la siguiente manera: Punto amarillo: niveles equivalentes de expresión génica en ambas muestras analizadas.

Punto rojo: sobreexpresión o predominio transcripcional en la muestra marcada con rojo. Punto verde: mayor abundancia relativa de transcritos en la muestra marcada con verde. ERROR FRECUENTE Confundir el material de partida en microarrays de expresión: el ARN celular nunca se hibrida directamente debido a su labilidad e inestabilidad; es indispensable retrotranscribirlo a ADNc con transcriptasa inversa antes del marcaje. IDEAS CLAVE La hibridación molecular se basa en la complementariedad de bases entre una sonda marcada y un ácido nucleico diana. Southern blot detecta ADN tras digestión enzimática y electroforesis, mientras que Northern blot identifica ARN sin digestión previa.

FISH permite localizar alteraciones y deleciones cromosómicas conservando el contexto morfológico. Los microarrays comparan perfiles transcriptómicos usando ADNc retrotranscrito y marcaje fluorescente diferencial. Extracción de ARNm Aislamiento a partir de muestras celulares 1 Transcripción inversa Síntesis de ADNc estable con transcriptasa inversa 2 Marcaje fluorescente Incorporación de fluoróforos rojo y verde 3 Hibridación en chip Unión a miles de sondas inmovilizadas 4 Lectura óptica Determinación de colores según expresión 5 Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 4 COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 3.

¿Qué representa un punto de color amarillo en el resultado de un ensayo de micromatrices con canales rojo y verde? 4. ¿Cuál es la función principal de la sonda marcada en los métodos de blot? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 5. ¿Qué técnica utiliza sondas fluorescentes sobre cromosomas para diagnosticar pérdidas génicas? 6. ¿Por qué el ARN debe convertirse a ADNc antes de hibridarlo en un microarray? 7. ¿Qué paso inicial del proceso de hibridación de ADN es innecesario al trabajar con ARN? 8. En una electroforesis en gel para Southern blot, ¿qué fragmentos migran a mayor distancia?

2 Amplificación de ácidos nucleicos: PCR convencional y cuantitativa AL ACABAR SABRÁS Identificar los reactivos esenciales requeridos para la reacción de PCR. Explicar las tres fases térmicas secuenciales que componen cada ciclo de amplificación. Distinguir la utilidad diagnóstica de la PCR de punto final frente a la PCR cuantitativa a tiempo real.

Southern blot a) FISH b) Northern blot c) PCR convencional d) Para digerirlo con enzimas de restricción a) Porque el ARN es químicamente inestable b) Para eliminar los cebadores restantes c) Para poder sintetizar proteínas directas d) Detección de la sonda a) Acoplamiento por complementariedad b) Desnaturalización térmica c) Renaturalización d) Los más pequeños a) Los que carecen de carga b) Los no digeridos c) Los de mayor peso molecular d) Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 5 PIÉNSALO ANTES DE LEER 9 ¿Cómo se pueden obtener miles de millones de copias exactas de un gen concreto si solo disponemos de una gota minúscula de muestra biológica?

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una metodología de amplificación in vitro que produce copias exponenciales de un fragmento de ADN diana dentro de un tubo de ensayo. Para llevar a cabo la reacción se requiere una mezcla con cuatro componentes fundamentales: ADN molde: muestra biológica portadora de la secuencia diana que se desea duplicar. ADN polimerasa termoestable: enzima resistente a altas temperaturas, habitualmente la Taq polimerasa, encargada de ensamblar las cadenas poliméricas hijas.

Cebadores (primers): oligonucleótidos sintéticos cortos complementarios a los flancos de la secuencia de interés, los cuales delimitan la región que será amplificada. Desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs): sustratos nucleotídicos trifosfato que actúan como unidades monoméricas para la elongación. Ciclo térmico de amplificación La reacción transcurre en un aparato automatizado denominado termociclador, el cual repite sucesivamente un ciclo organizado en tres gradientes térmicos: COMPRUEBA 10 ¿Por qué resulta indispensable utilizar una polimerasa termoestable como la Taq polimerasa en lugar de una polimerasa humana convencional?

Modalidades y aplicaciones de la PCR Dependiendo del método de detección de los productos amplificados (amplicones), se distinguen dos tipos esenciales: Característica PCR convencional (de punto final) PCR cuantitativa (qPCR / tiempo real) Momento de análisis Al terminar todos los ciclos térmicos De forma continua durante el avance del termociclado Sistema de lectura Electroforesis en gel de agarosa Medición óptica de fluorescencia Desnaturalización (95 °C): el calentamiento induce la separación física de las dos cadenas complementarias del ADN molde al romper los puentes de hidrógeno.

1 Hibridación o anillamiento (50-70 °C): al descender la temperatura, los cebadores se unen específicamente a sus dianas complementarias en el molde monocatenario. 2 Extensión (70-75 °C): a temperatura óptima para la ADN polimerasa, la enzima sintetiza la cadena naciente añadiendo dNTPs en dirección 5' a 3' a partir del extremo de los cebadores.

3 Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 6 Característica PCR convencional (de punto final) PCR cuantitativa (qPCR / tiempo real) Moléculas indicadoras Colorantes intercalantes posreacción SYBR Green o sondas específicas TaqMan Información aportada Cualitativa: presencia/ausencia y tamaño de banda Cuantitativa: concentración inicial exacta de molde En la qPCR, la intensidad de fluorescencia asciende proporcionalmente al ADN acumulado. Cuando una curva de fluorescencia sobrepasa el umbral antes en el eje de ciclos térmicos, indica que existía una concentración inicial más elevada de ácido nucleico molde.

EJEMPLO En medicina forense y diagnóstico clínico, la PCR convencional detecta mutaciones puntuales, inserciones o deleciones al revelar variaciones en el tamaño de las bandas. En infecciones bacterianas o víricas, la qPCR calcula la carga patógena exacta comparando las cinéticas de amplificación. ERROR FRECUENTE Asumir que la PCR de punto final cuantifica la carga inicial de ADN: las bandas de un gel convencional solo confirman presencia/ausencia y tamaño relativo del amplicón, pues la reacción finaliza en fase de meseta sin reflejar proporciones de partida cuantitativas. IDEAS CLAVE La PCR amplifica fragmentos específicos de ADN in vitro mediante ciclos térmicos repetitivos.

Los tres pasos del ciclo térmico son la desnaturalización (95 °C), el anillamiento de cebadores (50-70 °C) y la extensión enzimática (70-75 °C). La Taq polimerasa resiste las temperaturas de desnaturalización sin perder su actividad enzimática. La qPCR o tiempo real permite calcular la carga molecular inicial midiendo señales fluorescentes proporcionales a la duplicación de producto. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 11. ¿Qué componentes delimitan los extremos del fragmento a amplificar en una reacción de PCR? 12. Si una muestra alcanza la señal de fluorescencia en un ciclo menor que otra en qPCR, ¿qué significa sobre su contenido inicial?

Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 7 Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 13. ¿Cuál es la función del rango térmico de 50 a 70 °C en la PCR? 14. ¿Qué reactivo fluorescente se emplea comúnmente en ensayos de qPCR? 15. ¿A qué temperatura aproximada opera la extensión mediada por Taq polimerasa? 16. ¿Qué método requiere obligatoriamente electroforesis en gel al culminar las rondas térmicas? 3 Recombinación, clonación génica y edición con CRISPR-Cas9 AL ACABAR SABRÁS Describir el papel de las enzimas de restricción y la ADN ligasa en la producción de ADN recombinante.

Explicar la diferencia funcional y estructural entre un plásmido de clonación convencional y un vector de expresión. Comparar los mecanismos de reparación celular NHEJ y HDR tras el corte molecular guiado por Cas9. PIÉNSALO ANTES DE LEER 17 ¿De qué manera consiguen las bacterias actuales producir hormonas humanas idénticas a las nuestras como la insulina? Herramientas moleculares del ADN recombinante La recombinación del ADN consiste en asociar fragmentos genéticos de orígenes diferentes para sintetizar moléculas quiméricas novedosas.

Este ensamblaje se fundamenta en elementos específicos: Activar la lisis bacteriana a) Degradar el ARN residual b) Anillar los cebadores al molde c) Desnaturalizar el molde bicatenario d) Nitrocelulosa a) Polimerasa Taq b) ADN ligasa c) SYBR Green d) 95 °C a) 70-75 °C b) 50 °C c) 37 °C d) PCR convencional a) qPCR con SYBR Green b) qPCR con TaqMan c) FISH tisular d) Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 8 Enzimas de restricción: endonucleasas que actúan como tijeras moleculares al escindir enlaces fosfodiéster en secuencias palindrómicas específicas. Producen extremos de corte romos o pegajosos (cohesivos).

ADN ligasa: proteína que cataliza la unión covalente entre fragmentos de ADN previamente cortados. Vectores de clonación: vehículos de ADN autoreplicativos (como plásmidos o genomas víricos) capaces de multiplicarse de forma autónoma dentro de una célula hospedadora bacteriana. Inserto: fragmento nucleotídico foráneo que porta el gen de interés que se planea replicar o expresar (como la secuencia codificante de la insulina). Proceso de clonación in vivo y vectores de expresión La clonación génica celular requiere una serie de manipulaciones coordinadas: Si se pretende biosintetizar la proteína codificada además de clonar la secuencia, se emplean vectores de expresión.

Estos plásmidos especializados incorporan regiones reguladoras como promotores que fuerzan a la célula a transcribir el inserto a ARNm y luego traducirlo. PROCESO Etapas de la clonación molecular in vivo 1 Digestión enzimática Corte de vector e in serto con restricción 2 Ligación molecular Sellado covalente me diado por ADN ligasa 3 Transfor mación bacte riana Entrada del plásmido en células hospedadoras 4 Propaga ción celular Cultivo y amplifica ción biológica del clon EJEMPLO La producción industrial de insulina humana para pacientes diabéticos se realiza insertando el gen en vectores de expresión bacterianos.

Del mismo modo, fusionar secuencias codificantes con proteínas fluorescentes como GFP permite monitorizar la localización subcelular de un péptido o evaluar alteraciones de mutantes. Digestión enzimática coordinada: el vector plasmídico y el inserto se tratan con la misma enzima de restricción para crear extremos cohesivos o pegajosos compatibles. 1 Ligación covalente: la enzima ADN ligasa empalma el inserto dentro del plásmido abierto, conformando una molécula de ADN recombinante. 2 Transformación bacteriana: se transfiere el plásmido recombinante al citoplasma de células hospedadoras competentes.

3 Propagación y cultivo celular: las colonias transformadas se reproducen exponencialmente, multiplicando consigo el plásmido y generando millones de réplicas génicas. 4 Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 9 COMPRUEBA 18 ¿Por qué el inserto y el vector plasmídico deben cortarse con la misma enzima de restricción antes de la ligación? Edición genómica mediante el sistema CRISPR-Cas9 La tecnología de CRISPR-Cas9 constituye un procedimiento molecular rápido, económico y preciso para inducir modificaciones dirigidas dentro del genoma.

Su maquinaria activa comprende dos componentes primarios: Endonucleasa Cas9: enzima nucleolítica que corta ambas hebras de la doble hélice del ADN cromosómico. ARN guía (ARNg): secuencia sintética de ribonucleótidos diseñada por el experimentador que es complementaria a la diana cromosómica. Dirige espacialmente al complejo Cas9 al sitio preciso de corte.

Tras la introducción celular y la incisión de doble hebra en la diana génica, la maquinaria celular activa mecanismos fisiológicos de reparación: Mecanismo de reparación Mecanismo de acción Resultado fenotípico habitual Unión de extremos no homólogos (NHEJ) Reparación directa propensa a errores que genera pequeñas inserciones y deleciones (indels) Inactivación génica o bloqueo de expresión (knockout) Reparación dirigida por homología (HDR) Recombinación precisa asistida por el aporte exógeno de una plantilla o molde de ADN donante Integración de secuencias nuevas o rectificación de mutaciones (knock-in) Esta metodología permite generar modelos animales transgénicos, estudiar la función proteica mediante mutagénesis dirigida y desarrollar estrategias directas de terapia génica en enfermedades hereditarias.

ERROR FRECUENTE Confundir la consecuencia biológica de las rutas de reparación de CRISPR: la vía NHEJ induce errores e indels provocando pérdida de función (knockout), mientras que la vía HDR repara de manera dirigida usando un molde para insertar o subsanar secuencias (knock-in). Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 10 IDEAS CLAVE Las enzimas de restricción cortan secuencias palindrómicas generando extremos romos o cohesivos compatibles. Los vectores de clonación multiplican copias de un inserto, mientras que los vectores de expresión permiten transcribirlo y traducirlo a proteína mediante promotores.

El sistema CRISPR-Cas9 utiliza un ARN guía para dirigir a la endonucleasa Cas9 hacia la secuencia génica diana. El corte por CRISPR se repara mediante NHEJ (generando deleciones/inserciones knockout) o mediante HDR asistida por molde (permitiendo modificaciones knock-in precisas). COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 19. ¿Qué elemento añadido requiere la reparación por HDR para corregir una mutación con CRISPR-Cas9 en comparación con NHEJ? 20. ¿Cuál es la función concreta del ARN guía en el complejo de edición génica? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 21. ¿Qué enzima sella covalentemente los extremos de un plásmido y un inserto de ADN? 22.

¿Qué elemento regulador diferencia esencialmente a un vector de expresión de uno de simple clonación? 23. ¿Qué efecto provoca comúnmente la reparación por unión de extremos no homólogos (NHEJ)? 24. ¿Qué tipo de cortes realizan las enzimas de restricción para facilitar la unión coordinada de fragmentos?

Endonucleasa Cas9 a) ARN guía b) ADN ligasa c) Taq polimerasa d) Inactivación NHEJ a) Extremos romos b) Secuencias promotoras c) Fluoróforo intercalante d) Fusión con la proteína fluorescente GFP a) Inactivación o knockout génico b) Duplicación del número de cromosomas c) Inserción knock-in exacta por molde d) Degradación selectiva de dNTPs a) Cortes en secuencias palindrómicas b) Eliminación térmica de cebadores c) Roturas aleatorias por calor d) Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 11 4 Resumen para repasar Técnicas de detección basadas en hibridación Concepto o técnica Definición y función principal Hibridación molecular Unión bicatenaria por complementariedad de bases nitrogenadas entre cadenas simples de ácidos nucleicos de diferente origen.

Sonda Oligonucleótido corto marcado con fluoróforos, radioisótopos o enzimas para localizar e identificar una secuencia diana. Southern Blot Detección de secuencias de ADN tras digestión con enzimas de restricción, separación electroforética y transferencia a membrana. Northern Blot Análisis de presencia, tamaño y cantidad de ARN sin necesidad de digestión enzimática previa. FISH Hibridación in situ fluorescente sobre preparaciones cromosómicas para el diagnóstico de deleciones y pérdidas de fragmentos. Hibridación in situ tisular Localización de ARNm en cortes de tejido histológico para identificar qué poblaciones celulares transcriben un gen.

Microarrays de expresión Comparación transcriptómica masiva de dos muestras marcadas con fluoróforos (rojo y verde) sobre sondas tras retrotranscribir a ADNc. Amplificación de ácidos nucleicos: PCR Elemento o variante Definición y función principal Componentes de PCR ADN molde, ADN polimerasa termoestable (Taq), cebadores delimitadores específicos y desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs). Ciclo de amplificación Desnaturalización térmica (95 °C), anillamiento de cebadores (50-70 °C) y extensión por polimerasa (70-75 °C). PCR convencional Técnica de punto final evaluada por electroforesis en gel para determinar presencia, ausencia o tamaño del amplicón.

PCR cuantitativa (qPCR) Medición cinética en tiempo real mediante fluorescencia (SYBR Green o sondas TaqMan) que cuantifica la concentración inicial de molde. Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 12 Recombinación genética y edición genómica Herramienta o proceso Definición y función principal Enzimas de restricción Endonucleasas bacterianas que escinden secuencias palindrómicas generando extremos de corte romos o cohesivos (pegajosos). ADN ligasa Enzima que sella covalentemente los enlaces fosfodiéster entre fragmentos de ADN compatibles. Vectores de clonación vs.

expresión Los de clonación multiplican el inserto; los de expresión añaden promotores para transcribir y traducir el gen a proteína funcional. Transformación Introducción celular del vector recombinante en bacterias hospedadoras para su replicación biológica. CRISPR-Cas9 Sistema de edición precisa compuesto por la nucleasa Cas9 guiada por un ARN sintético complementario a la diana genómica. Reparación NHEJ Unión de extremos no homólogos propensa a inserciones o deleciones (indels), empleada para inactivar genes (knockout). Reparación HDR Reparación dirigida por homología mediada por un molde exógeno de ADN para inducir correcciones o inserciones exactas (knock-in).

Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 13 Soluciones de las preguntas de repaso 1. Aprovechando la propiedad natural del apareamiento de bases complementarias mediante una pequeña secuencia complementaria artificial marcada, llamada sonda. 2. Porque las moléculas de ARN mensajero ya se presentan como fragmentos individuales de longitud finita y conformación monocatenaria, sin requerir corte enzimático inicial. 3. Representa una hibridación equilibrada y una expresión génica equivalente entre las dos muestras biológicas comparadas. 4. Unirse selectivamente por complementariedad de secuencias al fragmento diana inmovilizado en la membrana para emitir una señal detectable. 5.

b) FISH. FISH hibrida sondas fluorescentes en preparaciones cromosómicas para evaluar anomalías estructurales. 6. b) Porque el ARN es químicamente inestable. El ARN es susceptible a rápida degradación, por lo que se sintetiza ADNc más estable mediante retrotranscripción. 7. c) Desnaturalización térmica. El ARN es monocatenario en su forma básica, por lo que no precisa calentamiento para separar hebras. 8. a) Los más pequeños. La matriz del gel retarda las moléculas voluminosas, permitiendo que las más cortas avancen con mayor rapidez. 9.

Mediante la PCR, alternando ciclos continuos de desnaturalización térmica, unión de cebadores específicos y síntesis enzimática con polimerasas termoestables. 10. Porque la enzima debe soportar las temperaturas repetidas de desnaturalización térmica próximas a 95 °C sin desnaturalizarse ni perder su capacidad catalítica. 11. Los cebadores o primers, que son secuencias cortas que hibridan en los flancos de la secuencia de interés. 12. Indica que presentaba una cantidad inicial más elevada de ADN molde diana. 13. c) Anillar los cebadores al molde. Ese descenso de temperatura facilita la hibridación de los oligonucleótidos cebadores con las hebras sencillas molde. 14. d) SYBR Green.

SYBR Green es una molécula que emite fluorescencia al acoplarse al ADN generado en tiempo real. 15. b) 70-75 °C. La elongación enzimática por la Taq polimerasa ocurre de modo óptimo entre 70 °C y 75 °C. 16. a) PCR convencional. La PCR convencional de punto final revela el producto mediante bandas separadas electroforéticamente tras finalizar el ensayo. 17. Introduciendo el gen codificante humano dentro de un plásmido con secuencias promotoras para que la maquinaria celular bacteriana lo transcriba y traduzca eficazmente. 18.

Porque así se generan extremos cohesivos monocatenarios exactamente complementarios entre sí, facilitando que el inserto encaje y sea sellado covalentemente por la ADN ligasa. 19. Requiere la cointroducción de un molde o fragmento de ADN donante que sirve como plantilla de secuencia correcta. 20. Aparearse por complementariedad de bases con la secuencia diana en el genoma para guiar a la endonucleasa Cas9 exactamente al punto que debe cortar. Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 14 21. c) ADN ligasa. La ADN ligasa actúa uniendo covalentemente los fragmentos compatibles escindidos. 22. c) Secuencias promotoras.

Los vectores de expresión incluyen promotores que dirigen la transcripción y posterior traducción de las secuencias insertadas. 23. b) Inactivación o knockout génico. Al ser propensa a introducir errores e indels, NHEJ interrumpe el marco de lectura e induce el silenciamiento o knockout. 24. b) Cortes en secuencias palindrómicas. Estas endonucleasas identifican y cortan específicamente dianas palindrómicas generando extremos cohesivos o romos. Ingeniería Genética: Detección, PCR, Clonación y CRISPR 15