Vectores de Clonación y ADN Recombinante | Bioquímica

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APUNTES BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Grado en Medicina Universidad Rovira i Virgili AprenAI 2026-2027 Apuntes de vectores de clonación: plásmidos (pBR322 vs. pUC), fagos Lambda y M13, cósmidos, cromosomas artificiales (BAC, YAC) y phage display.

APREN.AI Índice 1 Vectores de clonación y características de los plásmidos Elementos esenciales de un vector Criterios de clasificación de los plásmidos Evolución de los plásmidos: pBR322 frente a pUC 2 Vectores virales, híbridos, cromosomas artificiales y expresión Vectores derivados de bacteriófagos Cósmidos y cromosomas artificiales Vectores de expresión y Phage Display Soluciones de las preguntas de repaso Estos apuntes pueden contener errores u omisiones. Son un material de apoyo y no sustituyen al temario oficial ni al profesorado: contrasta la información importante.

Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 1 1 Vectores de clonación y características de los plásmidos AL ACABAR SABRÁS Identificar los cuatro elementos funcionales esenciales que constituyen un vector plasmídico Clasificar plásmidos según su replicación, potencial conjugativo y función biológica Comparar las características técnicas y operativas entre los vectores pBR322 y pUC PIÉNSALO ANTES DE LEER 1 ¿Por qué un fragmento lineal de ADN sin modificar se perdería al introducirlo en una bacteria en división?

Un vector de clonación es una molécula transportadora de ADN que permite introducir fragmentos genéticos foráneos en una célula hospedadora para su posterior replicación y estudio. Elementos esenciales de un vector Para desempeñar su función correctamente en el hospedador, todo vector molecular básico debe incorporar cuatro componentes mínimos: Origen de replicación (ORI): secuencia fundamental que indica a la maquinaria bacteriana que inicie la duplicación del vector de manera autónoma; su carencia causa la pérdida progresiva del ADN foráneo con las divisiones celulares.

Marcador de selección: habitualmente un gen que otorga resistencia a un antibiótico específico, lo que permite distinguir las bacterias transformadas de aquellas que no asimilaron el vector. Sitio de clonación múltiple (MCS): región sintética que reúne múltiples dianas para enzimas de restricción, punto donde se inserta el fragmento de interés. Tamaño reducido: interesa una dimensión reducida porque facilita la manipulación molecular y maximiza la eficiencia al ingresar en el citoplasma receptor. DEFINICIÓN Un plásmido es un fragmento circular extracromosómico de ADN que se replica con total autonomía respecto al cromosoma bacteriano.

Criterios de clasificación de los plásmidos Los plásmidos pueden agruparse atendiendo a tres características fundamentales: 1. Tasa de replicación: se dividen en relajados (producen un elevado número de copias por bacteria, generando gran rendimiento de ADN) y estrictos (mantienen un número reducido y estrictamente regulado de copias). 2. Modo de transferencia: existen plásmidos conjugativos (poseen genes tra que dirigen la formación del pilus sexual para transferirse de célula a célula de forma activa) y no conjugativos (incapaces Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 2 de transferirse espontáneamente, dependiendo de métodos mecánicos o asistencia genética). 3.

Función biológica: según los genes que confieren, se clasifican en fertilidad, resistencia, virulencia, degradativos y productores de colicinas (col). COMPRUEBA 2 ¿Qué consecuencia inmediata tiene la pérdida funcional del origen de replicación (ORI) en un vector plasmídico dentro de una bacteria en crecimiento? Evolución de los plásmidos: pBR322 frente a pUC La evolución del diseño de vectores plasmídicos queda ejemplificada con la comparación entre los clásicos como pBR322 y las series modernas como pUC.

Característica pBR322 (modelo clásico) pUC (modelo avanzado) Resistencias antibióticas 2 genes ( ) 1 gen ( ) Método de selección Muerte selectiva en tetraciclina (réplica en placa) Detección colorimétrica (cribado azul/blanco) Número de copias Bajo ( copias) Elevado ( copias) Operatividad Proceso laborioso y prolongado Detección visual simple y rápida ERROR FRECUENTE En pBR322, la presencia del gen clonado suele provocar la pérdida de resistencia a tetraciclina por inactivación por inserción.

No asumas que las bacterias recombinantes sobreviven al antibiótico cuya secuencia ha sido interrumpida: en la réplica en placa, son las colonias que mueren en tetraciclina las portadoras del inserto deseado. Amp , Tc R R AmpR aprox. 20 aprox. 500 Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 3 ESQUEMA Clasificación general de los plásmidos IDEAS CLAVE Un vector de clonación es un transportador de ADN capaz de reproducirse de forma autónoma dentro de una célula hospedadora. Los cuatro requisitos estructurales imprescindibles de cualquier vector son el origen de replicación (ORI), un marcador seleccionable, el MCS y un tamaño contenido.

Los plásmidos pUC aventajan a pBR322 gracias a un elevado número de copias por célula ( frente a 20) y una rápida selección por cribado azul/blanco. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 3. ¿Cuál es la función que cumple el gen tra en los plásmidos bacterianos? 4. ¿Qué dos características diferencian a un plásmido relajado de uno estricto? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 5. ¿Cuál es la función principal de la secuencia ORI en un plásmido?

Por replicación Según número de copias generadas Relajados Muchas copias por célula Estrictos Pocas copias controladas Por transferencia Según capacidad de paso intercelular Conjugativos Llevan genes tra y pilus No conjugativos Requieren métodos asistidos Por función Según fenotipo conferido Tipos funcionales Fertilidad, resistencia, virulencia, col, degradativos aprox. 500 Traducir las proteínas de la cápside a) Indicar a la bacteria que copie el vector b) Proveer resistencia a múltiples antibióticos c) Permitir la recombinación en el sitio MCS d) Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 4 6. ¿Qué ventaja operativa directa presenta el plásmido pUC sobre el vector pBR322? 7.

¿Qué elemento del vector reúne las secuencias reconocidas por enzimas de restricción? 8. ¿Cómo se define un plásmido bacteriano conjugativo? 2 Vectores virales, híbridos, cromosomas artificiales y expresión AL ACABAR SABRÁS Comparar los mecanismos de inserción y sustitución en fago Lambda y las ventajas de M13 Diferenciar las capacidades y hospedadores de vectores PAC, BAC e YAC Reconocer los componentes indispensables de un vector de expresión y el fundamento del Phage Display PIÉNSALO ANTES DE LEER 9 ¿Por qué un gen humano clonado en una bacteria no producirá proteína aunque el vector se multiplique?

Cuando el fragmento de ADN que se desea clonar supera el límite admitido por los plásmidos convencionales, es necesario emplear vectores de alta capacidad como fagos, cósmidos o cromosomas artificiales. Vectores derivados de bacteriófagos Los fagos son virus bacterianos compuestos por una cápside proteica y una estructura caudal con la que inyectan su material genético con gran eficiencia: Fago Lambda ( ): exhibe dos ciclos vitales alternativos, el lítico y el lisogénico. Su genoma cuenta con un segmento dispensable central.

Se aprovecha mediante dos formatos: Incorpora dos genes de resistencia activa a) Transfiere información por conjugación sexual b) Permite cribado colorimétrico visual azul/blanco c) Carece por completo de sitio policlonador d) El marcador de selección metabólica a) El promotor transcripcional fuerte b) El sitio de clonación múltiple (MCS) c) El origen de replicación autónomo d) Aquel que codifica el pilus mediante genes tra a) El que solo se transfiere por shock térmico b) El derivado exclusivo de la cabeza del fago c) Aquel con un número de copias superior a 500 d) λ Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 5 Vectores de inserción: disponen de una única diana de corte donde se introduce el ADN foráneo directamente sin escindir ninguna región del fago.

Vectores de sustitución: poseen dos puntos de corte flanqueantes que permiten extirpar el bloque central superfluo e intercambiarlo por el inserto de ADN. Las cadenas recombinantes se mezclan in vitro con extractos víricos de cabezas y colas, logrando un autoensamblaje espontáneo que origina partículas infecciosas extraordinariamente eficientes. Fago M13: virus con ADN monocatenario que infecta sin lisar al hospedador; atraviesa la membrana celular intacta. Aunque adopta una forma bicatenaria intermediaria para replicarse intracelularmente, libera ADN de cadena sencilla, lo que lo hace útil para la secuenciación de Sanger.

Cósmidos y cromosomas artificiales Los cósmidos son constructos híbridos entre plásmido y fago Lambda que incorporan el sitio cos. Esta diana permite el empaquetamiento directo dentro de cápsides víricas. Al carecer de genes víricos estructurales, tras la inyección bacteriana se recircularizan y actúan internamente como plásmidos comunes pero con mayor capacidad de carga.

Para segmentos de gran longitud se recurre a cromosomas artificiales: Vector Hospedador Capacidad de inserción Propiedad clave PAC Escherichia coli 100 kb Derivado de fago P1 acoplado al sistema loxP/Cre BAC Escherichia coli 300 kb Derivado del plásmido F; alta estabilidad (1 copia celular); selección con SacB YAC Levadura (Saccharomyces) 2000 kb Estructura lineal cromosómica auténtica (secuencias TEL, CEN y ARS); capacidad máxima COMPRUEBA 10 ¿Qué elementos funcionales convierten a un vector YAC en un cromosoma sintético funcional dentro de la levadura?

Vectores de expresión y Phage Display Si la meta científica trasciende la mera clonación génica y busca sintetizar la proteína recombinante, se requiere un vector de expresión. Estos sistemas agregan tres componentes funcionales al chasis plasmídico: Promotor fuerte: atrae eficazmente a la ARN polimerasa bacteriana para iniciar una transcripción copiosa del ARNm. 1 Sitio de unión al ribosoma (RBS): secuencia que guía el acoplamiento del ribosoma al transcrito para asegurar una traducción eficiente.

2 Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 6 DEFINICIÓN La tecnología de phage display (exhibición en fagos) aprovecha un fago filamentoso fusionando el gen de interés con el gen de una proteína estructural de la cápside; de esta forma, el péptido se exhibe hacia el exterior mientras el virus encapsula su secuencia codificante en el interior. Este sistema conecta de modo directo el fenotipo superficial exterior con el genotipo interno, facilitando rastrear y purificar anticuerpos o fármacos dentro de colecciones masivas para su aislamiento y secuenciación. ERROR FRECUENTE No asumas que un vector de clonación simple permite obtener proteínas.

Para sintetizar una proteína activa en bacterias se necesitan obligatoriamente señales transcripcionales y traduccionales específicas (promotor, RBS y terminador), elementos propios de un vector de expresión. PROCESO Mecanismo del método Phage Display Señal de terminación: elemento que detiene la lectura transcripcional en el límite previsto impidiendo la elongación anómala.

3 Fusión génica Unir gen diana con gen de cápside vírica 1 Ensamblaje viral Producción del fago en la célula bacteriana 2 Exposición superficial Proteína en la envoltura externa del virión 3 Selección y rastreo Identificar afinidad hacia fármacos o anticuerpos 4 Amplificación y lectura Aislar fagos seleccionados para secuenciar su ADN 5 Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 7 IDEAS CLAVE Los fagos y cósmidos permiten encapsidar y movilizar fragmentos de ADN mucho más grandes que los plásmidos ordinarios. El fago Lambda se emplea en esquemas de inserción o de sustitución, autoensamblando su cápside in vitro junto al gen recombinante.

M13 genera ADN monocatenario idóneo para la secuenciación mediante el método enzimático de Sanger. Los vectores cromosómicos crecen en capacidad desde PAC (100 kb) y BAC (300 kb) hasta YAC (2000 kb en levaduras). Los vectores de expresión incorporan promotor fuerte, RBS y terminador para traducir activamente el ARNm en proteína. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 11. ¿En qué se diferencia el diseño de un vector de sustitución de un vector de inserción derivado del fago Lambda? 12. ¿Cómo consigue la técnica de phage display emparejar genotipo y fenotipo? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 13.

¿Cuál es la función del sitio cos incorporado en la construcción de cósmidos? 14. ¿Qué vector ofrece la máxima capacidad de carga alcanzando aproximadamente 2000 kb? 15. ¿Qué tres señales son indispensables para convertir un vector en vector de expresión?

Inducir la formación del pilus sexual conjugativo a) Promover la lisis de la pared celular hospedadora b) Permitir el empaquetamiento dentro de cápsides de Lambda c) Inactivar la resistencia a los aminoglucósidos d) El plásmido modificado pUC a) El fago filamentoso monocatenario M13 b) El cromosoma artificial de levadura (YAC) c) El cósmido empaquetable d) Promotor fuerte, sitio ribosomal y señal terminadora a) Genes loxP/Cre, telómero y centrómero celular b) Pilus tra, cápside vírica y sitio cos c) Cribado SacB, resistencia múltiple y cola inyectora d) Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 8 16. ¿Por qué es singular el fago M13 respecto al material genético que exporta?

Produce exclusivamente ARN de doble cadena a) Lisa la membrana hospedadora tras la conjugación b) Secreta partículas que contienen ADN monocatenario c) Exige el sistema loxP/Cre para circularizarse d) Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 9 Soluciones de las preguntas de repaso 1. Porque carece de una secuencia de origen de replicación (ORI) reconocida por la bacteria para duplicarse y repartirse a la descendencia. 2. Al no poder duplicarse de forma autónoma durante las sucesivas divisiones bacterianas, el plásmido y su gen insertado se diluyen y se pierden definitivamente en la población bacteriana. 3.

Codifica las proteínas estructurales y funcionales del pilus sexual, posibilitando la conjugación y transferencia directa del plásmido entre bacterias. 4. El plásmido relajado genera abundantes copias intracelulares de forma poco controlada, mientras que el estricto mantiene una replicación limitada y escasa cantidad de copias. 5. b) Indicar a la bacteria que copie el vector. El ORI proporciona la señal molecular para iniciar la duplicación autónoma del ADN vector por parte del hospedador. 6. c) Permite cribado colorimétrico visual azul/blanco. pUC sustituye el engorroso método de réplica en placa sobre tetraciclina por la identificación directa mediante colonias blancas o azules. 7.

c) El sitio de clonación múltiple (MCS). El MCS (Multiple Cloning Site) contiene múltiples dianas agrupadas donde se inserta la secuencia foránea. 8. a) Aquel que codifica el pilus mediante genes tra. Los plásmidos conjugativos contienen genes tra requeridos para sintetizar el pilus y transferirse de manera natural. 9. Porque la maquinaria bacteriana necesita señales específicas de iniciación transcripcional (promotor), de fijación ribosomal y de terminación que los vectores de clonación estándar no poseen. 10. La inclusión concertada de secuencias teloméricas (TEL), un centrómero funcional (CEN) y una secuencia de replicación autónoma eucariota (ARS) en formato lineal. 11.

El de inserción solo tiene un punto de restricción sin eliminar ADN del fago, mientras que el de sustitución contiene dos dianas para eliminar la zona central innecesaria y reemplazarla por el inserto. 12. Fusiona la proteína diana con las proteínas de cubierta exponiéndola en el exterior del virus, mientras su ADN codificante permanece empaquetado dentro de la misma partícula vírica. 13. c) Permitir el empaquetamiento dentro de cápsides de Lambda. La secuencia cos actúa como la señal de empaquetamiento que reconoce el fago Lambda para introducir el ADN en su cápside. 14. c) El cromosoma artificial de levadura (YAC).

Los vectores YAC (Yeast Artificial Chromosome) albergan inserciones cromosómicas de hasta 2000 kb. 15. a) Promotor fuerte, sitio ribosomal y señal terminadora. La expresión proteica exige transcribir con un promotor fuerte, reclutar al ribosoma (RBS) y detener la lectura mediante un terminador. 16. c) Secreta partículas que contienen ADN monocatenario. M13 replica mediante forma bicatenaria intermedia pero libera moléculas de ADN de cadena sencilla sin provocar lisis bacteriana. Vectores de Clonación y ADN Recombinante " Bioquímica 10