Pràctiques de Laboratori de Bioquímica

Pràctica Dia 1: Preparació solucions

Per tal de dur a terme les sessions pràctiques d'enzimologia i quantificació proteica, cal preparar prèviament les solucions de treball indicades. Descriviu detalladament els càlculs i el procediment per elaborar cadascuna de les solucions següents:

a)

Preparació de $50\text{ mL}$ d'una solució $200\text{ mM}$ de $\text{NaH}_2\text{PO}_4$ (fosfat monosòdic, $M_m \approx 119{,}98\text{ g/mol}$).

b)

Preparació de $50\text{ mL}$ d'una solució $200\text{ mM}$ de $\text{Na}_2\text{HPO}_4$ (fosfat disòdic, $M_m \approx 141{,}96\text{ g/mol}$).

c)

Preparació de $200\text{ mL}$ de tampó fosfat $50\text{ mM}$ a pH $7{,}4$ a partir de les solucions d'hidrogenfosfat i dihidrogenfosfat preparades: barrejar $50\text{ mL}$ de $\text{NaH}_2\text{PO}_4$ $200\text{ mM}$ amb $50\text{ mL}$ de $\text{Na}_2\text{HPO}_4$ $200\text{ mM}$, afegir aigua desionitzada fins a uns $160\text{ mL}$, ajustar el pH a $7{,}4$ amb $\text{NaOH } 1\text{ M}$ si és necessari i enrasar en matràs aforat a $200\text{ mL}$. Justifiqueu la concentració resultant.

d)

Descripció de com prepararies $50\text{ mL}$ d'una solució de NADH $0{,}625\text{ mM}$ ($M_m\text{ (NADH disòdic)} \approx 709{,}4\text{ g/mol}$) en tampó fosfat. Indiqueu la massa requerida i els passos a la llibreta de laboratori.

e)

Preparació de $50\text{ mL}$ d'una solució de piruvat sòdic $50\text{ mM}$ ($M_m \approx 110{,}04\text{ g/mol}$), enrasant en tampó fosfat $50\text{ mM}$ pH $7{,}4$ (recordeu que no s'ha d'utilitzar aigua).

f)

Preparació de $50\text{ mL}$ d'una solució de piruvat sòdic $4\text{ mM}$ a partir de la solució estoc de $50\text{ mM}$ enrasant amb tampó fosfat.

g)

Preparació de $100\text{ mL}$ d'albúmina sèrica bovina (BSA) al $0{,}1\%\text{ (p/v)}$.

2. Pràctica Dia 1: Determinació de l'activitat enzimàtica de la LDH a concentració saturant de substrat

L'enzim lactat deshidrogenasa (LDH, tetràmer de 140 kDa format per subunitats H i M de 35 kDa) catalitza la reacció reversible de reducció de piruvat a lactat amb oxidació concomitant de NADH a NAD +:

Com que el NADH absorbeix llum a 340 nm ($\varepsilon = 6220\ \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}$) i el NAD + no presenta absorció a aquesta longitud d'ona, la velocitat de desaparició de l'absorbància a 340 nm és proporcional a la velocitat de reacció enzimàtica.

A partir d'un homogenat de fetge obtingut pesant 2 g de teixit homogeneïtzat en 10 mL de tampó fosfat i centrifugat durant 2 min a $13.000 \times g$, es preparen dues dilucions del sobrenedant (1/50 i 1/100) en tampó fosfat.

a)

Completeu la Taula 1 calculant els volums necessaris de cada component per a un volum final de cubeta de 2 mL, sabent que les concentracions desitjades a la cubeta són [Piruvat] = 0,25 mM (a partir d'estoc 4 mM) i [NADH] = 0,10 mM (a partir d'estoc 0,625 mM), i que el volum abans d'afegir els 250 $\mu\text{L}$ d'homogenat diluït ha de ser d'1,75 mL (la cubeta 1 és el blanc sense piruvat):

Cubeta

NADH 0,625 mM ($\mu\text{L}$)

Piruvat 4 mM ($\mu\text{L}$)

Tampó fosfat ($\mu\text{L}$)

1 (Blanc)

2 (Dilució 1/50)

3 (Dilució 1/100)

b)

Completeu la Taula 2 indicant la concentració final de piruvat ($\mu\text{M}$) a cada cubeta:

Cubeta

Dilució mostra

Homogenat diluït 1/100

Homogenat diluït 1/50

[Piruvat] $\mu\text{M}$ a la cubeta

1

1/50

-

250 $\mu\text{L}$

2

1/50

-

250 $\mu\text{L}$

3

1/100

250 $\mu\text{L}$

-

c)

d)

3. Pràctica Dia 2: Determinació de l'activitat de la LDH (cinètica de Michaelis-Menten)

Per determinar els paràmetres cinètics de la LDH ($K_m$ i $V_{\max}$) per al substrat piruvat, es realitza un assaig a concentració constant d'enzim (250 μL de l'homogenat de fetge diluït 1/100) i a concentracions creixents de piruvat, amb un volum final a la cubeta de 2 mL i una concentració fixada de NADH de 0,10 mM (a partir d'estoc 0,625 mM).

a)

Completeu la Taula 4 calculant el volum de piruvat 4 mM i de tampó fosfat necessari per a cadascuna de les 7 cubetes d'assaig, sabent que el volum de tampó abans d'incorporar el piruvat i els 250 μL d'enzim ha de totalitzar 1,75 mL amb els reactius:

Cubeta

NADH 0,625 mM (μL)

Concentració piruvat final

Quantitat de piruvat 4 mM (μL)

Tampó fosfat (μL)

Homogenat diluït 1/100 (μL)

1

320

0 μM

250

2

320

20 μM

250

3

320

50 μM

250

4

320

80 μM

250

5

320

150 μM

250

6

320

250 μM

250

7

320

400 μM

250

b)

Expliqueu com es processen les dades espectrofotomètriques de la Taula 5 (lectures d'absorbància a $t = 0\text{ min}$ i $t = 1\text{ min}$ a 340 nm) per obtenir la velocitat inicial $V_0$ en unitats de concentració per unitat de temps (μM/min).

c)

Detalleu com es construeix la gràfica de dobles inversos (Lineweaver-Burk) a partir de l'equació de Michaelis-Menten:

$$\frac{1}{V_0} = \frac{K_m}{V_{\max}} \cdot \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}$$

Indiqueu com s'extreuen el valor de la constant d'afinitat aparent $K_m$ i la velocitat màxima $V_{\max}$ a partir del pendent i de les interseccions amb els eixos.

4. Pràctica Dia 3: Determinació de la concentració de proteïna total de l'homogenat de fetge (mètode de Bradford)

La quantificació de la proteïna total es realitza mitjançant el mètode colorimètric de Bradford, fonamentat en el canvi de l'espectre d'absorció del colorant Coomassie Brilliant Blue G-250: la seva forma lliure (catiònica/neutra en medi àcid) té el màxim d'absorció a 465 nm, mentre que en unir-se mitjançant interaccions hidrofòbiques i electrostàtiques a residus bàsics (especialment arginina) i aromàtics de les proteïnes, s'estabilitza la forma aniònica de color blau intens amb màxim a 595 nm.

Per construir la recta patró i mesurar les mostres problema, es preparen les cubetes d'assaig amb un volum final total d'1,5 mL afegint 1,4 mL de Reactiu de Coomassie concentrat a 100 μL de solució aquosa (patró o mostra). Com a proteïna patró s'utilitza una solució de BSA al 0,1% (p/v) diluïda prèviament per obtenir una concentració de treball de 0,1 mg/mL (100 μg/mL).

a)

Calculeu la concentració final de BSA a cada cubeta (μg/mL cubeta) tenint en compte el volum total d'1,5 mL (1500 μL) i completeu la Taula 6:

Cubeta

BSA 0,1 mg/mL (μL)

Aigua destil·lada (μL)

[BSA] μg/mL cubeta

Absorbància λ = 595 nm

1

0

100

0,000

2

10

90

Lectura experimental

3

15

85

Lectura experimental

4

20

80

Lectura experimental

5

30

70

Lectura experimental

b)

Com s'ha de procedir per preparar i analitzar les cubetes de la mostra ( Taula 7: dilucions 1/50 i 1/100 de l'homogenat de fetge, amb 100 μL de mostra i 1,4 mL de Coomassie)? Indiqueu la condició de lectura espectrofotomètrica.

c)

A partir de l'equació de regressió lineal de la recta patró ($A_{595} = m \cdot [\text{BSA}] + n$), detalleu l'expressió matemàtica per calcular: