Fonaments de Biologia Molecular i Cel·lular: 2n parcial UAB

Fonaments fisicoquímics i moleculars de la bioenergètica cel·lular

Tots els processos moleculars que tenen lloc a la cèl·lula es desenvolupen en un medi aquós altament organitzat. L'aigua és una molècula dipolar amb una distribució asimètrica de càrregues: l'àtom d'oxigen, altament electronegatiu, genera una densitat de càrrega parcial negativa ($\delta^-$), mentre que els àtoms d'hidrogen presenten densitats parcials positives ($\delta^+$). Aquesta geometria permet la gènesi d'enllaços per pont d'hidrogen, interaccions electroestàtiques direccionals fonamentals entre un grup donador (com —OH o —NH) i un acceptor ric en densitat electrònica (àtoms electronegatius com oxigen o nitrogen amb parells d'electrons solitaris). Per contra, els grups apolars com el metil ($\text{—CH}_3$) són incapaços de formar aquests ponts, forçant l'aigua circumdant a reorganitzar-se en estructures de gàbia d'entropia desfavorable, fenomen conegut com a efecte hidrofòbic.

Aquestes interaccions no covalents febles (ponts d'hidrogen, forces de Van der Waals, atraccions iòniques i interaccions hidrofòbiques) governen l'estabilitat i el replegament de les macromolècules. Per garantir l'homeòstasi i l'activitat funcional, el pH intracel·lular s'ha de mantenir estricte mitjançant sistemes amortidors de pH cel·lulars, principalment el sistema dihidrogenfosfat/hidrogenfosfat ($\text{H}_2\text{PO}_4^- / \text{HPO}_4^{2-}$, amb un $\text{p}K_a \approx 7{,}2$) a nivell citosòlic i el tampó hidrogencarbonat/àcid carbònic ($\text{HCO}_3^- / \text{H}_2\text{CO}_3$) en medis biològics generals.

Estructura dels lípids de membrana i propietats fisicoquímiques

Les membranes biològiques estan constituïdes per una bicapa de lípids amfipàtics, predominantment fosfoglicèrids. Aquests compostos estan formats per una molècula de glicerol esterificada en els carbonis C1 i C2 per dues cadenes d'àcids grassos (cues hidrofòbiques) i en el carboni C3 per un grup fosfat, el qual s'uneix covalentment a un alcohol o cap polar (com la colina, etanolamina, serina o inositol).

La fluïdesa i el punt de fusió d'una bicapa lipídica depenen en gran mesura de les característiques estructurals dels seus àcids grassos constituents:

• Longitud de la cadena hidrocarbonada: Com més llarga és la cadena d'àcids grassos, més àrea de contacte existeix entre cues veïnes, incrementant les interaccions de Van der Waals i augmentant el punt de fusió.
• Grau i tipus d'insaturació: La introducció de dobles enllaços en configuració cis indueix colzades rígides a la cadena que desorganitzen l'empaquetament dens, disminuint dràsticament el punt de fusió. En canvi, els àcids grassos amb insaturacions trans mantenen una conformació lineal quasi paral·lela que permet un empaquetament semblant al dels àcids saturats, presentant punts de fusió superiors.

Bioenergètica, catàlisi enzimàtica i mesura de proteïnes

Les transformacions químiques que permeten l'obtenció d'energia estan accelerades per biocatalitzadors proteics. Des del punt de vista termodinàmic, els enzims no modifiquen la constant d'equilibri d'una reacció ($K_{eq}$) ni la variació d'energia lliure estàndard ($\Delta G^\circ$), sinó que disminueixen l'energia d'activació ($\Delta$ G^{$\ddagger$}) estabilitzant l'estat de transició.

Els enzims al·lostèrics no segueixen la cinètica hiperbòlica clàssica de Michaelis-Menten, sinó que presenten una corba de velocitat inicial front a concentració de substrat de tipus sigmoide, reflex d'un comportament cooperatiu. Aquests complexos transiten entre dos estats conformacionals:

• Estat T (tens): conformació de baixa afinitat pel substrat.
• Estat R (relaxat): conformació d'alta afinitat pel substrat.

Els moduladors o efectors al·lostèrics positius desplacen l'equilibri cap a la forma R (desplaçant la corba cap a l'esquerra), mentre que els inhibidors o moduladors negatius estabilitzen la conformació T (desplaçant la corba cap a la dreta).

Morfologia mitocondrial i el paper clau de la cardiolipina

D'acord amb la teoria endosimbiòtica, els mitocondris van evolucionar a partir de bacteris aerobis (semblants a les alfa-proteobacteris) fagocitats per un ancestre eucariota primitiu. Aquesta relació mutualista va aportar l'avantatge clau d'oxidar àcids grassos i glúcids per produir grans quantitats d'ATP cel·lular a canvi de protecció i nutrients.

El mitocondri està delimitat per una doble membrana que defineix quatre compartiments essencials:

1. Membrana mitocondrial externa (MME): Conté porines que permeten el pas lliure de metabòlits inferiors a 5 kDa. Alberga aproximadament el 30 % de les proteïnes de l'orgànul.
2. Espai intermembrana: Composició iònica i molecular petita equivalent al citosol, seu de proteïnes proapoptòtiques com el citocrom c (vegeu «Tema 5: Homeòstasi i proliferació — Mort cel·lular: apoptosi, necrosi i autofàgia»).
3. Membrana mitocondrial interna (MMI): Conté al voltant del 60 % de les proteïnes mitocondrials totals. Es plega formant crestes mitocondrials que maximitzen la superfície disponible per a la síntesi d'ATP. És extremadament impermeable a soluts i ions.
4. Matriu mitocondrial: Conté el genoma mitocondrial (ADNmt humà circular de 16.569 parells de bases, que codifica 13 polipèptids, 22 ARNt i 2 ARNr), ribosomes mitocondrials, el complex piruvat deshidrogenasa i els enzims del cicle de Krebs i la beta-oxidació.

Els mitocondris no reben lípids a través del tràfic vesicular convencional. La gran majoria dels fosfolípids són transmesos directament des del reticle endoplasmàtic llis cap a la MME mitjançant punts de contacte físic establerts per complexos d'ancoratge especialitzats, com el complex ERMES (Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Encounter Structure), a partir del qual sistemes transportadors específics els transfereixen a la membrana interna.

Mecanismes d'importació de proteïnes mitocondrials

Tot i disposar de genoma propi, la immensa majoria de les proteïnes mitocondrials són codificades al nucli, sintetitzades en ribosomes citosòlics lliures i importades post-traduccionalment. Per evitar el seu plegament prematur abans d'entrar a l'orgànul, xaperones citosòliques de la família Hsp70 consumeixen ATP per mantenir les cadenes polipeptídiques desplegades.

Les proteïnes destinades a la matriu presenten a l'extrem N-terminal una seqüència senyal característica: una hèlix alfa amfipàtica que agrupa aminoàcids amb càrrega neta positiva en una de les cares. Aquest senyal és reconegut inicialment pel receptor TOM 20/22 a la membrana externa.

La translocació requereix la coordinació de diferents complexos:

• Complex TOM (Translocase of the Outer Membrane): Inclou el canal de translocació TOM 40, pel qual el pèptid travessa la bicapa externa.
• Complex TIM (Translocase of the Inner Membrane): TIM 23/17 s'alinea amb TOM a nivell dels punts de contacte entre membranes. L'entrada a través de TIM requereix l'atracció exercida pel potencial electroquímic negatiu de la matriu respecte a l'espai intermembrana ($\Delta \Psi_m$). Un cop la cadena comença a emergir a la matriu, la subunitat associada TIM 44 coordina amb xaperones Hsp70 mitocondrials que tiren de la proteïna cap a l'interior impulsades per hidròlisi d'ATP. Posteriorment, una peptidasa senyal de la matriu escindeix el pèptid guia i altres xaperones asseguren el plegament correcte.

Per a la inserció de proteïnes a la membrana mitocondrial interna s'utilitzen tres rutes diferents segons la diana:

1. Ruta de parada de transferència (Stop-Transfer): La proteïna travessa TOM 40 i comença a entrar per TIM 23/17. Aquest reconeix una seqüència hidrofòbica interna de transbordament, s'obre lateralment i allibera el segment transmembrana directament a la bicapa lipídica interna, mentre el pèptid senyal és eliminat.
2. Ruta del complex OXA: La proteïna és importada completament a la matriu a través de TIM 23/17. Un cop eliminat el pèptid senyal amino-terminal, s'exposa una segona seqüència hidrofòbica que és reconeguda pel complex OXA, el qual la insereix a la MMI des del costat matricial. Aquest mecanisme és l'utilitzat també per a la inserció de les 13 proteïnes codificades pel propi ADNmt.
3. Ruta dels transportadors interns (TIM 22): Proteïnes integrals de múltiples passos transmembrana (com els transportadors de metabòlits) manquen de senyal N-terminal i presenten senyals interns. Són reconegudes pel receptor TOM 70, travessen TOM 40, s'associen amb xaperones petites de l'espai intermembrana i s'insereixen a la bicapa mitjançant el complex TIM 22/54.

La cadena de transport electrònic i la fosforilació oxidativa

La glucosa citosòlica és degradada per glicòlisi a piruvat, que ingressa a la matriu mitocondrial. En condicions d'aerobiosi, el complex multienzimàtic piruvat deshidrogenasa el descarboxila oxidativament a acetil-CoA i $\text{CO}_2$. Paral·lelament, els àcids grassos activats (de menys de 20 carbonis) entren al mitocondri i pateixen la beta-oxidació, generant també acetil-CoA. Aquest entra al cicle dels àcids tricarboxílics (cicle de Krebs) condensant-se amb oxalacetat, alliberant $\text{CO}_2$ i recollint electrons d'alt poder reductor en forma de 3 NADH, 1 FADH_2 i 1 GTP per volta de cicle.

Els electrons són transferits espontàniament a favor d'un gradient de potencials de reducció estàndard creixents ($E'^\circ$) a través de la cadena respiratòria, des de molècules amb fort poder reductor (baix potencial redox) fins a l'acceptor terminal, l'oxigen molecular ($\text{O}_2$, altíssim potencial redox):

• Complex I (NADH:ubiquinona oxidoreductasa): Oxida el NADH matricial a $\text{NAD}^+$, transfereix 2 electrons a través de centres FMN i Fe-S cap al coenzim Q (ubiquinona) i bombeja 4 protons (H^+) de la matriu a l'espai intermembrana.
• Complex II (Succinat deshidrogenasa): Únic complex que forma part tant del cicle de Krebs com de la cadena de transport. Oxida succinat a fumarat reduint FAD a $\text{FADH}_2$, transferint els electrons directament al coenzim Q sense cap bombeig de protons.
• Coenzim Q (Ubiquinona / Ubiquinol, QH_2): Transportador lipídic mòbil a l'interior de la bicapa que recull electrons dels complexos I i II i els transfereix al complex III mitjançant el cicle Q.
• Complex III (Citocrom c reductasa / Complex bc_1): Transfereix electrons des del $\text{QH}_2$ cap al transportador soluble citocrom c, translocant 4 protons (H^+) per parell d'electrons.
• Citocrom c: Proteïna perifèrica monomèrica soluble localitzada a l'espai intermembrana que transporta electrons d'un en un des del complex III fins al complex IV.
• Complex IV (Citocrom c oxidasa): Rep electrons del citocrom c i els transfereix a l'oxigen elemental ($\text{O}_2$), que s'uneix a protons de la matriu per reduir-se i produir aigua ($\text{H}_2\text{O}$), acoblant el procés a la translocació neta de 2 protons (H^+) per parell d'electrons oxidats.

En balanç global, cada parell d'electrons derivat d'un NADH permet el bombeig net de 10 H^+, mentre que els procedents d'un FADH_2 permeten el bombeig de 6 H^+.

Gradient quimiosmòtic i catàlisi rotacional de l'ATP sintasa (F0F1)

El bombeig continu de protons genera la força protó-motriu ($\Delta p$), constituïda per un potencial elèctric de membrana ($\Delta \Psi$, interior negatiu) i un gradient de concentració química ($\Delta \text{pH}$, matriu alcalina). Aquest gradient és aprofitat per l'ATP sintasa (complex V) per sintetitzar ATP mitjançant el mecanisme de canvi d'unió establert per Boyer.

El complex està conformat per dos dominis principals:

• Porció F_0: Complex hidrofòbic incrustat a la MMI, format pel canal protònic $a$ i un anell giratori de subunitats hidrofòbiques $c$ acoblades a la tija central.
• Porció F_1: Cap catalític hidrofílic que sobresurt cap a la matriu, estructurat com un hexàmer immòbil format per tres heterodímers $\alpha\beta$ suspesos per una tija perifèrica estàtica ($b_2\delta$) i travessats per una tija central asimètrica ($\gamma\epsilon$).

Els llocs catalítics resideixen exclusivament a les tres subunitats beta ($\beta$). La rotació de 360° de la subunitat central gamma ($\gamma$), impulsada pel trànsit de protons a través de l'anell $c$, indueix canvis conformacionals seqüencials en cadascuna de les subunitats $\beta$:

Cada gir discret de 120° de la subunitat $\gamma$ commuta l'estat de les tres subunitats alhora (O $\rightarrow$ L, L $\rightarrow$ T, T $\rightarrow$ O), produint un ATP per cada salt de 120° i alliberant exactament 3 ATP per volta completa de 360°.

Sistemes de transport d'adenilats i patologies mitocondrials

La major part de l'ATP sintetitzat s'ha d'exportar al citosol per cobrir les necessitats metabòliques cel·lulars, mentre que l'ADP generat a la hidròlisi citoplasmàtica ha de retornar a la matriu. Aquesta tasca la realitza la translocasa de nucleòtids d'adenina (ANT), un transportador antiport integrat a la MMI que intercanvia un $\text{ATP}^{4-}$ matricial per un $\text{ADP}^{3-}$ citosòlic, aprofitant el potencial de membrana $\Delta \Psi$ (afavorit per la sortida neta d'una càrrega negativa).

Les mutacions que afecten tant l'ADNmt com gens nuclears que codifiquen proteïnes de la cadena respiratòria originen greus alteracions degeneratives, que impacten amb especial severitat els teixits amb elevada demanda bioenergètica (retina, cervell, múscul estriat i cardíac):

• Neuropatia òptica hereditària de Leber (LHON): Causada predominantment per mutacions puntuals a gens de l'ADNmt que codifiquen subunitats del Complex I (com ND1, ND4 o ND6). Aquesta fallida de la NADH-deshidrogenasa redueix la taxa de síntesi d'ATP i incrementa les espècies reactives d'oxigen (ROS), provocant la pèrdua bilateral de la visió per degeneració de les cèl·lules ganglionars de la retina en adults joves.
• Síndrome de Kearns-Sayre (KSS): Provocada per delecions a gran escala de fragments significatius de l'ADNmt, cursant amb paràlisi muscular ocular progressiva (oftalmoplegia), degeneració retiniana pigmentària i trastorns greus de la conducció cardíaca.