Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes

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APUNTES BIOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR Grado en Biotecnología Universidad Autónoma de Barcelona AprenAI 2026-2027 Apuntes de Biología Molecular: replisomas, telómeros, transposición, recombinación homóloga y rutas de reparación del DNA (NER, BER, MMR y SOS). APREN.AI Índice Replicación en procariotas 1 Organización del replicón y maquinaria enzimática 1. Organización del replicón y dinámica de replicación 2. DNA polimerasa I y la dirección de síntesis 5' 3' 3. La holoenzima DNA polimerasa III y comparación del repertorio enzimático 4.

Factores accesorios de la horquilla de replicación 2 Iniciación en oriC y terminación Arquitectura del origen de replicación OriC Mecanismo de apertura de la doble hélice y reclutamiento del complejo DnaB-DnaC Modelo de replicación en fagos monocatenarios: el bacteriófago M13 Mecanismo de terminación: secuencias Ter y proteína Tus Resolución de concatenados por topoisomerasa IV Control de la frecuencia de iniciación: metilasa Dam y secuestro por SeqA Replicación en eucariotas 3 Maquinaria enzimática y ciclo celular El ciclo celular y la clasificación de las DNA polimerasas División funcional del trabajo en la horquilla replicativa nuclear Procesamiento y maduración de los fragmentos de Okazaki Correspondencias funcionales entre procariotas y eucariotas 4 Licenciamiento del origen y biología del telómero Organización y diversidad de los orígenes de replicación en eucariotas Control temporal del ciclo: licenciamiento en G1 y activación en fase S El problema de la replicación del extremo y la telomerasa Estructura protectora: cuartetos de guanina, lazo T y shelterina Implicaciones biomédicas: senescencia, progeria y tumorigénesis 5 Elementos genéticos móviles — Transcriptasa inversa y transposición La transcriptasa inversa: actividades enzimáticas e inhibición farmacológica Fundamentos de la transposición y recombinación ilegítima Clasificación de transposones procariotas y variación de fase Mecanismos de transposición: vía replicativa frente a no replicativa Retrotransposición y organización genómica eucariota 6 Recombinación homóloga — Rutas moleculares procariotas y eucariotas Modalidades de recombinación y trascendencia biológica El intermediario de Holliday y los modelos de resolución Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 1 Maquinaria bacteriana: complejo RecBCD y nucleación de RecA Migración de ramificaciones y resolución: RuvABC y RecG Recombinación homóloga eucariota: el modelo DSB meiótico Reparación del DNA 7 Reversión directa, NER y BER 1.

Daño en el DNA y mecanismos de reversión directa 2. Reparación por escisión de nucleótidos (NER) 3. Reparación por escisión de bases (BER) 8 Reparación de apareamientos incorrectos, respuesta SOS y roturas de doble cadena Reparación de apareamientos incorrectos (MMR) Respuesta SOS y síntesis translesión (TLS) Reparación de roturas de doble cadena (DSBR) Rescate de horquillas de replicación colapsadas 9 Resumen para repasar 1. Replicación procariota (E. coli) 2. Replicación eucariota y telómeros 3. Elementos móviles y transposición 4. Recombinación homóloga 5. Rutas de reparación del DNA Soluciones de las preguntas de repaso Estos apuntes pueden contener errores u omisiones.

Son un material de apoyo y no sustituyen al temario oficial ni al profesorado: contrasta la información importante. Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 2 1 Organización del replicón y maquinaria enzimática AL ACABAR SABRÁS Diferenciar la organización del replicón bacteriano frente a los cromosomas eucariotas multirreplicón. Explicar la base termodinámica y química del sentido obligado 5' 3' en la síntesis con corrección de errores. Comparar las actividades catalíticas de la DNAP I intacta con el fragmento Klenow. Describir la función de las subunidades y factores accesorios de la holoenzima DNAP III en la horquilla de replicación.

PIÉNSALO ANTES DE LEER 1 ¿Por qué todas las polimerasas celulares añaden nucleótidos en sentido 5' 3' y nunca en 3' 5'? La duplicación del material genético bacteriano requiere una coordinación precisa entre secuencias reguladoras y complejos multiproteicos especializados encargados de desenrollar y sintetizar el DNA. Replicación en procariotas 1 Organización del replicón y maquinaria enzimática 2 Iniciación en oriC y terminación Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 3 ESQUEMA Maquinaria replicativa y replicones de E. coli 1.

Organización del replicón y dinámica de replicación Un replicón es una unidad de DNA capaz de replicarse como una entidad individual durante el ciclo celular. Cada replicón contiene secuencias reguladoras en cis que definen tanto el punto de origen como la zona de terminación, sitios específicos reconocidos por proteínas reguladoras (véase «Replicación en procariotas — Iniciación en oriC y terminación»). En Escherichia coli, el cromosoma circular completo funciona como un único replicón. De forma independiente, los plásmidos presentes en la bacteria constituyen replicones adicionales.

En contraposición, los cromosomas eucariotas son de mayor tamaño y operan como multirreplicones, con orígenes espaciados entre 3 y 300 kb. Por ejemplo, el cromosoma 1 humano contiene unos 2,5 · 10 kb y reúne aproximadamente 0,8 · 10 orígenes, mientras que el cromosoma 22 posee 22,5 · 10 kb con unos 1,6 · 10 orígenes. La fase S tardaría más de un mes si dependiera de un único origen. En eucariotas, el proceso se divide en dos fases: el licenciamiento de los orígenes por grupos de 20 a 80 replicones, y la fase replicativa activa mediada por potenciadores o enhancers específicos según el tejido (véase «Replicación en eucariotas — Licenciamiento del origen y biología del telómero»).

Además, en eucariotas las horquillas convergen y colapsan sin secuencias fijas de terminación. A diferencia de las RNA polimerasas, todas las DNA polimerasas requieren obligatoriamente un cebador (o primer) con un extremo 3'-OH libre para iniciar la polimerización. La replicación es semiconservativa, pues cada molécula bicatenaria hija preserva una hebra molde parental y contiene Replicones de E.

coli Unidades de replicación circular Cromosoma principal Monorreplicón con replicación theta Plásmidos Replicones circulares autónomos Maquinaria de síntesis Polimerasas bacterianas Holoenzima DNAP III Replicasa de alta procesividad DNAP I Retirada de cebador y maduración Factores de horquilla Proteínas del replisoma Helicasa DnaB Apertura 5'->3' en hebra retrasada Tetrámeros SSB Protección de hebras sencillas Primosoma (DnaG/PriA) Síntesis de cebadores de RNA Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 4 una cadena recién sintetizada.

Dado que la elongación ocurre estrictamente en sentido 5' 3', el proceso es también semidiscontinua: una hebra se copia de forma continua (cadena conductora) y la otra en fragmentos discontinuos (cadena retrasada). En el cromosoma circular bacteriano, la duplicación suele generar una estructura típica denominada replicación en theta (θ). La apertura de una burbuja u ojo de replicación avanza de modo bidireccional mediante dos horquillas divergentes, aunque en excepciones bacterianas muy concretas puede ser unidireccional. Esquema y micrografía electrónica de una burbuja u ojo de replicación.

Otros sistemas biológicos emplean estrategias alternativas: el bacteriófago M13 bicatenario recurre a la replicación en círculo rodante (σ), rompiendo una de las hebras para exponer un extremo 3' a partir del cual se generan copias desplazando la cadena preexistente. Las mitocondrias, en cambio, utilizan la replicación en bucle D (D-loop), donde la cadena retrasada se sintetiza inicialmente de forma íntegra como RNA antes de su reemplazo por DNA. El cromosoma de E. coli tarda unos 40 minutos en replicarse. Sin embargo, la bacteria puede dividirse a intervalos de 20 minutos durante fases de crecimiento exponencial.

Este desfase temporal se solventa mediante cromosomas multihorquilla: antes de que concluya una ronda replicativa, se inician nuevos ciclos de duplicación en los orígenes de las cadenas hijas en formación. COMPRUEBA 2 ¿Cómo logra E. coli dividirse cada 20 minutos si la replicación completa de su cromosoma requiere 40 minutos? 2. DNA polimerasa I y la dirección de síntesis 5' 3' Las células de E. coli poseen cinco DNA polimerasas distintas. La DNA polimerasa I (DNAP I) constituye el 95 % del total de polimerasas extraídas de la célula bacteriana.

Está formada por una única cadena polipeptídica con estructura general parecida a una mano (dominios fingers, palm y thumb), común a las polimerasas celulares. La DNAP I alberga tres actividades catalíticas distintas distribuidas en sus dominios: Actividad polimerasa 5' 3': localizada en el extremo C-terminal (región palm), elonga la cadena incorporando desoxirribonucleótidos (dNTPs) que acceden por el dominio fingers. Actividad exonucleasa 3' 5' (proofreading): también en el dominio C-terminal, escinde nucleótidos incorrectos de uno en uno en el sitio catalítico de edición cuando se detecta un apareamiento erróneo.

Actividad exonucleasa 5' 3': ubicada en el dominio N-terminal, degrada segmentos de oligonucleótidos (típicamente en bloques de 10 nucleótidos) por delante de la polimerasa, Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 5 permitiendo remover los cebadores de RNA y participar en la reparación de lesiones. Estructura tridimensional del fragmento Klenow con sus dominios funcionales. DEFINICIÓN El fragmento Klenow es el segmento C-terminal obtenido tras la escisión proteolítica de la DNA polimerasa I. Retiene las actividades polimerasa 5' 3' y exonucleasa correctora 3' 5', pero carece de la actividad exonucleasa 5' 3' del dominio N-terminal.

La procesividad es el número de nucleótidos que una enzima polimeriza antes de disociarse del molde. En la DNAP I es reducida (alrededor de 20 nucleótidos), acorde con su función de rellenar pequeños huecos y reemplazar cebadores, exhibiendo una tasa de error de errores por par de bases. La necesidad química de sintetizar en dirección 5' 3' radica en el mecanismo de corrección de errores (proofreading). Al sintetizar de 5' a 3', el trifosfato de alta energía (PPP) lo aporta el dNTP entrante y el extremo de la cadena creciente presenta un 3'-OH libre.

Si se elimina una base errónea por la exonucleasa 3' 5', el extremo sigue ofreciendo un 3'-OH reactivo para acoplar el siguiente nucleótido activado. En una hipotética síntesis 3' 5', el trifosfato residiría en el extremo de la hebra en crecimiento; al escindir el residuo terminal incorrecto, la cadena quedaría monofosfatada en 5', imposibilitando continuar la polimerización sin activación previa.

ERROR FRECUENTE Confundir las dos actividades exonucleasas de la DNAP I: la corrección de errores (proofreading) actúa en dirección 3' 5' sobre nucleótidos aislados recién incorporados, mientras que la retirada de cebadores de RNA opera en dirección 5' 3' degradando oligonucleótidos por delante de la síntesis. 10 7 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 6 3. La holoenzima DNA polimerasa III y comparación del repertorio enzimático La DNA polimerasa III (DNAP III) actúa como la replicasa replicativa central de E. coli.

Presenta una alta fidelidad, con una tasa de error de tan solo a errores por par de bases, y una procesividad prácticamente ilimitada (> 5.000 nucleótidos sin soltarse del molde).

La holoenzima DNAP III está compuesta por tres módulos principales: Polimerasa Actividad polimerasa Exonucleasa 3' 5' Exonucleasa 5' 3' Función biológica principal DNAP I 5' 3' Sí Sí Retirada de cebadores de Okazaki y reparación DNAP II 5' 3' Sí No Reparación del DNA DNAP III 5' 3' Sí No Replicación replicativa cromosómica (replicasa) DNAP IV 5' 3' No No Reparación inducible (sistema SOS) DNAP V 5' 3' No No Reparación inducible (sistema SOS) COMPRUEBA 3 ¿Qué subunidades forman el núcleo catalítico de la holoenzima DNAP III y qué función desempeña cada una? 4.

Factores accesorios de la horquilla de replicación El funcionamiento coordinado del replisoma exige diversas proteínas auxiliares que operan en la horquilla desenrollando la doble hélice, estabilizando hebras y sintetizando cebadores: 10 8 10 10 Núcleo catalítico (core): formado por tres subunidades distintas: subunidad (polimerasa 5' 3'), subunidad (exonucleasa 3' 5') y subunidad (estimuladora de la actividad de ). Carece de actividad exonucleasa 5' 3'. 1 α ε θ ε Abrazadera (sliding clamp): dímero en forma de anillo cerrado que rodea el dúplex de DNA y ancla físicamente el núcleo catalítico al molde, otorgándole su elevada procesividad.

2 β Complejo (cargador de la abrazadera): estructura central compuesta por un dímero , la subunidad y cuatro subunidades accesorias. El dímero mantiene acoplados físicamente a los núcleos catalíticos que replican simultáneamente ambas cadenas. 3 γ/τ τ γ τ Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 7 Esquema molecular de la horquilla de replicación con helicasa DnaB y SSB. Helicasa DnaB: complejo hexamérico que se desplaza sobre la cadena retrasada en sentido 5' 3'. Utiliza la hidrólisis de ATP para abrir la doble hélice por delante de la horquilla. Interactúa físicamente con la primasa, el dímero , DnaC y DnaA.

Pertenece a la misma familia que la proteína RecA (véase «Recombinación homóloga — Rutas moleculares procariotas y eucariotas» y «Reparación del DNA — Reparación de apareamientos incorrectos, respuesta SOS y roturas de doble cadena»). Proteínas SSB (Single-Stranded Binding proteins): homotetrámeros que se unen cooperativamente al DNA monocatenario expuesto en ambas hebras. Impiden la formación prematura de estructuras secundarias y protegen al molde frente a la degradación por nucleasas. Primosoma: complejo multiproteico constituido por la primasa (DnaG), la helicasa DnaB y PriA.

La primasa carece de la morfología clásica en forma de mano propia de las DNA y RNA polimerasas, asemejándose a las topoisomerasas, y contiene un dedo de Zn² para reconocer ssDNA. Posee actividades de primasa y helicasa, reconociendo el trinucleótido GTA en la cadena retrasada para sintetizar cebadores de RNA cortos. En este complejo, PriA aporta actividad helicasa complementaria. Topoisomerasa II (Girasa): actúa por delante de la horquilla relajando el superenrollamiento positivo generado por el avance de la helicasa. DNA ligasa: una vez que la DNAP I retira el cebador de RNA y completa el hueco con desoxirribonucleótidos, sella la muesca fosfodiéster final entre los fragmentos de Okazaki.

La ligasa de E. coli utiliza NAD como cofactor energético, a diferencia de las ligasas eucariotas o del fago T4, que emplean ATP. COMPRUEBA 4 ¿En qué hebra se desplaza la helicasa DnaB y cuál es su sentido de avance? τ Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 8 IDEAS CLAVE Un replicón es una unidad de DNA regulada por secuencias en cis que coordinan un único evento replicativo por ciclo celular. La replicación bacteriana es semiconservativa, semidiscontinua y predominantemente bidireccional mediante estructuras theta (θ). Los cromosomas multihorquilla permiten que E. coli se divida a intervalos más breves (20 min) que la duración completa de su ciclo replicativo (40 min).

La síntesis en sentido 5' 3' preserva la capacidad de proofreading gracias a la presencia del enlace trifosfato en el nucleótido entrante. La DNAP I reúne actividades polimerasa 5' 3', exonucleasa 3' 5' y exonucleasa 5' 3'; el fragmento Klenow carece únicamente de la exonucleasa 5' 3'. La holoenzima DNAP III actúa como la replicasa bacteriana principal, dotada de gran procesividad gracias a la abrazadera beta y coordinada por el cargador gamma/tau. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 5. ¿Qué actividades enzimáticas conserva el fragmento Klenow y de cuál carece respecto a la DNAP I nativa? 6. ¿Por qué la síntesis de DNA no puede ocurrir en dirección 3' 5' manteniendo la corrección de pruebas? 7.

¿Qué función desempeña el dímero dentro del replisoma procariota? REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS 2 Iniciación en oriC y terminación AL ACABAR SABRÁS Describir la organización molecular de oriC distinguiendo cajas DnaA y secuencias DUE. Explicar el papel termodinámico y funcional de DnaA, HU y DnaC en la carga de DnaB. Analizar el mecanismo polar de terminación mediado por el complejo Ter-Tus y la decatenación por topoisomerasa IV. Detallar el sistema de regulación epigenética dependiente de Dam y SeqA frente a reiniciaciones prematuras.

PIÉNSALO ANTES DE LEER 8 ¿Por qué un cultivo de Escherichia coli en crecimiento rápido puede duplicar sus células cada 20 minutos si copiar su genoma requiere 40 minutos? τ Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 9 Arquitectura del origen de replicación OriC La replicación cromosómica en Escherichia coli comienza en una región fija y única denominada oriC, presente también con la misma función en determinados plásmidos (véase «Replicación en procariotas — Organización del replicón y maquinaria enzimática»). Esta zona comprende una longitud de 245 a 250 pares de bases (pb) organizada en elementos funcionales discretos.

Dentro de esta secuencia se localizan dos tipos principales de secuencias consenso reguladoras: Cajas DnaA: agrupan cinco repeticiones conservadas de 9 pb reconocidas específicamente por el iniciador proteico DnaA, intercaladas además con secuencias designadas como sitios I. Elementos DUE (DNA Unwinding Elements): corresponden a tres bloques contiguos de 13 pb con una marcada riqueza en pares adenina-timina (AT). Su composición recuerda a la caja promotora bacteriana -10 por su facilidad termodinámica de apertura. Esquema estructural del origen de replicación bacteriano oriC.

Mecanismo de apertura de la doble hélice y reclutamiento del complejo DnaB- DnaC En el estado basal previo a la duplicación, la proteína DnaA —miembro de la familia ATPásica emparentada con RecA— permanece ligada constitutivamente a tres de las cinco cajas de 9 pb. La cascada replicativa se dispara al completarse la ocupación de las cinco cajas y de los sitios I complementarios. Al saturar estos sitios, las subunidades de DnaA polimerizan formando una estructura helicoidal dextrógira que envuelve el DNA parental. Este plegamiento induce una tensión torsional de superenrollamiento positivo ( ) en el núcleo del complejo nucleoproteico.

Para mitigar esta deformación geométrica, la doble hélice reacciona relajándose en los elementos DUE, los cuales sufren apertura y adquieren superenrollamiento negativo ( ). Esta transición estructural cuenta con la asistencia de la proteína de la cromatina procariota HU, responsable de facilitar la curvatura del cromosoma. Una vez generada la burbuja monocatenaria en los DUE, el factor cargador DnaC unido a ATP transfiere dos hexámeros de la helicasa DnaB hacia las hebras molde individuales. La hidrólisis de ATP por parte de DnaC desacopla al transportador y asienta operativamente a DnaB.

Las dos moléculas de W > 0 W < 0 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 10 helicasa avanzan entonces en sentidos opuestos a lo largo de cada cadena. La RNA polimerasa (RNAP) reconoce los dominios monocatenarios DUE para transcribir el cebador de la cadena líder. De forma coordinada, la maquinaria de cebado activa la síntesis discontinua de la hebra retrasada. La holoenzima DNA polimerasa III sintetiza DNA hasta alcanzar el extremo de avance de la cadena continua, momento en el cual la abrazadera (sliding clamp) libera la cadena para iniciar un nuevo fragmento de Okazaki. Esquema del avance de horquilla y síntesis de fragmentos de Okazaki.

PROCESO Cascada de iniciación de la replicación en oriC 1 Ocupación de cajas DnaA DnaA satura las cinco cajas de 9 pb y sitios I. 2 Tensión y apertura de DUE Inducción de superen rollamiento positivo y apertura de los 13- meros. 3 Carga de helicasa DnaB DnaC dependiente de ATP ensambla dos hexámeros de DnaB. 4 Cebado y elongación Síntesis de cebadores por RNAP/primasa e inicio con Pol III. COMPRUEBA 9 ¿Cómo logra la unión de DnaA abrir la doble hélice específicamente en las regiones DUE?

β Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 11 Modelo de replicación en fagos monocatenarios: el bacteriófago M13 La replicación de fagos de ssDNA circular como M13 ejemplifica la explotación celular de la maquinaria bacteriana para convertir genomas virales monocatenarios en intermediarios bicatenarios. El genoma de M13 contiene 6400 nucleótidos, incluyendo una horquilla secundaria en tallo-bucle de 57 nucleótidos. La bacteria huésped recubre todo el genoma viral con proteínas de unión a cadena sencilla (SSB), excepto la estructura en horquilla, que permanece expuesta.

La RNA polimerasa celular reconoce esta señal y sintetiza un cebador de 6 nucleótidos inmediatamente antes del bucle, extendiéndolo entre 20 y 30 nucleótidos. A continuación, la DNA polimerasa III cataloga la hebra complementaria, la DNA polimerasa I retira el cebador, la ligasa sella la muesca y la DNA girasa introduce superenrollamiento negativo. Esta ruta convierte la forma monocatenaria inicial en una forma bicatenaria abierta (RFII, con ) y posteriormente en la forma covalentemente cerrada superenrollada (RFI, con ), apta para la amplificación por círculo rodante.

PARA RECORDARLO Los intermediarios replicativos de M13 se ordenan por su grado de cierre topológico: RFII es el círculo bicatenario mellado o relajado, mientras que RFI es la forma bicatenaria completamente cerrada y superenrollada lista para el ciclo replicativo. Mecanismo de terminación: secuencias Ter y proteína Tus La fase de finalización tiene lugar en una región cromosómica de unas 350 pb ubicada diametralmente opuesta a oriC. Esta área contiene diez secuencias consenso repetidas, denominadas secuencias Ter, de 23 pb de longitud cada una, repartidas equitativamente entre las dos hebras del cromosoma (cinco en cada cadena). Diagrama de distribución y polaridad de los sitios Ter en E.

coli. W < 0 W = 0 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 12 A estos sitios diana se une de forma específica el péptido Tus (Termination utilization substance), constituyendo una trampa molecular unidireccional: Cuando la helicasa DnaB se desplaza con la horquilla, atraviesa libremente las primeras 5 secuencias Ter orientadas en sentido permisivo porque se localizan sobre la cadena opuesta. Al impactar frontalmente contra los complejos Ter-Tus orientados en sentido no permisivo, la actividad helicasa de DnaB queda completamente inhibida.

El núcleo polimerasa que continúa sintetizando DNA desacelera su progresión hasta converger y colapsar físicamente contra la helicasa de la horquilla contraria. No obstante, si se eliminan experimentalmente las secuencias Ter, la replicación termina de manera espontánea por el mero choque frontal de las horquillas. ERROR FRECUENTE Creer que las secuencias Ter detienen directamente a la DNA polimerasa III. La proteína Tus anclada a Ter bloquea específicamente el avance de la helicasa DnaB por impedimento estérico unidireccional; la polimerasa se detiene secundariamente al quedarse sin molde desenrollado.

COMPRUEBA 10 ¿Por qué la helicasa DnaB puede sobrepasar los primeros cinco sitios Ter pero queda frenada en los siguientes? Resolución de concatenados por topoisomerasa IV Al encontrarse las horquillas y sellarse la síntesis, las dos moléculas circulares hijas de DNA bicatenario quedan entrelazadas espacialmente entre sí, formando una estructura topológica de anillos concatenados (semejante a eslabones enlazados).

La separación física de ambos cromosomas requiere la acción de la topoisomerasa IV, una topoisomerasa de tipo II que genera un corte transitorio de doble hebra en una de las moléculas, transloca el otro cromosoma intacto a través de la brecha y resella el corte, decatenando por completo los genomas. Control de la frecuencia de iniciación: metilasa Dam y secuestro por SeqA El cromosoma de E. coli precisa alrededor de 40 minutos para duplicarse por completo. Sin embargo, en medios enriquecidos las bacterias proliferan duplicando su población cada 20 minutos.

Esta discrepancia temporal se resuelve mediante la formación de cromosomas multihorquilla, en los que se disparan nuevas rondas de iniciación en los orígenes duplicados antes de que la división celular previa haya culminado. Para sincronizar la iniciación con el ciclo biológico e impedir reencendidos descontrolados, oriC dispone de 11 repeticiones de la secuencia 5'-GATC-3'. La enzima metilasa Dam transfiere grupos metilo a las adeninas presentes en estas secuencias parentales antes de la duplicación: Hemimetilación post-replicativa: tras el paso de la horquilla, las cadenas sintetizadas de novo carecen de metilo, produciendo un DNA transitoriamente hemimetilado.

1 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 13 Elemento / Enzima Diana o Señal de unión Función biológica en el ciclo de replicación DnaA Cajas de 9 pb y sitios I en oriC Polimerización helicoidal e inducción de apertura torsional en los DUE. DnaC DnaB (complejo con ATP) Carga dirigida de dos hexámeros de helicasa sobre las cadenas molde abiertas. Complejo Ter- Tus 10 secuencias Ter de 23 pb Trampa polar para el bloqueo unidireccional de DnaB y convergencia de horquillas. Topoisomerasa IV Cromosomas hijos concatenados Rotura bicatenaria transitoria y decatenación de los dos anillos circulares.

Metilasa Dam Adeninas de motivos 5'- GATC-3' Marca epigenética diferencial; su retraso genera el estado hemimetilado. SeqA Secuencias GATC hemimetiladas Anclaje de oriC a la membrana para bloquear re-inicios precoces de replicación. COMPRUEBA 11 ¿Cuál es la función del estado hemimetilado generado tras el paso de la horquilla de replicación? Secuestro por SeqA: la proteína SeqA reconoce específicamente el DNA hemimetilado y secuestra a oriC anclándolo a la membrana plasmática, impidiendo que DnaA vuelva a unirse de forma prematura.

2 Segregación y remetilación: este anclaje garantiza la correcta segregación del material replicado hacia las células hijas; posteriormente, SeqA se disocia y Dam completa la metilación de la cadena nueva para restaurar la competencia de inicio. 3 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 14 IDEAS CLAVE El origen oriC contiene cinco cajas conservadas de 9 pb para DnaA y tres motivos DUE de 13 pb enriquecidos en AT donde se produce la desnaturalización inicial. La tensión torsional positiva inducida por la polimerización de DnaA favorece, junto con la proteína HU, la apertura local de los elementos DUE.

DnaC actúa como cargador dependiente de ATP para situar dos complejos de helicasa DnaB sobre cadenas opuestas del DNA monocatenario. El bloqueo de horquillas ocurre por la interacción asimétrica entre las secuencias Ter de 23 pb y la proteína Tus, inhibiendo específicamente a DnaB. La decatenación final de los cromosomas hijos interconectados depende de la actividad de corte bicatenario de la topoisomerasa IV. El retraso en la metilación por Dam sobre las secuencias GATC permite a SeqA secuestrar transitoriamente oriC en la membrana y evitar reiniciaciones inmediatas. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 12.

¿Qué consecuencia directa tiene sobre la topología del DNA la polimerización de DnaA en las cajas de oriC? 13. ¿Cómo consigue Escherichia coli dividirse cada 20 minutos si su cromosoma tarda 40 minutos en duplicarse? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 14. ¿Qué actividad de la DNAP I permite eliminar los cebadores de RNA en la cadena retrasada? 15. ¿Qué componente de la holoenzima DNAP III es directamente responsable de su alta procesividad? 16. ¿Qué cofactor energético utiliza la DNA ligasa bacteriana de Escherichia coli?

Endonucleasa AP a) Exonucleasa 5' 3' b) Polimerasa 5' 3' c) Exonucleasa 3' 5' d) Subunidad alfa a) Subunidad epsilon b) Abrazadera beta c) Dímero tau d) GTP a) UTP b) NAD+ c) ATP d) Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 15 17. ¿Qué secuencia trinucleotídica reconoce la primasa DnaG en la hebra molde para sintetizar cebadores? 18. ¿Qué elemento de oriC experimenta la apertura inicial de la doble hélice? 19. ¿Qué proteína carga la helicasa DnaB sobre la región abierta de oriC? 20. ¿Cuál es la función del complejo formado por las secuencias Ter y la proteína Tus? 21. ¿Qué enzima desengancha los cromosomas hijos concatenados tras completarse la replicación?

GTA a) CGC b) TAT c) ATG d) Las diez secuencias Ter de 23 pb a) Las once secuencias GATC metiladas b) Las cinco cajas DnaA de 9 pb c) Las tres regiones DUE de 13 pb d) SeqA a) Proteína HU b) Metilasa Dam c) DnaC d) Detener unidireccionalmente el avance de DnaB a) Decatenar los cromosomas hijos circulares b) Reclutar a la DNA polimerasa I c) Metilar las adeninas en secuencias GATC d) DNA girasa a) Topoisomerasa IV b) DNA polimerasa I c) Helicasa DnaB d) Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 16 3 Maquinaria enzimática y ciclo celular AL ACABAR SABRÁS Diferenciar las funciones replicativas de las DNA polimerasas alfa, delta y epsilon en la horquilla de replicación.

Describir el mecanismo de conmutación de polimerasas mediado por RFC y PCNA. Explicar el procedimiento de eliminación de cebadores y maduración de los fragmentos de Okazaki mediante RNAsa H1 y FEN-1. Comparar los componentes del replisoma eucariota con sus análogos procariotas. PIÉNSALO ANTES DE LEER 22 ¿Por qué las células eucariotas necesitan dos polimerasas diferentes para elongar las cadenas continua y discontinua si las bacterias usan la misma enzima? La replicación del material genético en células eucariotas comparte los principios químicos fundamentales observados en bacterias, pero presenta un grado superior de complejidad estructural y organizativa debido a la presencia de cromatina.

Mientras que una horquilla de replicación bacteriana avanza a una velocidad de unos 1000 nucleótidos por segundo, la polimerasa eucariota sintetiza a un ritmo aproximado de 50 nucleótidos por segundo. Para duplicar genomas considerablemente más grandes dentro de los límites temporales del ciclo celular, las células eucariotas coordinan múltiples replisomas a lo largo de cromosomas lineales.

Replicación en eucariotas 3 Maquinaria enzimática y ciclo celular 4 Licenciamiento del origen y biología del telómero Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 17 ESQUEMA Maquinaria replicativa eucariota El ciclo celular y la clasificación de las DNA polimerasas La duplicación cromosómica se restringe a una ventana temporal estricta conocida como la fase S (síntesis de DNA). Esta fase está precedida por la fase (preparación y compromiso celular), sucedida por la fase (preparación para el reparto celular) y culmina en la fase M (mitosis y división). Aquellas células que cesan su proliferación abandonan este ciclo para ingresar en un estado de quiescencia denominado .

Replisoma eucariota Complejo macromolecular de replicación Polimerasas nucleares Enzimas de la familia B Pol alfa/primasa Cebado híbrido RNA-DNA Pol delta Síntesis hebra rezagada Pol epsilon Síntesis hebra conductora Factores de procesividad Abrazadera y cargador PCNA Trímero deslizante RFC Cargador dependiente de ATP Maduración de Okazaki Eliminación de iniciadores y sellado RNAsa H1 Degrada el RNA interno FEN-1 Corta la solapa monocatenaria DNA ligasa Unión covalente final G 1 G 2 G 0 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 18 Diagrama de las etapas del ciclo celular con la fase S replicativa.

Las polimerasas celulares se ordenan filogenéticamente en familias estructurales: Familia A: engloba a la DNA polimerasa I procariota y a la DNA polimerasa gamma ( ), responsable exclusiva de replicar el DNA mitocondrial. Familia B: incluye a las enzimas nucleares replicativas principales ( , y ), emparentadas estructuralmente con la DNA polimerasa II bacteriana. En la replicación nuclear eucariota no participa ninguna polimerasa de la familia C (familia a la que pertenece la replicasa principal procariota; véase «Replicación en procariotas — Organización del replicón y maquinaria enzimática»).

Familia C: comprende las réplicas cromosómicas bacterianas (como la subunidad catalítica de la Pol III). Familia D: polimerasas presentes de forma típica en arqueas. Familias X e Y: enzimas especializadas en procesos de reparación y síntesis translesión (Pol IV y Pol V). COMPRUEBA 23 ¿Por qué la ausencia de polimerasas de la familia C en el núcleo eucariota demuestra una divergencia evolutiva en el replisoma?

División funcional del trabajo en la horquilla replicativa nuclear La síntesis coordinada de las dos cadenas en la horquilla de replicación se reparte entre tres complejos enzimáticos esenciales de la familia B: Pol γ Pol α Pol δ Pol ε Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 19 Esquema de la horquilla replicativa eucariota con sus polimerasas principales. DEFINICIÓN La conmutación de polimerasas (polymerase switching) es el intercambio coordinado mediante el cual RFC desplaza a la tras sintetizar el iniciador híbrido y carga la abrazadera PCNA, reclutando a la polimerasa de alta procesividad ( o ) para continuar la elongación.

Iniciación y cebado por el complejo /primasa: este heterotetrámero integra una subunidad con actividad DNA polimerasa, una subunidad primasa y dos polipéptidos accesorios reguladores. La primasa sintetiza en primer lugar un segmento corto de RNA de aproximadamente 12 ribonucleótidos, continuado inmediatamente por la con un tramo iniciador de unos 20 desoxirribonucleótidos. Debido a su baja procesividad (alrededor de 100 nucleótidos) y a la ausencia de actividad correctora , esta enzima se limita a fabricar este cebador híbrido sin extenderlo indefinidamente.

1 Pol α Pol α 3 5 Conmutación de polimerasas por RFC y PCNA: el factor de replicación C (RFC), equivalente funcional al cargador de la abrazadera bacteriano, reconoce la unión cebador-molde y desaloja a la . A continuación, ensambla sobre el DNA la abrazadera deslizante denominada antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). PCNA es un anillo homotrimérico homólogo a la abrazadera beta dimérica de E. coli. 2 Pol α Elongación de la cadena rezagada por : la unión de PCNA confiere una procesividad casi ilimitada a la (un heterodímero catalítico con subunidades accesorias), permitiéndole sintetizar de forma discontinua cada fragmento de Okazaki.

3 Pol δ Pol δ Síntesis continua de la cadena conductora por : este heterotetrámero cuenta con procesividad intrínseca y una eficaz actividad exonucleasa correctora , sintetizando la hebra líder sin depender estrictamente de PCNA o RFC para mantenerse sobre el molde, aunque puede colaborar con otros factores replisómicos. 4 Pol ε 3 5 Pol α Pol δ Pol ε Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 20 PARA RECORDARLO En condiciones clínicas autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico, los pacientes generan autoanticuerpos dirigidos específicamente contra la proteína PCNA, lo que subraya su abundancia y relevancia en núcleos proliferantes.

Diagrama de la carga de PCNA y el ensamblaje del replisoma. COMPRUEBA 24 ¿Qué consecuencia tiene sobre la fidelidad replicativa que carezca de corrección de pruebas ? Procesamiento y maduración de los fragmentos de Okazaki Los fragmentos de Okazaki en eucariotas son considerablemente más cortos que en bacterias: abarcan entre 100 y 200 nucleótidos frente a los 1000-2000 nucleótidos procariotas.

Al topar con el fragmento sintetizado previamente, la hebra rezagada experimenta un proceso de maduración: Pol α 3 5 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 21 PROCESO Maduración de los fragmentos de Okazaki ERROR FRECUENTE Asumir que la RNAsa H1 retira todo el cebador es un fallo muy habitual en los exámenes: RNAsa H1 no puede romper el enlace fosfodiéster entre el último ribonucleótido y el primer desoxirribonucleótido. Dicha unión requiere indispensablemente la acción endonucleolítica de FEN-1.

Correspondencias funcionales entre procariotas y eucariotas La siguiente tabla resume las equivalencias directas de los factores replicativos entre Escherichia coli y los organismos eucariotas: Desplazamiento por Pol delta Generación de una solapa monocatenaria libre en 5' 1 Hidrólisis por RNAsa H1 Eliminación de la mayor parte del iniciador de RNA 2 Corte por FEN-1 Escisión del ribonucleótido terminal y DNA de baja fidelidad 3 Relleno por Pol delta Polimerización del hueco restante en la hebra 4 Ligación por Ligasa I Sellado del enlace fosfodiéster contiguo 5 Desplazamiento de cadena: la continúa la síntesis y desplaza el extremo del cebador preexistente, generando una solapa monocatenaria (flap).

1 Pol δ 5 Degradación del RNA por RNAsa H1: la enzima RNAsa H1 hidroliza la mayor parte de los ribonucleótidos, dejando intacto el último ribonucleótido unido covalentemente al fragmento de DNA contiguo. 2 Escisión por la endonucleasa FEN-1: la endonucleasa FEN-1 (Flap EndoNuclease 1) corta en la base de la solapa desplazada. Además de retirar el ribonucleótido terminal, FEN-1 puede escindir segmentos de DNA que contengan posibles errores cometidos por la durante el cebado inicial. 3 Pol α Relleno y sellado: la polimeriza rellenando el hueco restante y la DNA ligasa I cataliza la formación del enlace fosfodiéster final.

4 Pol δ Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 22 Función bioquímica Factor procariota (E.

coli) Factor eucariota Replicasa de la cadena conductora Holoenzima DNA Pol III (dímero) Replicasa de la cadena retrasada Holoenzima DNA Pol III (dímero) Síntesis del cebador DnaG (primasa) Complejo /primasa Abrazadera deslizante de procesividad Subunidad (dímero) PCNA (trímero) Cargador de la abrazadera Complejo RFC (factor de replicación C) Eliminación de la solapa/cebador DNA Pol I (actividad exonucleasa ) RNAsa H1 + endonucleasa FEN-1 Protección de cadena sencilla SSB RPA (Replication Protein A) Helicasa replicativa DnaB Complejo MCM (heterohexámero) COMPRUEBA 25 ¿Qué enzima eucariota desempeña una función análoga a la actividad exonucleasa 5' 3' de la DNA Pol I bacteriana?

IDEAS CLAVE La velocidad de replicación por horquilla en eucariotas ronda los 50 nucleótidos por segundo, compensada por la activación de múltiples replisomas cromosómicos. El complejo /primasa genera un cebador mixto formado por 12 ribonucleótidos y unos 20 desoxirribonucleótidos iniciales. La división funcional del replisoma asigna la síntesis continua de la cadena conductora a la y la hebra retrasada a la . PCNA forma un anillo homotrimérico que actúa como abrazadera deslizante, cargado en el DNA por el complejo RFC mediante la conmutación de polimerasas.

La maduración de los fragmentos de Okazaki (de 100 a 200 nucleótidos) requiere la acción coordinada de RNAsa H1, la endonucleasa FEN-1 y la DNA ligasa. Pol ε Pol δ Pol α β γ 5 3 Pol α Pol ε Pol δ Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 23 COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 26. ¿Cuál es la constitución molecular precisa del cebador sintetizado por el complejo Pol alfa/primasa? 27. ¿En qué se diferencia la estructura cuaternaria de la abrazadera PCNA de la abrazadera beta bacteriana? 28. ¿Por qué la síntesis de la hebra continua no requiere una dependencia absoluta de RFC para su elongación como la hebra discontinua?

REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS 4 Licenciamiento del origen y biología del telómero AL ACABAR SABRÁS Diferenciar las secuencias y dominios de iniciación replicativa entre levaduras y metazoos. Explicar el ensamblaje del pre-RC en G1 y su control de activación irreversible en fase S. Describir la composición funcional de la telomerasa y su ciclo catalítico de extensión terminal. Relacionar la estructura protectora del telómero (cuartetos G, shelterina y T-loop) con la senescencia y la oncogénesis. PIÉNSALO ANTES DE LEER 29 ¿Por qué un cromosoma lineal se acorta en cada ciclo de división celular si no interviene una maquinaria especializada?

Organización y diversidad de los orígenes de replicación en eucariotas A diferencia de los cromosomas circulares bacterianos, el genoma eucariota lineal contiene múltiples orígenes de replicación distribuidos a lo largo de cada cromosoma. La estructura física de estos puntos de inicio varía notablemente según el grupo biológico analizado: Levaduras: presentan secuencias definidas denominadas ARS (secuencias de replicación autónoma). Estas regiones poseen una longitud aproximada de 125 pb variables, caracterizadas por un módulo central conservado de unos 11 pb sumamente rico en adeninas y timinas (AT).

Metazoos simples: contienen orígenes espaciados periódicamente cada 10 a 50 kb, cuya ubicación es independiente de una secuencia consenso estricta. Metazoos superiores: exhiben orígenes espaciados en intervalos de 3 a 300 kb. Su selección y frecuencia dependen del tipo celular, el tejido diferenciado y el momento fisiológico del ciclo celular. A pesar de esta notable divergencia en la secuencia del DNA, las proteínas encargadas del reconocimiento de los orígenes y de la iniciación replicativa se encuentran altamente conservadas evolutivamente en todos los eucariotas.

Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 24 Control temporal del ciclo: licenciamiento en G1 y activación en fase S Para asegurar que el material genético se duplique con estricta fidelidad, la célula eucariota debe duplicar su DNA exactamente una vez por ciclo celular. Si un replicón se dispara dos veces dentro del mismo ciclo, sobreviene una sobre-replicación letal (inestabilidad cromosómica). Este estricto control se consigue desacoplando el proceso en dos fases temporales mutuamente excluyentes: el licenciamiento durante la fase G1 y la activación al ingresar en la fase S.

PROCESO Ciclo de licenciamiento y activación del origen replicativo eucariota Fase G1: Marcaje por ORC ORC reconoce el origen en la cromatina descondensada 1 Reclutamiento de factores ORC recluta los reguladores Cdc6 y Cdt1 2 Carga de helicasa MCM Se carga el heterohexámero MCM2-7 formando el pre-RC 3 Transición a fase S CDK y DDK fosforilan Cdc6 y Cdt1 4 Bloqueo por geminina Geminina inactiva a Cdt1 impidiendo re-licenciamientos 5 Disparo de horquillas Polimerasas replican el DNA una sola vez por ciclo 6 Fase de licenciamiento (complejo pre-replicativo o pre-RC): ocurre exclusivamente durante la ventana de baja actividad quinasa de la fase G1.

En este periodo se seleccionan los orígenes y se estructuran de forma coordinada grupos de 20 a 80 orígenes simultáneamente. El complejo de reconocimiento de origen (ORC), un heterohexámero funcionalmente análogo al iniciador procariota DnaA, se une al origen y recluta a dos proteínas coordinadoras: Cdc6 y Cdt1. Ambos factores reclutan y cargan sobre la doble hélice al complejo helicasa MCM (heterohexámero MCM2-7, análogo eucariota de DnaB). Cuando este ensamblaje culmina, el origen queda formalmente licenciado. En células en estado de quiescencia (fase G0), el complejo MCM no se encuentra presente. 1 Fase de activación del origen: se inicia con la transición a la fase S.

El incremento de actividad de dos complejos quinasa clave, las CDK (quinasas dependientes de ciclinas) y las DDK (quinasas dependientes de Dbf4), desencadena la fosforilación de Cdc6 y Cdt1, liberándolas del complejo promotor. Inmediatamente, la proteína geminina secuestra a la molécula Cdt1 libre, impidiendo que vuelva a cargar nuevos complejos MCM e inhabilitando cualquier nuevo licenciamiento en el mismo ciclo. 2 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 25 ERROR FRECUENTE Confundir el momento temporal del licenciamiento con el de la iniciación replicativa. El complejo pre-RC solo puede ensamblarse en la fase G1, cuando la actividad CDK es baja.

Si la célula se encuentra ya en fase S, los altos niveles de CDK y la geminina inhiben la formación de nuevos pre-RC para garantizar de forma irreversible que ningún origen se replique dos veces en una misma división. COMPRUEBA 30 ¿Qué papel trascendental cumple la geminina tras la fosforilación de los factores del pre-RC en la fase S? El problema de la replicación del extremo y la telomerasa La síntesis semidiscontinua de los cromosomas eucariotas lineales se enfrenta a una limitación topológica fundamental en los extremos de la hebra retardada.

Para que la DNA polimerasa δ pueda retirar y reemplazar un cebador por desoxirribonucleótidos, requiere enganchar dicho cebador por su extremo 5' habiendo nucleótidos de DNA corriente arriba. Sin embargo, en el último cebador del extremo 3' terminal de la hebra molde, al remover el RNA no queda ningún extremo 3'-OH preexistente desde el cual elongar. La hebra monocatenaria hija quedaría truncada tras cada ronda replicativa, provocando la pérdida progresiva de material genético.

Para subsanar este dilema biológico, los eucariotas utilizan la telomerasa, una ribonucleoproteína especializada constituida por dos componentes esenciales: TER (RNA de la telomerasa): subunidad de RNA intrínseca que actúa como molde o plantilla interna para la polimerización. TERT (transcriptasa inversa de la telomerasa): subunidad con actividad catalítica de transcriptasa inversa que elonga DNA tomando como guía la plantilla de RNA asociada. En el genoma humano, las regiones teloméricas están compuestas por una secuencia en tándem rica en guaninas consistente en repeticiones del hexanucleótido 5'-TTAGGG-3', reiteradas en serie hasta unas 200 veces.

Esta terminación no es un extremo romo: la hebra rica en G finaliza en una prolongación saliente monocatenaria 3'. La telomerasa reconoce e hibrida con este saliente 3' mediante su componente TER y, sin necesidad de un cebador exógeno gracias a que el propio saliente 3'-OH sirve de iniciador, cataliza la elongación por adición de desoxinucleótidos trifosfato (dGTP y dTTP). Posteriormente, el complejo se transloca procesivamente para repetir la síntesis reiterada del motivo terminal.

Disparo de la horquilla replicativa: la fosforilación mediada por CDK y DDK activa al complejo MCM, permitiendo la apertura del dúplex y el reclutamiento sucesivo de la polimerasa iniciadora Pol α/primasa, el cargador RFC y la pinza proliferativa PCNA (véase «Replicación en eucariotas — Maquinaria enzimática y ciclo celular»). La polimerasa Pol ε asume la síntesis de la hebra conductora, mientras que la Pol δ procesa la hebra retardada. La estabilización del DNA monocatenario resultante corre a cargo del heterotrímero RPA (proteína de replicación A), equivalente funcional de las proteínas SSB bacterianas.

3 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 26 Esquema del mecanismo de elongación y translocación de la telomerasa. Estructura protectora: cuartetos de guanina, lazo T y shelterina Un extremo libre monocatenario de DNA lineal dentro del núcleo representa una señal aberrante idéntica a una rotura de doble cadena (DSB), lo que provocaría fusiones cromosómicas letales mediadas por rutas de reparación no homólogas (véase «Reparación del DNA — Reparación de apareamientos incorrectos, respuesta SOS y roturas de doble cadena»).

Para impedir este reconocimiento patológico, el extremo telomérico adopta una conformación tridimensional compacta y sumamente estable: Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 27 Esquema de cuartetos de guanina y conformación del bucle T. Cuartetos de guanina (G-quadruplex): las secuencias ricas en G del extremo saliente 3' interaccionan espacialmente entre sí formando placas tetraméricas planas de bases nitrogenadas unidas por puentes de hidrógeno de tipo Hoogsteen. El apilamiento de estas plataformas cuadradas altera la linealidad de la cadena e induce el desacoplamiento de la subunidad catalítica TERT.

Bucle T (T-loop) y bucle D (D-loop): el extremo monocatenario 3' se curva hacia atrás e invade la región bicatenaria proximal del propio telómero. Al intercalarse entre la doble hebra, desplaza localmente a la hebra homóloga rica en guaninas, generando una estructura de triple hélice conocida como D-loop (bucle de desplazamiento), que a su vez cierra un lazo macroestructural denominado T-loop (bucle telomérico). Complejo shelterina (telosoma): heterohexámero proteico que recubre y estabiliza íntegramente la arquitectura del bucle T.

Oculta mecánicamente el extremo terminal 3' frente al ataque de exonucleasas y neutraliza el reclutamiento inadvertido de la maquinaria celular reparadora de roturas cromosómicas. COMPRUEBA 31 ¿Qué conformación espacial adopta el saliente 3' del telómero para evitar ser reconocido como un daño de doble cadena en el DNA?

Implicaciones biomédicas: senescencia, progeria y tumorigénesis La actividad de la telomerasa se encuentra diferencialmente regulada según el linaje celular: Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 28 Tipo celular Estado de la telomerasa Consecuencia replicativa Células somáticas humanas Silenciada (represión y compactación génica) Erosión progresiva de telómeros; límite replicativo y senescencia celular tras 20-60 ciclos Células germinales (espermatozoides) Constitutivamente activa Mantenimiento indefinido de la longitud telomérica en todas las etapas de la vida Eucariotas unicelulares Elevada actividad permanente Capacidad proliferativa ilimitada sin degradación terminal de los cromosomas Células tumorales Reactivación anómala desregulada Inmortalización celular proliferativa y resistencia a la senescencia Diagrama de rutas inducidas por erosión telomérica hacia senescencia o cáncer.

En las células somáticas adultas, los telómeros experimentan un acortamiento progresivo tras cada división celular. Tras alcanzar entre 20 y 60 duplicaciones (límite de Hayflick), el acortamiento crítico telomérico desenmascara los extremos cromosómicos. Este suceso activa al supresor tumoral p53, el cual coordina dos rutas protectoras: Si los puntos de control génico se encuentran intactos, p53 conduce a la célula de manera irreversible hacia la senescencia replicativa o induce la muerte programada por apoptosis, lo que fundamenta el envejecimiento biológico natural a nivel tisular.

En ausencia o mutación de p53, la célula evade la senescencia a pesar del daño terminal extremo, desencadenando una severa inestabilidad genómica que propicia la transformación maligna y el desarrollo de tumores cancerosos. Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 29 Alteraciones estructurales del núcleo también aceleran patológicamente este eje de degradación celular. En la progeria, un defecto de inestabilidad en la laminina nuclear deteriora el anclaje y funcionamiento de la maquinaria de mantenimiento telomérico, precipitando un cuadro clínico de envejecimiento celular acelerado prematuro en etapas infantiles.

IDEAS CLAVE Los orígenes de replicación varían entre eucariotas: desde secuencias definidas ricas en AT (ARS) en levaduras hasta dominios amplios dependientes del contexto tisular en metazoos. El licenciamiento ocurre exclusivamente en G1 mediante el reclutamiento ordenado de ORC, Cdc6, Cdt1 y el heterohexámero helicasa MCM (pre-RC). En fase S, la activación mediada por CDK y DDK fosforila a los componentes del pre-RC, permitiendo que la geminina secuestre a Cdt1 para evitar re-replicaciones indeseadas. La telomerasa es una ribonucleoproteína (TER y TERT) que elonga el saliente 3' con repeticiones usando su propio RNA como plantilla.

El extremo 3' monocatenario telomérico forma cuartetos de guanina y se repliega en una estructura invasiva (bucles T y D) protegida por el complejo shelterina. El agotamiento telomérico somático activa p53 hacia senescencia o apoptosis (envejecimiento); la pérdida de p53 propicia inestabilidad genómica y cáncer por inmortalización. COMPRUEBA LO QUE HAS APRENDIDO 32. ¿Cuál es la función del complejo shelterina en los extremos de los cromosomas eucariotas lineales? 33. ¿Por qué las células somáticas humanas entran en senescencia replicativa tras 20-60 ciclos de división? Test Rodea la respuesta correcta. Las soluciones están al final. 34.

¿Qué polimerasa eucariota se encarga de la replicación del DNA mitocondrial? 35. ¿Cuál es la longitud típica de los fragmentos de Okazaki en eucariotas? 36. ¿Qué factor celular actúa como cargador de la abrazadera PCNA en eucariotas? 5 -TTAGGG-3 Polimerasa alfa a) Polimerasa gamma b) Polimerasa delta c) Polimerasa epsilon d) 5000 a 10000 nucleótidos a) 10 a 20 nucleótidos b) 100 a 200 nucleótidos c) 1000 a 2000 nucleótidos d) MCM a) RPA b) RFC c) FEN-1 d) Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 30 37. ¿Qué enzima corta la solapa 5' para retirar el último ribonucleótido del cebador? 38. ¿En qué fase del ciclo celular se ensambla el complejo pre-replicativo (pre-RC)? 39.

¿Qué molécula secuestra a Cdt1 durante la fase S para evitar sobre-replicaciones? 40. ¿Cuál es la secuencia consenso telomérica repetida en tándem en humanos? 41. ¿Qué alteración genética y proteica se asocia con el fenotipo progeroide descrito en el texto? 5 Elementos genéticos móviles — Transcriptasa inversa y transposición AL ACABAR SABRÁS Describir las tres etapas catalíticas sucesivas de la transcriptasa inversa. Comparar los mecanismos de transposición replicativa y no replicativa. Clasificar los elementos transponibles procariotas y los retrotransposones eucariotas.

PIÉNSALO ANTES DE LEER 42 ¿Por qué un fármaco antivírico diseñado para bloquear una polimerasa puede detener al VIH sin destruir inmediatamente nuestras propias células? Los elementos genéticos móviles constituyen secuencias capaces de desplazarse o duplicarse dentro de un genoma o entre genomas distintos. Este fenómeno sustenta procesos esenciales de evolución horizontal y patogenicidad microbiana.

Polimerasa epsilon a) FEN-1 b) DNA ligasa I c) RNAsa H1 d) Fase G2 a) Fase S b) Fase M c) Fase G1 d) Geminina a) PCNA b) RPA c) Shelterina d) 5'-GGGGTT-3' a) 5'-TTAGGG-3' b) 5'-CCCTAA-3' c) 5'-ATATAT-3' d) Sobreexpresión aberrante de TERT a) Hiperactivación de la geminina b) Inestabilidad en la laminina nuclear c) Ausencia constitutiva de PCNA d) Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 31 ESQUEMA Elementos genéticos móviles y recombinación La transcriptasa inversa: actividades enzimáticas e inhibición farmacológica La transcriptasa inversa o retrotranscriptasa es un enzima multifuncional presente en retrovirus y retrotransposones.

En el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), se organiza como un heterodímero formado por las subunidades p66 y p51.

Esta enzima lleva a cabo tres actividades catalíticas sucesivas para convertir el ARN monocatenario vírico en ADN bicatenario: Elementos genéticos móviles Secuencias con capacidad de transposición genómica Transposones de ADN Movilidad directa a nivel de ADN Secuencias IS Solo transposasa y repeticiones IR Transposones Tn Resistencia a antibióticos y resolvasa Retrotransposones Movilidad con intermediario de ARN Virus- like (LTR) Similares a retrovirus sin cápside No virales (poli-A) Subdivididos en LINEs y SINEs Actividad transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN): Sintetiza una hebra de ssDNA a partir del ssRNA parental. Requiere un cebador para iniciar la síntesis.

Los retrovirus utilizan una molécula de tRNA celular que hibrida con el ARN vírico para suministrar el extremo iniciador. 1 Actividad ribonucleasa H (RNasa H): Degrada selectivamente la cadena de ARN del híbrido ARN:ADN generado, liberando la hebra de ssDNA molde. 2 Actividad ADN polimerasa dependiente de ADN: Genera la segunda hebra de ADN para formar un dúplex de dsDNA. Esta segunda hebra no precisa un cebador externo, ya que el propio extremo del ssDNA se pliega sobre sí mismo para servir de cebador. 3 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 32 Esquema de las tres actividades catalíticas de la transcriptasa inversa.

El fármaco AZT (azidotimidina) actúa como un análogo nucleosídico de timidina que carece del grupo hidroxilo en posición 3' (3'-OH), asemejándose a un didesoxinucleótido (ddNTP). Al incorporarse a la cadena en crecimiento, impide la formación del enlace fosfodiéster siguiente, provocando la interrupción de la síntesis de ADN. Sin embargo, mutaciones en la retrotranscriptasa permiten al virus discriminar estos ddNTP análogos y continuar su replicación, confiriendo resistencia farmacológica. COMPRUEBA 43 ¿Por qué la segunda etapa de síntesis de ADN mediada por la transcriptasa inversa no requiere un cebador externo de ARN?

Fundamentos de la transposición y recombinación ilegítima Los transposones son segmentos de ADN capaces de cambiar de ubicación física en el genoma. Esta movilidad constituye un potente motor de evolución adaptativa al facilitar la transferencia horizontal de material genético entre huéspedes y patógenos o simbiontes. La frecuencia fisiológica de transposición es intencionadamente baja ( a eventos por división celular), lo cual minimiza daños letales al huésped. A diferencia de la recombinación en la meiosis, los transposones se integran mediante recombinación ilegítima, un mecanismo independiente de homología de secuencia extensa entre el elemento y la diana.

La reacción está catalizada por una transposasa en procariotas o una integrasa en eucariotas. Al insertarse, la rotura escalonada del ADN diana genera extremos cohesivos que son rellenados por la 10 5 10 7 Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 33 ADN polimerasa I y sellados por ligasa, creando repeticiones directas flanqueantes idénticas en orientación opuesta a los extremos invertidos terminales o repeticiones invertidas (IR, Inverted Repeats).

Clasificación de transposones procariotas y variación de fase En bacterias coexisten tres estructuras principales de transposones: Tipo de elemento Estructura genética Función y características Secuencias de inserción (IS) Gen de transposasa flanqueado por repeticiones invertidas (IR). Son los elementos más sencillos. Únicamente codifican las enzimas necesarias para su propia movilidad. Transposones Tn IR terminales, gen de transposasa (tnpA), resolvasa/represor (tnpR) y genes accesorios. Transportan determinantes fenotípicos adicionales, clásicamente factores de resistencia a antibióticos como la beta- lactamasa.

Transposones compuestos Región central con genes heterólogos delimitada por dos módulos IS completos en los extremos. Se movilizan conjuntamente gracias a la acción de las secuencias IS que flanquean el segmento central. Esquema estructural de un transposón Tn bacteriano con sus genes. Un fenómeno especializado relacionado con el movimiento de fragmentos de ADN ocurre en Salmonella. Esta bacteria elude la respuesta inmunitaria del hospedador mediante la variación de fase.

El gen que sintetiza la flagelina se encuentra contiguo a un segmento genético móvil que se invierte físicamente sobre sí mismo; al girar, bloquea la transcripción de la flagelina original y activa una variante alternativa, despistando a los anticuerpos neutralizantes. COMPRUEBA 44 ¿En qué se diferencia estructuralmente una secuencia de inserción (IS) de un transposón Tn complejo?

Mecanismos de transposición: vía replicativa frente a no replicativa El desplazamiento del elemento transponible puede seguir dos estrategias catalíticas distintas: Transposición no replicativa (mecanismo conservativo o de «corta y pega»): El elemento genético se escinde físicamente de su locus original mediante roturas de doble cadena y se inserta Replicación, recombinación y reparación del DNA: Apuntes 34 en un nuevo sitio diana (o en el mismo si sufre una inversión). El transposón bacteriano Tn5 opera mediante esta ruta, conservando una única copia del elemento en la célula.

Transposición replicativa: La transposasa promueve un corte monocatenario y transfiere una sola cadena al sitio de inserción diana. La replicación subsiguiente mediante horquillas específicas forma una molécula intermedia gigante llamada cointegrado, que une los dos replicones. Posteriormente, la ADN polimerasa I rellena las zonas monocatenarias y una resolvasa…