Examen de pràctiques de Genètica (UAB): PCR i dot-blot

Detecció mitjançant PCR — Extracció d'ADN i reacció d'amplificació

Objectiu experimental i context biològic

En estudis de genètica poblacional i evolutiva de dípters com Drosophila buzzatii, un procediment habitual consisteix a determinar la presència o absència d'elements genètics mòbils. L'objectiu central d'aquest protocol pràctic és constatar si determinats individus porten integrat al seu genoma el retrotransposó Osvaldo mitjançant la tècnica de reacció en cadena de la polimerasa (PCR).

Extracció i purificació d'ADN genòmic

Per poder dur a terme l'amplificació in vitro cal disposar d'un motlle d'àcid nucleic lliure de proteïnes, lípids de membrana i restes tissulars que puguin interferir amb la polimerasa. El procés de purificació s'estructura en tres etapes consecutives:

1. Lisi cel·lular combinada: s'inicia amb una disrupció mecànica mitjançant el triturat dels exemplars de mosca. Aquest pas s'acompanya d'una fase química on intervenen sals i agents quelants (EDTA), els quals segresten cations divalents com el $\text{Mg}^{2+}$ imprescindibles per a l'activitat de les nucleases cel·lulars, protegint així l'ADN de la degradació enzimàtica. Tot seguit, l'addició de detergents iònics com el dodecilsulfat sòdic (SDS) dissol la bicapa lipídica de les membranes i desnaturalitza les proteïnes associades. Finalment, un canvi de condicions salines i de pH indueix la precipitació massiva del complex proteic i de les restes cel·lulars insolubles, que sedimenten al fons del tub després d'una centrifugació forçada. L'ADN roman soluble a la fase líquida aquosa (sobrenedant).
2. Precipitació dels àcids nucleics: la precipitació es desencadena incorporant un solvent orgànic com l'isopropanol. Aquest alcohol disminueix dràsticament la constant dielèctrica del medi, fent que les cadenes fosfodièster carregades negativament perdin afinitat per les molècules d'aigua i s'agreguin entre si, formant una xarxa filamentosa visible (aparença de medusa). Després de centrifugar per concentrar l'ADN al fons en forma de precipitat (pellet), es realitzen rentats successius amb etanol al $70\text{--}80\%$ per arrossegar restes de sals i contaminants orgànics sense redissoldre el material genètic.
3. Resuspensió: un cop evaporat completament qualsevol residu d'etanol —que d'altra manera inhibiria la PCR—, el precipitat d'ADN es redissol en un volum mesurat d'aigua destil·lada estèril lliure de DNases o en un tampó d'elució neutre.

Fonaments i components de la reacció d'amplificació (PCR)

La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) permet produir milions de còpies d'un fragment genòmic determinat a partir d'una quantitat inicial ínfima d'ADN motlle. Aquesta síntesi dirigida requereix una combinació precisa de reactius:

• Taq polimerasa: ADN polimerasa aïllada del bacteri extremòfil Thermus aquaticus, caracteritzada per la seva elevada estabilitat tèrmica davant cicles repetits de desnaturalització a 94–95 °C. Sintetitza noves cadenes complementàries en direcció $5' \rightarrow 3'$ a partir d'un extrem 3'-OH lliure.
• Encebadors o primers: parella d'oligonucleòtids sintètics de cadena senzilla dissenyats específicament per flanquejar la regió de l'element Osvaldo que es vol detectar, unint-se per complementarietat antiparal·lela.
• Desoxirribonucleòtids trifosfat (dNTPs): mescla equimolar de dATP, dCTP, dGTP i dTTP, que aporten els blocs estructurals i l'energia necessària per a l'elongació de la cadena.
• Tampó de reacció amb $\text{Mg}^{2+}$: manté el pH òptim i subministra ions magnesi lliures, cofactors obligats de la polimerasa per estabilitzar l'acoblament dels nucleòtids.

Cicle tèrmic de la PCR

La reacció té lloc en un termociclador programat amb $30\text{ a }35\text{ cicles}$ consecutius estructurats en tres fases de temperatura:

1. Desnaturalització (aprox. $94\text{--}95\text{ }^\circ\text{C}$): el calor trenca els ponts d'hidrogen intermoleculars entre les bases nitrogenades, separant la doble hèlix d'ADN motlle en dues cadenes simples accessibles.
2. Hibridació o annealing (habitualment entre $50\text{--}65\text{ }^\circ\text{C}$): la disminució tèrmica permet que els encebadors s'alineïn i s'uneixin de manera específica a les seqüències diana complementàries.
3. Extensió o elongació (habitualment $72\text{ }^\circ\text{C}$): temperatura òptima per a la Taq polimerasa, la qual estén la nova cadena sintetitzant àcid nucleic a partir dels extrems dels primers.

Disseny dels controls experimentals

Per garantir la validesa i la interpretabilitat dels resultats obtinguts mitjançant PCR, és imprescindible córrer en paral·lel una sèrie de reaccions de control estrictes:

Idees clau

• L'extracció d'ADN requereix lisi mecànica i química, quelació de Mg²⁺ amb EDTA per inhibir nucleases i eliminació de proteïnes per centrifugació.
• La precipitació amb isopropanol redueix la constant dielèctrica de l'aigua i permet agregar l'ADN, el qual es renta posteriorment amb etanol per eliminar impureses salines.
• Cada cicle de PCR consta de tres estadis tèrmics: desnaturalització de la doble cadena, hibridació dels encebadors específics i extensió catalitzada per la Taq polimerasa.
• L'ús simultani d'un control positiu constitutiu (com GAPDH) i un control negatiu lliure de motlle garanteix que els resultats no siguin falsos negatius per inhibició ni falsos positius per contaminació.

Posa a prova el que has après

1. Quina funció mecànica i química té l'ús d'isopropanol en l'extracció d'ADN? — Reduir la constant dielèctrica fent precipitar l'ADN
2. Per quin motiu s'utilitza una ADN polimerasa termoestable com la Taq en lloc d'una polimerasa estàndard? — Resisteix les altes temperatures de desnaturalització
3. Què indica l'absència de banda tant al pouet de GAPDH com al d'Osvaldo per a una mateixa mostra? — Hi ha hagut una fallada tècnica o inhibició
4. Què s'ha de fer si el control negatiu sense ADN (NTC) produeix una banda d'amplificació? — Invalidar l'assaig per presència de contaminació

Detecció mitjançant PCR — Electroforesi en agarosa i anàlisi de controls

Principis físics de la separació electroforètica

Un cop finalitzada la PCR, els productes amplificats s'analitzen per electroforesi. L'electroforesi en gel d'agarosa permet separar fragments d'àcids nucleics segons la seva mida molecular. A causa dels grups fosfat, l'ADN posseeix una càrrega neta negativa constant, fet que provoca la seva migració cap al pol positiu o ànode en aplicar un camp elèctric.

Secció completa amb Premium

Idees clau

• na aliqua ut enim ad minim veniam quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliqui
• s nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit
• s nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do ei
• quat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do eiusmod temp
• ctetur adipiscing elit sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua ut eni

Detecció mitjançant dot-blot — Disseny de la sonda i clonació en pBSK

Estratègia de clonació al vector pBSK

Com a alternativa a la detecció per PCR descrita a «Detecció mitjançant PCR — Electroforesi en agarosa i anàlisi de controls», per tal de detectar l'element transposable Osvaldo (aïllat del genoma de Drosophila buzzatii) mitjançant la tècnica de dot-blot, cal generar una sonda d'hibridació específica. Aquest procediment s'inicia amb el plàsmid comercial pBSK (de 3 kb), el qual compta amb dianes de restricció i marcadors de resistència a antibiòtics.

Secció completa amb Premium

Idees clau

• na aliqua ut enim ad minim veniam quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum
• s nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing
• s nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do eiusm
• quat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et do