Pràctica 3. Electroforesi de proteïnes en gels de poliacrilamida (SDS-PAGE)

1. Funció del SDS i del β-mercaptoetanol

Descriviu quina funció específica tenen tant el dodecilsulfat de sodi (SDS) com el $\beta$-mercaptoetanol en el mètode d'electroforesi de proteïnes SDS-PAGE.

a)

b)

2. Components del tampó de càrrega i tractament tèrmic

a)

Per quina raó s'incorpora glicerol o sacarosa al tampó de càrrega ( loading buffer)?

b)

Per què cal escalfar les mostres proteiques a temperatures superiors a 90 °C un cop afegit aquest tampó?

c)

Quina conseqüència tindria escalfar la mostra abans d'incorporar-hi el tampó de càrrega?

3. Ordre d'addició dels reactius en la polimerització del gel

En sintetitzar els gels d'acrilamida per a SDS-PAGE, és fonamental respectar una seqüència determinada en l'addició dels reactius. Raoneu el motiu pel qual certs components han d'afegir-se en darrer lloc.

4. Direcció de migració electroforètica

Indiqueu cap a quin elèctrode migren els polipèptids durant una SDS-PAGE i justifiqueu breument la resposta basant-vos en el tractament de la mostra.

a)

b)

5 Migració en suport no restrictiu

Suposeu que, després d'incorporar el tampó de càrrega a les mostres i sotmetre-les a ebullició, es fes córrer l'electroforesi en un suport no restrictiu (sense efecte tamís molecular). A quina velocitat migrarien les proteïnes? Considereu quatre categories: molt petites (~10 kDa), petites (20-30 kDa), grans (50-70 kDa) i molt grans (>110 kDa).

6 Marcadors de pes molecular

Definiu què és un marcador o patró de pes molecular en electroforesi de proteïnes i expliqueu la seva utilitat.

7 Percentatge d'acrilamida en el gel

En funció de quin criteri experimental es modifica el percentatge total d'acrilamida a l'hora de preparar un gel de SDS-PAGE?

8 Comparació electroforètica de tipus de llet

Si se sotmeten a electroforesi mostres de llet sencera (carril 1), llet semidesnatada (carril 2) i beguda de soja (carril 3), quines semblances o diferències s'espera trobar en cadascun dels carrils? Raoneu la resposta tenint en compte la seva composició.

9. Càlcul de la mobilitat relativa (Rf)

Expliqueu com es calcula la mobilitat relativa ($R_f$) d'una banda proteica en un gel de SDS-PAGE i com es determinen les mesures necessàries a partir del registre gràfic del gel.

10. Anàlisi d'un complex dimèric mitjançant SDS-PAGE

Es disposa d'un complex proteic constituït per dos monòmers (representats en verd i morat a l'estructura), cadascun amb un pes molecular de 15 kDa, units per ponts disulfur.

Per comprovar la seva integritat s'analitza en un gel SDS-PAGE carregant la proteïna en presència de $\beta$-mercaptoetanol (carril 1) i en un tampó que no conté aquest agent reductor (carril 2).

a)

Esquematitzeu les bandes esperades en cadascun dels dos carrils respecte a un patró de masses moleculars.

b)