Biomolècules 2n parcial: hemoglobina, enzims i glúcids

Proteïnes transportadores d'oxigen — Mioglobina i fixació de l'oxigen

La vida dels organismes aerobis superiors requereix un subministrament constant d'oxigen per sostenir la fosforilació oxidativa i la producció d'ATP. Tanmateix, l'oxigen molecular ($\text{O}_2$) és una molècula apolar extremadament insoluble en dissolucions aquoses com el citoplasma o el plasma sanguini (aproximadament $0{,}2\text{ mM}$ en equilibri amb l'aire). Aquesta baixa solubilitat, sumada a la ineficiència de la difusió passiva a través de distàncies superiors a uns pocs mil·límetres, fa inviable la distribució d'oxigen en organismes pluricel·lulars sense sistemes especialitzats d'emmagatzematge i transport.

Per resoldre aquesta limitació biològica, els éssers vius han desenvolupat proteïnes globulars basades en metalloproteïnes. Cap cadena polipeptídica estàndard no conté cadenes laterals d'aminoàcids capaces de coordinar reversiblement l'oxigen molecular per si mateixes. Aquesta funció recau en metalls de transició com el ferro, capaç d'adoptar diversos estats d'oxidació i d'establir enllaços coordinats resistents però reversibles amb molècules gasoses.

El grup prostètic hemo i la coordinació del ferro

L'ió de ferro lliure en dissolució aquosa no és funcionalment útil per al transport de gasos: quan el ferro ferrós ($\text{Fe}^{2+}$) reacciona de manera no controlada amb l'oxigen, s'oxida ràpidament a ferro fèrric ($\text{Fe}^{3+}$), generant espècies reactives d'oxigen com el radical hidroxil ($\text{OH}^\bullet$) que degraden greument lípids, proteïnes i àcids nucleics. A més, el ferro fèrric és incapaç d'unir reversiblement l'$\text{O}_2$.

L'anell de protoporfirina està constituït per quatre anells pirròlics units per ponts metínics. Els quatre àtoms de nitrogen d'aquests anells actuen com a donadors de densitat electrònica al ferro, estabilitzant el seu estat d'oxidació $\text{Fe}^{2+}$ i evitant-ne l'oxidació irreversible. L'ió $\text{Fe}^{2+}$ té sis posicions de coordinació en una geometria octaèdrica:

• Posicions 1 a 4: ocupades pels quatre nitrògens del pla de la protoporfirina IX.
• Cinquena posició de coordinació: ocupada pel nitrogen de l'anell imidazòlic de la histidina proximal (His F8 o residu 93 a la mioglobina), situada per sota del pla de l'hemo.
• Sisena posició de coordinació: situada a l'altre costat del pla de l'anell, queda lliure per a la fixació reversible de la molècula d'$\text{O}_2$.

Entorn proteic: mioglobina i el paper de la histidina distal

La mioglobina és una proteïna monomèrica d'uns 16,7 kDa constituïda per una única cadena de 153 aminoàcids plegada en vuit hèlixs alfa (anomenades de l'A a l'H). La seva localització fisiològica principal és el citoplasma de les cèl·lules musculars esquelètiques i cardíaques, sent especialment abundant en mamífers marins (com balenes o foques), els quals requereixen emmagatzemar grans reserves d'oxigen durant immersions prolongades. El grup hemo queda profundament encastat en una cavitat hidrofòbica entre les hèlixs E i F, protegint el ferro de l'aigua i evitant la formació de derivats fèrrics inactius.

Aquesta cavitat proteica exerceix una regulació essencial sobre la selectivitat molecular. El grup hemo lliure en dissolució uneix monòxid de carboni (CO) amb una afinitat aproximadament 20.000 vegades superior a la de l'$\text{O}_2$. Aquesta diferència tan acusada suposaria una asfíxia química immediata en condicions cel·lulars habituals, ja que el metabolisme endogen produeix petites quantitats de CO per la degradació del grup hemo mateix. No obstant això, en el si de la mioglobina, l'afinitat relativa del CO respecte a l'$\text{O}_2$ es redueix unes dues ordres de magnitud (a només unes 200 vegades superior).

El fonament químic i estructural d'aquesta discriminació rau en la geometria de coordinació i en la presència de la histidina distal (His E7 o residu 64):

• Unió del monòxid de carboni: en estat lliure, el CO coordina al ferro formant un enllaç estrictament lineal ($\text{Fe}-\text{C}\text{---}\text{O}$ a $180^\circ$). A la cavitat de la mioglobina, la presència de la histidina distal His E7 imposa un impediment estèric que força el CO a adoptar una orientació desviada o corbada, fet que desestabilitza la interacció i en disminueix l'afinitat.
• Unió de l'oxigen molecular: l'$\text{O}_2$ uneix al ferro amb una configuració nativa angulada (angle $\text{Fe}-\text{O}-\text{O} \text{ d'uns } 120^\circ$). Aquesta inclinació permet la formació d'un pont d'hidrogen addicional entre l'hidrogen del nitrogen imidazòlic de la histidina distal (His E7) i el segon àtom d'oxigen, estabilitzant selectivament el complex oxigenat.

Descripció quantitativa de la unió al lligand i deducció matemàtica

La interacció reversible entre una proteïna monomèrica (P) amb un únic lloc de fixació i el seu lligand (L) es descriu mitjançant l'equilibri químic bàsic:

Les velocitats d'associació i de dissociació determinen dues constants d'equilibri inverses: la constant d'associació ($K_a$) i la constant de dissociació ($K_d$), definida com:

A la pràctica bioquímica, es fa servir sistemàticament la $K_d$ per expressar l'afinitat; com menor és el valor de $K_d$, més forta és l'afinitat entre la proteïna i el seu lligand, ja que es requereix una concentració inferior de lligand lliure per formar el complex.

Per avaluar l'estat d'ocupació dels centres d'unió de la mostra proteica es defineix la saturació fraccionària ($\theta$), que representa la fracció de llocs totals de fixació que contenen lligand unit:

Aïllant la concentració de proteïna lliure a partir de la definició de $K_d$ obtenim $[\text{P}] = \frac{K_d [\text{PL}]}{[\text{L}]}$. Substituint aquesta expressió en l'equació de $\theta$:

Quan el lligand és un gas en dissolució aquosa, la concentració de gas dissolt és directament proporcional a la seva pressió parcial segons la llei d'Henry ($[\text{O}_2] = \text{k}_\text{H} \times p\text{O}_2$). Per tant, en el cas de la mioglobina i l'oxigen, l'equació s'expressa en unitats de pressió parcial ($p\text{O}_2$), expressada habitualment en kilopascals (kPa) o en mil·límetres de mercuri (mmHg):

on la constant $P_{50}$ representa la pressió de semisaturació, equivalent operatiu de la $K_d$ per a sistemes gasosos.

Corba de fixació de la mioglobina i funció biològica

La representació gràfica de $\theta$ en funció de $p\text{O}_2$ produeix una hipèrbola rectangular, característica fonamental de les interaccions lligand-proteïna no cooperatives amb un únic centre actiu actuant de manera independent.

Com es pot observar en les dades, la mioglobina té una afinitat molt elevada per l'$\text{O}_2$ ($P_{50} \text{ de només } 0{,}25\text{ kPa}$). Tant a les pressions dels pulmons ($13\text{ kPa}$) com a les pressions mitjanes dels teixits en repòs ($4\text{ kPa}$), la mioglobina roman pràcticament saturada ($\theta > 0{,}94$). Això implica que una proteïna amb cinètica hiperbòlica i afinitat tan alta no pot actuar com a transportador circulatori d'oxigen, ja que si carregués l'oxigen als pulmons, no seria capaç de descarregar-lo de forma eficient als capil·lars tissulars.

La funció fisiològica de la mioglobina és, per tant, l'emmagatzematge intracel·lular d'oxigen als músculs: conserva la molècula fixada i només la cedeix quan la pressió cel·lular de $\text{O}_2$ descendeix per sota de valors crítics fruit d'un esforç muscular exhaustiu. La necessitat d'una càrrega eficient als pulmons acoblada a una descàrrega sensible als teixits requereix una proteïna amb afinitat regulable i resposta al·lostèrica cooperativa: l'hemoglobina (vegeu «Proteïnes transportadores d'oxigen — Hemoglobina, cooperativitat i regulació al·lostèrica»).

Idees clau

• L'oxigen és molt insoluble en aigua, exigint proteïnes especialitzades dotades de grups hemo amb ferro en estat ferrós ($\text{Fe}^{2+}$) per fixar-lo reversiblement.
• El ferro lliure s'oxida irreversiblement a $\text{Fe}^{3+}$ generant radicals tòxics; la cavitat proteica de la mioglobina impedeix aquesta oxidació.
• L'ió de ferro estableix sis enllaços de coordinació: quatre amb nitrògens de la protoporfirina IX, un amb la histidina proximal (His F8) i el darrer amb l'$\text{O}_2$.
• La histidina distal (His E7) disminueix l'afinitat envers el monòxid de carboni mitjançant impediment estèric i estabilitza l'$\text{O}_2$ per pont d'hidrogen.
• La corba d'unió de la mioglobina és hiperbòlica, definida per una $P_{50}$ de només $0{,}25\text{ kPa}$, convertint-la en un magatzem muscular d'oxigen i no pas en un transportador.

Posa a prova el que has après

1. Quin àtom o grup ocupa la cinquena posició de coordinació de l'ió ferro a la mioglobina? — La histidina proximal His F8
2. Com influeix una disminució de la constant de dissociació (Kd) en l'afinitat d'una proteïna pel seu lligand? — Indica una afinitat més elevada
3. Per què la mioglobina no pot actuar com a transportador circulatori d'oxigen? — Perquè no allibera oxigen a pressions tissulars
4. Quina forma geomètrica presenta la corba de saturació d'oxigen de la mioglobina? — Hipèrbola rectangular

Proteïnes transportadores d'oxigen — Hemoglobina, cooperativitat i regulació al·lostèrica

Mentre que la mioglobina funciona com un magatzem muscular d'alta afinitat (vegeu «Proteïnes transportadores d'oxigen — Mioglobina i fixació de l'oxigen»), el transport sanguini d'oxigen des dels pulmons fins als teixits perifèrics requereix una molècula capaç de carregar-se eficaçment a pressions altes i descarregar-se allà on el metabolisme ho exigeix. Aquesta tasca la duu a terme l'hemoglobina, una proteïna al·lostèrica paradigmàtica dotada d'una resposta cooperativa modulable pel microambient químic.

Secció completa amb Premium

Idees clau

• na aliqua ut enim ad minim veniam quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet consectetur a
• s nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua ut enim ad minim veniam quis
• s nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua ut enim ad minim ve
• quat lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua ut enim ad minim v
• ctetur adipiscing elit sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua ut enim ad minim veniam quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea
• tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua ut enim ad minim veniam quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat lorem ipsum dolor sit amet conse

Enzims — Naturalesa, classificació i mecanismes de catàlisi

Després d'estudiar proteïnes que uneixen lligands sense transformar-los, com la mioglobina i l'hemoglobina, passem a les que catalitzen reaccions químiques. Els biocatalitzadors o enzims són macromolècules que incrementen la velocitat de les reaccions químiques en els éssers vius entre $10^5$ i $10^{17}$ vegades sense consumir-se en el procés ni alterar l'equilibri de reacció. A diferència dels catalitzadors inorgànics, operen en condicions fisiològiques suaus de temperatura, pressió i pH, i presenten una extraordinària especificitat química i estereoespecificitat pel seu substrat.

1. Naturalesa molecular i components dels enzims

Amb l'excepció d'algunes molècules d'àcid ribonucleic dotades d'activitat catalítica (els ribozims), la immensa majoria dels enzims són proteïnes globulars. La seva gran mida respecte a la dels substrats permet plegar una arquitectura tridimensional precisa que genera el centre actiu: una cavitat o esquerda delimitada per cadenes laterals d'aminoàcids on s'orienten els reactius i tenen lloc els esdeveniments químics.

2. Classificació internacional dels enzims (Comissió Enzimàtica, EC)

Per evitar les ambigüitats dels noms històrics no sistemàtics (com ara pepsina, del grec pepsis, digestió; o tripsina, de tryein, desgastar) i dels noms formats simplement afegint el sufix -asa al substrat (com ureasa o DNA-polimerasa), la International Union of Biochemistry and Molecular Biology va establir un codi numèric de quatre dígits encapçalat per les sigles EC (Enzyme Commission).

3. Termodinàmica i perfil energètic de la reacció enzimàtica

Perquè qualsevol transformació química tingui lloc, els reactius han de superar una barrera energètica denominada energia d'activació ($\Delta G^\ddagger$). Aquesta magnitud representa la diferència d'energia lliure entre l'estat fonamental dels reactius i l'estat de transició ($\ddagger$).

L'estat de transició no és una espècie química estable ni un intermediari: és una configuració atòmica transitòria i inestable, d'energia lliure màxima, en la qual els enllaços antics es troben parcialment trencats i els nous parcialment formats. Té una vida mitjana d'aproximadament un període de vibració molecular ($\sim 10^{-14} - 10^{-13} \text{ s}$, l'ordre dels femtosegons), fet que impedeix el seu aïllament físic o mesura directa en equilibri.

La relació entre la velocitat i la barrera d'activació prové de la teoria de l'estat de transició:

Com que la constant de velocitat $k$ depèn exponencialment de $-\Delta G^\ddagger$, una reducció modesta en la barrera d'activació produeix un augment de diversos ordres de magnitud en la velocitat de reacció $V = k [\text{S}]$. En canvi, l'equilibri químic ve regit exclusivament per la diferència termodinàmica entre productes i reactius:

4. Energia de fixació i models d'interacció enzim-substrat

Com aconsegueix l'enzim rebaixar aquesta barrera d'activació? La resposta rau en l'energia de fixació ($\Delta G_B$), que és l'energia lliure derivada de les interaccions no covalents febles (enllaços d'hidrogen, atraccions iòniques i efecte hidrofòbic) que s'estableixen específicament entre l'enzim i el substrat.

Històricament, Emil Fischer va proposar el model de clau-pany (1894), postulant una complementarietat geomètrica rígida entre el substrat i el centre actiu. Ara bé, si un enzim fos perfectament complementari al substrat en el seu estat fonamental, formaria un complex ES excessivament estable («pou d'estabilitat energètica»), de manera que la barrera per assolir l'estat de transició continuaria sent enorme i la reacció s'alentiria.

L'any 1946, Linus Pauling va establir el principi fonamental de la biocatàlisi: el centre actiu és complementari a l'estat de transició, no pas al substrat en el seu estat fonamental. En unir-se, l'enzim estableix el nombre òptim d'interaccions no covalents precisament quan el substrat assoleix la geometria de transició, alliberant l'energia de fixació ($\Delta G_B$) necessària per contrarestar l'elevada energia del procés.

Posteriorment, Daniel Koshland (1958) va introduir el model d'ajust induït (induced fit). Segons aquest model, el centre actiu no és una plantilla rígida preformada; la unió inicial del substrat indueix canvis conformacionals en la proteïna que alineen correctament els grups catalítics i maximitzen les interaccions febles necessàries per estabilitzar l'estat de transició.

5. Mecanismes generals de catàlisi

A escala química, els enzims combinen diverses estratègies catalítiques en el seu centre actiu:

• Catàlisi àcid-base general: Transferència de protons mediada per cadenes laterals d'aminoàcids ionitzables que actuen com a donadors o acceptors d'àcids o bases febles, evitant la dependència exclusiva dels ions hidroni o hidròxid de la solució.
• Catàlisi covalent: Formació transitòria d'un enllaç covalent entre un residu nucleòfil de l'enzim i el substrat, generant un intermediari reactiu que es trenca en un pas posterior per regenerar l'enzim lliure.
• Catàlisi per ions metàl·lics: Ús de cations metàl·lics units per orientar substrats, estabilitzar càrregues negatives acumulades en l'estat de transició o participar en processos d'òxid-reducció transitòria.

6. Mecanisme catalític de la quimiotripsina

La quimiotripsina és una serina proteasa pancreàtica (classe EC 3, hidrolasa) que catalitza la hidròlisi d'enllaços peptídics a la banda C-terminal de residus amb cadenes laterals hidrofòbiques voluminoses, preferentment aromàtiques (fenilalanina, tirosina i triptòfan).

L'acció concertada de la quimiotripsina depèn de dues estructures clau del seu centre actiu:

1. Bossa hidrofòbica de fixació: Cavitat apolar on s'allotja la cadena aromàtica del polipèptid, posicionant l'enllaç peptídic adjacent exactament enfront dels residus catalítics.
2. Tríada catalítica: Complex cooperatiu format pels residus $\text{Ser}^{195}$, $\text{His}^{57}$ i $\text{Asp}^{102}$.

En aquesta tríada, l'ió carboxilat de l'$\text{Asp}^{102}$ polaritza l'anell imidazòlic de la $\text{His}^{57}$ mitjançant un enllaç d'hidrogen. Això converteix la $\text{His}^{57}$ en una base molt potent capaç de sostreure el protó del grup hidroxil de la $\text{Ser}^{195}$, generant un ió alcòxid fortament nucleòfil.

El cicle catalític transcorre en dues etapes principals (acilació i desacilació) que es divideixen en set passos consecutius:

1. Unió del substrat: El substrat s'uneix al centre actiu inserint la seva cadena aromàtica a la bossa hidrofòbica, fet que alinea el carboni carbonílic de l'enllaç peptídic susceptible.
2. Atac nucleòfil (inici de l'acilació): La $\text{His}^{57}$ actua com a base general acceptant el protó de la $\text{Ser}^{195}$. L'oxigen nucleòfil resultant ataca el carboni carbonílic de l'enllaç peptídic, formant el primer intermediari tetraèdric. La càrrega negativa que es desenvolupa sobre l'oxigen del carbonil queda estabilitzada per enllaços d'hidrogen amb els grups $-\text{NH}-$ del pont de la cadena polipeptídica (residus $\text{Gly}^{193}$ i $\text{Ser}^{195}$) en una regió denominada forat de l'oxianió.
3. Ruptura de l'enllaç peptídic (col·lapse tetraèdric): L'intermediari tetraèdric s'ensorra; el doble enllaç $\text{C}=\text{O}$ es reforma i la $\text{His}^{57}$ cedeix un protó com a àcid general al grup amino que marxa. S'allibera el primer producte (l'extrem C-terminal de la cadena trencada, producte 1) i es manté unit a l'enzim un intermediari covalent acil-enzim.
4. Entrada i activació de l'aigua: Una molècula d'aigua penetra en el centre actiu i la $\text{His}^{57}$, actuant novament com a base general, li sostreu un protó generant un ió hidròxid fortament nucleòfil.
5. Atac nucleòfil de l'aigua (desacilació): L'hidròxid ataca el carboni del grup acil de l'intermediari covalent, originant el segon intermediari tetraèdric, el qual torna a ser estabilitzat pel forat de l'oxianió.
6. Col·lapse del segon intermediari: El carbonil es restableix expulsant l'oxigen de la $\text{Ser}^{195}$, mentre la $\text{His}^{57}$ protona la serina actuant com a àcid general. Es genera així el segon producte (un grup carboxilat lliure).
7. Alliberament del producte i regeneració: El producte carboxílic (producte 2) es dissocia del centre actiu, restaurant la conformació de l'enzim lliure per a un nou cicle.

Idees clau

• Els enzims acceleren les reaccions rebaixant l'energia d'activació ($\Delta G^\ddagger$) sense modificar l'equilibri de reacció ($K'_{\text{eq}}$) ni la variació d'energia lliure ($\Delta G^{\prime \circ}$).
• La Comissió Enzimàtica divideix els catalitzadors biològics en sis classes principals (EC 1 a EC 6) segons el tipus de reacció química efectuada.
• L'estat de transició és una configuració fugaç i inestable de màxima energia que no pot ser aïllada físicament.
• El poder catalític i l'especificitat enzimàtica depenen de la complementarietat a l'estat de transició sostinguda per l'energia de fixació ($\Delta G_B$) de les interaccions febles.
• La quimiotripsina combina catàlisi covalent i àcid-base general mitjançant una tríada catalítica ($\text{Ser}^{195}$, $\text{His}^{57}$, $\text{Asp}^{102}$) i estabilitza els intermediaris tetraèdrics al forat de l'oxianió.

Posa a prova el que has après

1. Quina magnitud termodinàmica modifiquen directament els enzims durant la catàlisi? — L'energia d'activació
2. A quina classe de la classificació internacional pertany una hexoquinasa (EC 2.7.1.1)? — Transferases
3. Com s'anomena la fracció estrictament polipeptídica d'un enzim sense el seu cofactor? — Apoenzim
4. Quin residu de la quimiotripsina actua com a nucleòfil directe en la formació de l'acil-enzim? — Serina 195