Col·lecció de problemes resolts de Biologia Cel·lular

1. Problema 5 (2019-2020). Destinació i adreçament de proteïnes modificades

Prediu la ruta de trànsit intracel·lular, el processament i el destí final que patirà cadascuna de les següents proteïnes si se'ls afegeix o elimina mitjançant enginyeria genètica la seqüència indicada:

a.

Importina a la qual s'afegeix una seqüència senyal d'importació al reticle endoplasmàtic.

b.

Subunitat de l'ATP sintasa a la qual s'afegeix una seqüència senyal de retenció al reticle endoplasmàtic.

c.

Proteïna de processament de la matriu mitocondrial (MPP) a la qual s'afegeix una seqüència senyal d'importació al reticle a l'extrem N-terminal.

d.

Subunitat del proteasoma a la qual s'afegeix un senyal de manosa-6-fosfat (M6P).

e.

Xaperona BiP a la qual s'elimina un fragment del seu extrem N-terminal.

f.

Subunitat de la bomba de $\text{Na}^+/\text{K}^+$ a la qual s'incorpora un senyal de localització nuclear (NLS) a l'extrem C-terminal.

g.

Proteïna citosòlica a la qual s'afegeix una seqüència de direccionament a l'estroma del cloroplast.

h.

Làmina nuclear a la qual s'afegeix un senyal d'adreçament peroxisomal tipus 2 (PTS2).

Problema 6 (2019-2020). Mecanisme d'importació peroxisomal per Pex5

Per tal d'esbrinar com actua el receptor d'importació citosòlic Pex5 durant l'entrada de proteïnes que presenten senyal PTS1 cap a la matriu del peroxisoma, es plantegen tres hipòtesis o models de funcionament:

Model 1: Pex5 lliura la càrrega proteica a la cara externa de la membrana peroxisomal i roman indefinidament al citosol.

Model 2: Pex5 s'introdueix íntegrament a l'interior del peroxisoma al costat de la proteïna i no retorna mai al citoplasma.

Model 3: Pex5 realitza un transport cíclic ( vaivé o shuttling) entrant al peroxisoma per descarregar el substrat i tornant després al citosol.

Per distingir entre aquests models s'usa una construcció de Pex5 modificada amb un marcador FLAG protegit per un fragment N-terminal que s'escindeix selectivament a la matriu mitjançant una proteasa específica, i es fan servir dos anticossos:

mAb1: Reconeix exclusivament el tag FLAG quan l'extrem N-terminal ha estat tallat.

mAb2: Reconeix una regió conservada de Pex5, tant si té o no l'extrem N-terminal intacte.

Respon als apartats següents:

a)

Justifica teòricament quins resultats d'immunodetecció (presència de senyal amb mAb1 i mAb2 a les fraccions citosòlica, de matriu peroxisomal i a l'extracte total) s'esperarien sota cadascun dels tres models d'acció.

b)

Tenint en compte que a nivell experimental s'obté senyal amb mAb1 tant a la matriu peroxisomal com a la fracció citosòlica, quin dels tres models és compatible amb aquestes observacions?

c)

A quin altre sistema de transport cel·lular entre compartiments s'assembla aquesta dinàmica de Pex5 i quines analogies funcionals comparteixen?

3. Problema 7 (2019-2020). Desestructuració i fosforilació de làmines nuclears

En un estudi sobre la regulació de la làmina nuclear al llarg del cicle cel·lular, s'analitzen mostres de cèl·lules obtingudes durant la interfase i durant la mitosi mitjançant electroforesi bidimensional (focalització isoelèctrica en primer eix i SDS-PAGE en segon eix), en absència o en presència d'un tractament previ amb fosfatasa alcalina. Les proteïnes han estat marcades metabòlicament amb $^{35}\text{S}$-metionina.

a)

Per quina raó el tractament amb fosfatasa alcalina redueix a un màxim de 3 les taques o bandes corresponents a les làmines, independentment del nombre inicial observat sense tractar?

b)

Determina quants grups fosfat tenen incorporats les làmines A, B i C durant la interfase i explica la manera de deduir-ho a partir del patró electroforètic.

c)

Quants fosfats presenten les làmines A, B i C durant la mitosi? Com s'arriba a aquesta conclusió?

d)

Quina és la raó d'utilitzar $^{35}\text{S}$-metionina en comptes de $^{32}\text{P}$-ortofosfat per al marcatge? Què s'hauria observat si s'hagués marcat amb $^{32}\text{P}$?

e)

Es pot concloure formalment amb aquest únic assaig que la desorganització de la làmina nuclear en mitosi està causada exclusivament per la fosforilació reversible? Raona la resposta.

Problema 8 (2019-2020). Càlcul de la durada del cicle cel·lular

Es disposa de dades proliferatives provinents de dos teixits o cultius murins independents:

a)

En mostres histològiques de fetge de ratolí adult s'observen 3 cèl·lules en mitosi d'un total de 25000 cèl·lules comptades al microscopi. Sabent que la durada mitjana de la mitosi en aquests hepatòcits és de 30 minuts, calcula la durada total del cicle cel·lular complet i el temps que passen en interfase.

b)

En un cultiu asincrònic de cèl·lules L de ratolí es monitoritza el creixement del nombre total de cèl·lules en el temps. S'obtenen els valors següents: a les 10 hores de cultiu hi ha $3 \times 10^5$ cèl·lules, mentre que a les 30 hores s'arriba a $6 \times 10^5$ cèl·lules. Determina la durada del cicle cel·lular (temps de duplicació) d'aquesta línia.

Problema 1 (2020-2021). Fluïdesa i adaptació tèrmica de membranes bacterianes

S'estudia la fluïdesa de membrana mitjançant mesures de fluorescència d'anisotropia en dues soques o cultius de bacteris aïllats en diferents condicions ambientals:

a)

Si es mesura l'anisotropia a diferents temperatures per a bacteris cultivats habitualment a 37 °C i bacteris cultivats a 22 °C, a quina població bacteriana correspon la corba A i a quina la corba B si la corba B presenta valors superiors d'anisotropia (major rigidesa) a 37 °C?

b)

Quins canvis en la composició de lípids esperaríeu trobar a les membranes dels bacteris aïllats a 37 °C respecte als de 22 °C per contrarestar l'efecte directe de la temperatura?

c)

Si els bacteris que creixen de manera òptima a 22 °C es traslladen sobtadament a un medi a 37 °C, consideres que haurien d'alterar la seva composició lipídica per sobreviure?

d)

Comenteu l'estat fisiològic i la necessitat d'adaptació en cas contrari (bacteris adaptats a 37 °C que passen a 22 °C amb una anisotropia propera a 0,2).

Problema 2 (2020-2021). Caracterització de proteïnes de la membrana eritrocitària

Mitjançant tècniques de separació de fases amb detergents (triton X-114), electroforesi SDS-PAGE i tinció de glúcids amb lectines específiques per a galactosa, s'analitzen les proteïnes de la membrana del glòbul vermell humà, obtenint-se les fraccions 1, 2, 3, 4.1, 4.2, 5, 6 i 7.

a)

Determina quines d'aquestes bandes corresponen a proteïnes integrals de membrana i quines a proteïnes perifèriques, justificant el comportament hidròfil o hidròfob en presència de detergents.

b)

Quines d'aquestes proteïnes són glicoproteïnes?

c)

A quina cara de la membrana (monocapa citosòlica o monocapa extracel·lular) esperaries trobar localitzades les proteïnes 1, 4.1 i 6?

d)

On estan situades les proteïnes 2 i 4.2 tenint en compte les seves propietats de tinció?

7. Problema 3 (2020-2021). Transport i exportació nuclear de diferents ARN

S'injecta una mescla purificada de diferents espècies d'ARN (mRNA, snRNA U1, snRNA U5, snRNA U6 i tRNA) al nucli d'oòcits de Xenopus. Mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida s'avalua la distribució de cada ARN en tres carrils: total de l'oòcit (T), citoplasma (C) i nucli (N), analitzant la situació a temps 0, al cap de 3 hores en condicions control i al cap de 3 hores en presència de 100 nM de leptomicina B.

a.

Com s'interpreta la separació electroforètica de les 5 bandes de menor a major mobilitat en el gel?

b.

S'ha produït un dany mecànic a l'embolcall nuclear durant la microinjecció inicial? Com ho demostra l'electroforesi a temps 0?

c.

Quines espècies d'ARN han estat exportades eficaçment cap al citoplasma a les 3 hores en absència de l'inhibidor?

d.

Com afecta l'addició de 100 nM de leptomicina B a l'exportació de cadascun dels ARN?

e.

Quin mecanisme d'acció de la leptomicina B permet explicar aquests resultats?

Problema 4 (2020-2021). Topologia i inserció cotraductora de proteïnes transmembrana

A partir dels esquemes següents que representen les seqüències d'ancoratge inicial (SA) i de parada de transferència (STA), i tenint en compte la regla de les càrregues positives (que se situen preferentment a la cara citosòlica), determina la topologia resultant i el tipus de proteïna de membrana en cadascun dels casos:

a)

Proteïna representada a: seqüència senyal clivable a l'extrem N-terminal (senyal d'inici ST) seguida d'un segment transmembrana STA. Com queda orientada?

b)

Proteïna multipàs amb 3 segments transmembrana mostrada a (SA, SA, STA), amb càrregues positives a la cara citoplasmàtica del primer i segon segment. Quin tipus de proteïna és?

c)

Proteïna monopàs representada a, amb un segment d'ancoratge intern SA que conté càrregues positives flanquejant el costat N-terminal.

d)

Proteïna amb quatre segments transmembrana (SA, STA, SA, STA) segons l'esquema:

e)

Proteïna multipàs amb 5 dominis transmembrana esquematitzada a:

f)

Proteïna monopàs mostrada a, on les càrregues positives del segment intern SA es troben al costat C-terminal:

g)

Si la proteïna de l'apartat a) viatja fins a l'aparell de Golgi, cap a on queden orientats els extrems amino i carboxil?

h)

Si la proteïna de l'apartat b) viatja en vesícules fins a fusionar-se amb la membrana plasmàtica, quins dominis quedaran exposats al medi extracel·lular?

9. Problema 1 (2018). Cinètica de difusió d'etanol i acetat a través de bicapa

A la gràfica següent es comparen les taxes de transport o difusió a través d'una bicapa lipídica artificial per a dos compostos químics diferents (A i B) en funció de la seva concentració en el medi:

a.

Descriu el comportament cinètic que presenta cadascuna de les corbes de la gràfica.

b.

Identifica raonadament quin compost correspon a l'etanol i quin a l'acetat.

10. Problema 2 (2018). Fraccionament i glicosilació de proteïnes de membrana

En un experiment idèntic al del problema 2 (curs 2020-2021), s'analitza el patró electroforètic de membranes de glòbuls vermells sotmeses a partició amb detergent i a tinció específica per a sucres.

a.

A partir del patró electroforètic, quines bandes corresponen a proteïnes integrals i quines a perifèriques?

b.

Quines proteïnes presenten cadenes d'oligosacàrids segons la tinció específica?

c.

On estan localitzades les proteïnes 1, 4.1 i 6 i de quina informació addicional es disposa?

d.

On es disposen les proteïnes 2 i 4.2 respecte a la membrana cel·lular?

Problema 3 (2018). Difusió i asimetria lipídica analitzada per ESR

S'utilitzen anàlegs de fosfolípids amb marcatge d'espín mitjançant un radical nitròxid en diferents posicions de la molècula (Fosfolípid 1 amb el grup nitròxid al cap polar; Fosfolípid 2 amb el radical inserit a les cues d'àcids grassos hidrofòbiques). Es mesura la pèrdua de senyal de ressonància de spin electrònic (ESR) per reducció amb àcid ascòrbic (un agent reductor hidrosoluble que no pot travessar les bicapes lipídiques intactes):

a)

Per quina raó el fosfolípid 1 reacciona i perd el senyal ESR molt més ràpidament en presència d'àcid ascòrbic que el fosfolípid 2?

b)

Explica les diferències en la caiguda del senyal d'ESR quan s'utilitzen fantasmes d'eritròcits segellats ("ghost cells") en comparació amb eritròcits vius i intactes.

c)

Els fosfolípids marcats artificialment s'incorporen de manera equitativa a ambdues monocapes de la membrana eritrocitària?

Problema 4 (2018). Asimetria de fosfolípids i topologia de proteïnes a l'eritròcit

A partir d'assajos d'accessibilitat amb marcadors fluorescents impermeables a la membrana i digestions amb proteases aplicats a vesícules d'eritròcits normals ("right-side-out") i vesícules invertides ("inside-out vesicles", IOVs):

a)

Què es pot deduir sobre la distribució asimètrica de la fosfatidilserina a la membrana plasmàtica de l'eritròcit?

b)

Quina és la disposició i orientació de la proteïna Banda 3 a la membrana segons els resultats obtinguts?

c)

Què es pot concloure respecte a l'estructuració i dominis de la Glicoforina A?

Problema 1 (2021-2022). Acció de fosfolipases, proteases i neuraminidases sobre eritròcits

S'incuben glòbuls vermells en presència de tres enzims hidrolítics diferents: fosfolipasa C, tripsina (una proteasa) i neuraminidasa.

a)

Indica quin enllaç químic trenca la fosfolipasa C sobre una molècula de fosfatidilcolina observant l'esquema de la imatge.

b)

Per quina raó l'acció de la fosfolipasa C indueix ràpidament l'hemòlisi (lisi dels eritròcits), mentre que el tractament amb tripsina o amb neuraminidasa no arriba a trencar la membrana ni provoca hemòlisi?

14 Problema 2 (2021-2022). Transport transepitelial de glucosa i gradients de sodi

En un model d'epiteli intestinal cultivat en monocapa polaritzada (amb domini apical orientat a la llum digestiva i domini basolateral en contacte amb el fluid extracel·lular), s'estudia el transport de glucosa marcada radioactivament sota diferents condicions:

a)

Analitza el transport de glucosa des del domini apical fins al basolateral en tres situacions: quan les concentracions de $\text{Na}^+$ són idèntiques a ambdós dominis (tractament 1), quan el $\text{Na}^+$ apical és inferior al basolateral (tractament 2) i quan el $\text{Na}^+$ basolateral és reduït respecte al de referència mantenint alt el $\text{Na}^+$ apical (tractament 3).

b)

Quin serà l'efecte sobre el transport de glucosa si s'afegeix l'inhibidor ouabaïna exclusivament al medi apical (tractament 4) en comparació d'afegir-lo al medi basolateral (tractament 5)?

15. Problema 3 (2021-2022). Adhesió cel·lular, cadherines i desagregació per tripsina/EDTA

En el manteniment i subcultiu de línies cel·lulars animals adherents a plaques de cultiu de plàstic o vidre:

a)

Quin tipus de complexos moleculars i proteïnes medien les unions de les cèl·lules entre elles i amb la matriu extracel·lular o el substrat? Per què s'utilitza una barreja de tripsina i EDTA per separar-les?

b)

Quins efectes nocius podria tenir una incubació excessivament perllongada amb tripsina?

c)

Què ocorreria si s'intenta fer un subcultiu sense deixar actuar prou temps la tripsina i l'EDTA?

d)

Si es volguessin aïllar i separar cèl·lules procedents d'un teixit vegetal (amb paret cel·lular de cel·lulosa i pectina), quins enzims específics caldria utilitzar en lloc de proteases animals?