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UD2: Los ácidos nucleicos Biosíntesis de macromoléculas. 1 Replicación del DNA genómico Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 2 2 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 3 La replicación del material genético en células eucariotas tiene lugar durante la interfase, el período que se extiende entre dos divisiones celulares consecutivas. La interfase se subdivide en tres fases principales: G1 (gap 1), S (síntesis) y G2 (gap 2). Durante estas fases, hay una intensa actividad metabólica, con un enfoque particular en la fase S, donde ocurre la duplicación del DNA y otros componentes celulares esenciales, incluida la cromatina.
A medida que la célula avanza hacia el final de la fase G2, el volumen celular se ha duplicado casi por completo, lo que permite que la célula entre en la fase de división celular o mitosis. El ciclo celular y su regulación son de vital importancia para el mantenimiento de la homeostasis celular y se describen con mayor detalle en la Unidad Didáctica 8 (UD8). Una vez que el DNA se ha replicado, el nuevo material genético debe ser organizado y empaquetado de manera adecuada para asegurar la integridad estructural del genoma.
Esto implica un proceso coordinado entre la replicación del DNA y la síntesis de histonas, las cuales juegan un papel fundamental en el empaquetamiento del DNA en nucleosomas. Dado que el número de nucleosomas se duplica durante la fase S, la síntesis de histonas debe estar íntimamente ligada a la replicación. Aunque el empaquetamiento de la cromatina es alterado durante la replicación, estos cambios son localizados y transitorios, afectando solo a una pequeña fracción de los nucleosomas en cualquier momento dado. Además, el reensamblaje de la cromatina ocurre prácticamente de manera simultánea a la replicación del DNA, lo que asegura que la estructura de la cromatina se mantenga funcional.
Es esencial, además, preservar las modificaciones epigenéticas preexistentes, como las modificaciones químicas de las histonas y la metilación del DNA, que son cruciales para mantener la "memoria epigenética" de la célula, garantizando así que las regiones heterocromáticas y eucromáticas se mantengan en su estado funcional adecuado tras la replicación. El proceso de replicación del DNA se fundamenta en el principio de complementariedad de bases nitrogenadas, el cual fue postulado por Watson y Crick en su modelo de la doble hélice: "No se nos escapa que el emparejamiento específico que postulamos sugiere por sí mismo un posible mecanismo de copia para el material genético".
En esencia, las bases púricas (adenina y guanina) y las bases pirimídicas (citosina y timina) se emparejan de manera complementaria (A-T y C-G), lo que asegura que cada hebra actúe como molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria. La replicación del DNA es un proceso de gran relevancia biológica, dado que garantiza la transmisión fiel del 3 material genético entre generaciones celulares y organismos. Sin embargo, es esencial que ocurra con alta precisión para evitar errores que puedan comprometer la viabilidad celular o la integridad genética.
En el genoma humano, que consta de aproximadamente 3.000 millones de pares de bases en su estado haploide, una tasa de error de 1 entre un millón resultaría en aproximadamente 3.000 errores por ciclo replicativo, lo cual sería inaceptable desde un punto de vista biológico. No obstante, también se requiere una pequeña tolerancia a errores, ya que la introducción de mutaciones puede ser una fuente de variabilidad genética, lo que en última instancia alimenta los mecanismos evolutivos y la adaptación de las especies.
3 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 4 La replicación del DNA es semiconservativa En 1958 Mathew Meselson y Franklin Stahl propusieron el modelo de replicación semiconservativa en procariotas, que se comprobó que era universal y aplicable también a eucariotas. Este modelo llevó a desechar los modelos de replicación conservativa y dispersiva, y consistía básicamente en que, conforme la doble hélice se desenrollaba (como si fuera una cremallera), cada nucleótido a lo largo de las dos hebras tendría afinidad por su nucleótido complementario.
Si a lo largo de las dos hebras los nucleótidos se unieran covalentemente entre sí, el resultado sería la producción de dos dobles cadenas idénticas. Cada una de ellas estaría formada por una hebra vieja y otra de nueva síntesis. En el modelo conservativo la réplica sería semejante pero, al final, una de las dobles hélices estaría formada por la reasociación de las dos hebras viejas y la otra por la asociación de las dos hebras nuevas. El modelo dispersivo es más complicado y supondría que cada una de las hebras estaría formada por segmentos nuevos y viejos, lo que implicaría su corte en algunas de las etapas del proceso (Figura).
4 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 5 Generalidades del proceso de replicación - Etapas: Iniciación: regulación del hecho de que hace falta que se inicie el proceso. Reconocimiento del origen de replicación por parte de un complejo de proteínas. Síntesis del cebador y del primer fragmento de Okazaki. Elongación: las cadenas parentales de DNA se desenrollan y se sintetizan las cadenas hijas. Se requiere la participación de otros complejo de proteínas. Terminación: se necesitan reacción de unión y/o terminación. Menos conocida.
Etapas de la replicación del DNA 1.Iniciación La iniciación es la etapa en la que se establece el comienzo del proceso de replicación y es estrictamente regulada para asegurar que el DNA se duplique de manera correcta y en el momento adecuado del ciclo celular. La replicación se inicia en regiones específicas del genoma llamadas orígenes de replicación, que son reconocidas por un complejo multiproteico denominado complejo de reconocimiento del origen (ORC, Origin Recognition Complex). Este complejo recluta otras proteínas necesarias para la formación del complejo de pre-replicación (pre-RC), que prepara el DNA para la replicación.
Posteriormente, las helicasas desenrollan la doble hélice de DNA, creando las burbujas de replicación. Una vez expuestas las hebras parentales, la DNA primasa sintetiza un cebador de RNA que proporciona un extremo 3'-OH libre para que la DNA polimerasa comience la síntesis de la nueva hebra de DNA. En la hebra retardada, también se sintetiza el primer fragmento de Okazaki, iniciando así la replicación discontinua. 2.Elongación Durante la fase de elongación, las hebras parentales de DNA se desenrollan progresivamente gracias a la acción de las helicasas, y las topoisomerasas alivian la tensión generada por el superenrollamiento aguas arriba del punto de replicación.
La síntesis de las hebras hijas se lleva a cabo por las DNA polimerasas, que catalizan la adición de nucleótidos complementarios a las hebras molde parentales. En la hebra líder (leading strand), la replicación ocurre de manera continua en dirección 5' a 3'. En la hebra retardada (lagging strand), la replicación es discontinua y se forman los fragmentos de Okazaki, que posteriormente son unidos por la DNA ligasa.
Todo este proceso está coordinado por un complejo proteico llamado replisoma, que incluye proteínas accesorias como las proteínas de unión a DNA monocatenario (SSB, Single-Stranded Binding proteins), que estabilizan las hebras de DNA desenrolladas, y las pinzas deslizantes que aumentan la procesividad de las DNA polimerasas. 3.Terminación La fase de terminación se produce cuando las horquillas de replicación se encuentran o cuando se alcanza el final de los cromosomas, en los telómeros. En las células eucariotas, esta etapa es menos conocida en términos de regulación comparada con la iniciación y elongación.
En algunos casos, la terminación implica la disociación de las maquinarias de replicación y la resolución de las estructuras intermedias de DNA, como los 5 entrecruzamientos de las horquillas. En los cromosomas lineales, la enzima telomerasa es clave para replicar los extremos de los cromosomas, ya que sintetiza las secuencias teloméricas de novo para evitar la pérdida progresiva de información genética en cada ciclo replicativo. Además, la acción de la DNA ligasa es necesaria para sellar los enlaces fosfodiéster entre los fragmentos de Okazaki y completar la síntesis de la hebra retardada. Regulación de la replicación La replicación del DNA se regula estrictamente en la fase de iniciación.
Una vez que el proceso ha comenzado, continúa de manera procesiva hasta que se ha duplicado la totalidad del genoma. Esta regulación es crítica para asegurar que la replicación se inicie una sola vez por ciclo celular y en los momentos precisos del ciclo, evitando la replicación errónea o incompleta que podría comprometer la integridad genética. 5 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 6 ¿Por qué es así el mecanismo de la replicación?
Características del molde o Antiparalelo o Helicoidal Requerimientos de las DNApol o Dirección del enlace fosfodiéster 5' 3' o No es capaz de colocar el primer nt o Necesita un molde monocatenario El mecanismo de la replicación es una consecuencia de lo siguiente: 1. Las características del molde a) Antiparalelismo El antiparalelismo del DNA se refiere a la orientación opuesta de las dos hebras que componen la doble hélice. Cada hebra tiene una polaridad definida por los extremos de sus nucleótidos: un extremo 5' fosfato y un extremo 3' hidroxilo (-OH). En la doble hélice, una hebra está orientada en dirección 5' 3', mientras que la otra está en dirección 3' 5'.
Este antiparalelismo tiene consecuencias directas para el proceso de replicación, ya que las DNA polimerasas solo pueden sintetizar nuevas hebras en dirección 5' 3', obligando a que la replicación de una hebra (la hebra retardada) sea discontinua, formando fragmentos de Okazaki, mientras que la otra (la hebra líder) es sintetizada de manera continua. b) Estructura helicoidal La estructura helicoidal del DNA implica que las hebras están enrolladas en torno a un eje común, lo que genera ciertas dificultades mecánicas durante la replicación. Para que las DNA polimerasas puedan acceder a las hebras molde y llevar a cabo la síntesis de nuevas cadenas de DNA, la doble hélice debe ser desenrollada.
Este desenrollamiento es facilitado por la helicasa, que separa las hebras mediante la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias, creando una horquilla de replicación. La topoisomerasa ayuda a aliviar la tensión acumulada por el superenrollamiento del DNA durante este proceso. 2. Requerimientos de las DNA polimerasas a) Dirección de síntesis en el enlace fosfodiéster 5' 3' Las DNA polimerasas catalizan la formación de nuevos enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos de la nueva hebra de DNA. Sin embargo, estas enzimas solo pueden añadir nucleótidos en la dirección 5' 3'.
Este mecanismo está determinado por la naturaleza del enlace fosfodiéster, que requiere la presencia de un grupo hidroxilo (-OH) en el extremo 3' del nucleótido preexistente y un nucleótido trifosfato entrante. El grupo hidroxilo en el extremo 3' ataca al fosfato alfa del nucleótido trifosfato, liberando pirofosfato y formando el nuevo enlace fosfodiéster. b) Incapacidad para iniciar la síntesis (no pueden añadir el primer nucleótido) Una característica fundamental de las DNA polimerasas es que no son capaces de iniciar la síntesis de una nueva hebra de DNA por sí solas, ya que no pueden agregar el primer nucleótido de la cadena.
En lugar de 6 ello, requieren de un cebador (o primer), que es una corta secuencia de RNA (sintetizada por una primasa) con un extremo 3'-OH libre, desde el cual la DNA polimerasa puede comenzar la elongación. Esto es crucial para la replicación, ya que sin el cebador no habría un punto de anclaje para que la DNA polimerasa pueda añadir nucleótidos. c) Necesidad de un extremo 3'-OH para la elongación La elongación de la nueva hebra de DNA por parte de la DNA polimerasa requiere siempre la presencia de un extremo 3'-OH disponible, que actúa como un sitio de ataque nucleofílico para la incorporación del siguiente nucleótido.
En ausencia de este grupo, la DNA polimerasa no puede proceder con la adición de nucleótidos. Esta es la razón por la cual el cebador es esencial para iniciar la replicación. d) El DNA debe estar en forma monocatenaria Las DNA polimerasas no pueden trabajar sobre el DNA en su forma bicatenaria o de doble hélice. Para que la replicación tenga lugar, las dos hebras parentales deben separarse, lo que convierte al DNA en un molde monocatenario. Esto es realizado por la helicasa, que desenrolla la doble hélice y separa las hebras.
Las hebras de DNA monocatenario resultantes son estabilizadas por proteínas de unión a DNA monocatenario (SSB), que evitan que las hebras se vuelvan a emparejar o que formen estructuras secundarias como horquillas o bucles que podrían interferir con la replicación. 6 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 7 DNA polimerasa Actividad de la DNA polimerasa (DNApol) La actividad catalítica de las DNA polimerasas depende de la formación de enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos, lo que permite la elongación de la hebra de DNA en crecimiento.
El proceso comienza con el ataque nucleofílico del grupo hidroxilo (3'-OH) terminal de la hebra en crecimiento sobre el fosfato alfa del nucleótido trifosfato (dNTP) entrante. Como consecuencia de este ataque, se liberan los otros dos grupos fosfato en forma de pirofosfato (PPi), lo cual genera la energía necesaria para la formación del nuevo enlace fosfodiéster. Dado que la DNA polimerasa requiere un 3'-OH libre para iniciar este proceso, no puede comenzar la síntesis de novo y necesita un cebador (o "primer") con dicho grupo hidroxilo en su extremo.
Importancia del emparejamiento de bases El emparejamiento de bases en el DNA sigue reglas estrictas para asegurar la estabilidad de la doble hélice. Solo las bases complementarias, adenina (A) con timina (T), y citosina (C) con guanina (G), pueden formar los pares de bases de Watson y Crick adecuados, ya que solo estos emparejamientos generan el número correcto de puentes de hidrógeno y mantienen un espaciado constante entre las dos hebras de la doble hélice. Si se apareasen dos bases púricas o dos bases pirimidínicas, el diámetro de la hélice se vería alterado, comprometiendo la estabilidad estructural de la molécula.
Función de los cationes divalentes Los cationes divalentes, como el magnesio (Mg² ), son fundamentales para la actividad catalítica de las DNA polimerasas. Estos iones actúan como cofactores que facilitan el proceso de elongación al anclar el grupo hidroxilo (3'-OH) del cebador al fosfato alfa del nucleótido trifosfato entrante. Aunque los cationes no participan directamente en la catálisis, sirven como puentes entre el nucleótido en elongación y el nucleótido entrante, estabilizando la interacción y favoreciendo la reacción de ataque nucleofílico que forma el nuevo enlace fosfodiéster.
7 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 8 Fidelidad de la replicación La fidelidad del proceso replicativo es esencial para la estabilidad genética. Las DNA polimerasas, que son enzimas responsables de la incorporación de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) en la cadena de DNA en crecimiento, tienen una tasa basal de error de aproximadamente 1 nucleótido incorrecto por cada 1.000 nucleótidos incorporados. Sin embargo, muchas polimerasas poseen una actividad adicional de exonucleasa 3' 5', que les permite detectar y corregir nucleótidos mal apareados inmediatamente después de su incorporación.
Esta actividad exonucleasa desempeña un papel crítico en la corrección de pruebas o proofreading, y sin ella, la tasa de errores sería inaceptablemente alta para asegurar la transmisión precisa de la información genética. Con esta capacidad de corrección, la frecuencia de error se reduce drásticamente a 1 error por cada millón de nucleótidos incorporados, lo cual es crucial para la estabilidad del genoma en organismos complejos como el ser humano. La enzima tiene similitud con una mano derecha ligeramente plegada de manera que el DNA queda atrapado en su interior. La actividad correctora está en la parte de la palma.
Especificidad de la replicación La especificidad de la replicación está determinada por dos factores clave: 1.La longitud adecuada de los puentes de hidrógeno Las DNA polimerasas reconocen el apareamiento correcto de bases en parte gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los nucleótidos complementarios. Estas interacciones ocurren en el surco menor del DNA y son detectadas por el sitio activo de la polimerasa, que actúa como una "regla" conformacional.
Si el emparejamiento es incorrecto, la distancia entre las bases no será la adecuada, por lo que el ancho de la cadena tampoco lo será, lo que induce un cambio conformacional en la enzima que impide la adición del siguiente nucleótido. 2.La complementariedad entre las bases Las DNA polimerasas permanecen en una conformación abierta hasta que entra el nucleótido trifosfato (dNTP) correcto. Solo cuando se detecta la correcta complementariedad entre el nucleótido entrante y la base del molde, la enzima experimenta un cambio conformacional drástico que cierra el sitio activo y permite la incorporación del nucleótido.
Este cambio conformacional es esencial para la continuidad del proceso de 8 replicación. Si se inserta un nucleótido incorrecto, la polimerasa no experimentará el ajuste conformacional necesario, y en este caso, la actividad exonucleasa 3' 5' de proofreading entra en acción. Esta actividad, presente en las polimerasas replicativas eucariotas y en la polimerasa I de E. coli, permite que la enzima retroceda, excise el nucleótido incorrecto y luego reanude la síntesis correctamente.
De esta manera, el sistema de proofreading asegura que las mutaciones espontáneas durante la replicación sean minimizadas, permitiendo la correcta transmisión del material genético a la siguiente generación de células. 8 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 9 Iniciación: formación de burbuja de replicación - Origen de replicación: ARS y OriC - Burbuja de replicación o replicón - Helicasas - ORC (origin recognition complex) - Topoisomerasas - Horquillas de replicación 1. Orígenes de replicación La replicación del DNA comienza en regiones específicas conocidas como orígenes de replicación.
En procariotas y en organismos con genomas circulares, como las bacterias, el genoma suele tener uno o pocos orígenes de replicación. En el caso de E. coli, este origen es conocido como OriC. Sin embargo, en organismos eucariotas, cuyo genoma es lineal y de mayor tamaño, existen múltiples orígenes de replicación distribuidos a lo largo de cada cromosoma. Por ejemplo, en las levaduras se han identificado más de 400 orígenes de replicación repartidos en sus 17 cromosomas.
Estos orígenes contienen secuencias específicas denominadas ARS (Autonomous Replication Sequence), que comprenden entre 100 y 200 pares de bases, caracterizadas por la presencia de secuencias ricas en adenina (A) y timina (T), facilitando así la separación de las hebras debido a los enlaces de hidrógeno más débiles entre estas bases. En los eucariotas, las secuencias de origen son reconocidas por complejos proteicos como el ORC (Origin Recognition Complex), que se une a estos orígenes y recluta otras proteínas necesarias para la formación del complejo de pre-replicación (pre-RC).
Este complejo es fundamental para la regulación del proceso, asegurando que cada origen solo se active una vez por ciclo celular. 2. Formación de la burbuja de replicación Una vez que el ORC ha reconocido y marcado el origen, la helicasa es reclutada para desenrollar la doble hélice del DNA, abriendo las hebras parentales y formando una burbuja de replicación. En esta burbuja, se forman dos horquillas de replicación en direcciones opuestas, cada una avanzando a lo largo del DNA. Las topoisomerasas alivian la tensión del superenrollamiento que se genera en el DNA conforme las hebras se separan.
9 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 10 Iniciación: primeros nucleótidos 3. Iniciación de la replicación En cada horquilla, la replicación se inicia mediante la acción de una primasa, que es una RNA polimerasa dependiente de DNA que sintetiza un pequeño fragmento de RNA (cebador o primer). Este fragmento de RNA proporciona un extremo 3'-OH libre necesario para que las DNA polimerasas inicien la elongación de la nueva hebra de DNA. En eucariotas, esta función está integrada en la DNA polimerasa α, que posee actividad tanto de primasa como de polimerasa.
El cebador en procariotas tiene entre 5 y 15 nucleótidos de RNA, mientras que en eucariotas incluye aproximadamente 10 nucleótidos de RNA seguidos por un pequeño fragmento de DNA de unos 20 a 30 nucleótidos. 10 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 11 Elongación 4. Elongación de las hebras de DNA La elongación de las nuevas hebras de DNA siempre ocurre en la dirección 5' 3', lo que implica que los nucleótidos trifosfato (dNTPs) son añadidos al extremo 3' libre de la cadena en crecimiento. La energía para la formación del enlace fosfodiéster entre nucleótidos proviene de la liberación de pirofosfato (PPi) al romperse el enlace entre los fosfatos alfa y beta del dNTP.
Debido a la naturaleza antiparalela del DNA, las dos hebras parentales son copiadas de manera distinta: Hebra líder (leading strand): Esta hebra tiene una orientación 3' 5' y, por lo tanto, puede ser copiada de manera continua en dirección 5' 3' por la DNA polimerasa III en procariotas y la DNA polimerasa δ en eucariotas. Hebra retardada (lagging strand): Debido a su orientación 5' 3', la síntesis en esta hebra es discontinua. Se sintetizan múltiples fragmentos de Okazaki en dirección 5' 3', cada uno de ellos iniciado por un cebador de RNA colocado por la primasa.
En procariotas, estos fragmentos son más largos (de 1.000 a 2.000 nucleótidos) en comparación con eucariotas (100 a 150 nucleótidos). 5. Eliminación de cebadores y unión de fragmentos Una vez que la síntesis de las nuevas hebras ha avanzado, los cebadores de RNA deben ser eliminados y reemplazados por DNA. En procariotas, esto es realizado por la DNA polimerasa I, que tiene actividad exonucleasa 5' 3' para remover los cebadores y rellenar los huecos con nucleótidos de DNA. En eucariotas, esta función es llevada a cabo por la DNA polimerasa δ y por exonucleasas como FEN1. Los fragmentos de Okazaki deben ser finalmente unidos entre sí para generar una hebra continua de DNA.
Este proceso es catalizado por la DNA ligasa, que forma los enlaces fosfodiéster entre los fragmentos. 11 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 12 12 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 13 6. Regulación de la replicación La replicación del DNA está rigurosamente regulada, y en eucariotas, el proceso se asegura de que cada origen de replicación solo sea activado una vez por ciclo celular. La regulación depende de la formación del complejo de pre-replicación (pre-RC) en las fases G1 y S del ciclo celular, y su activación por la acción de las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs).
Además, los orígenes no se activan simultáneamente, lo que permite una replicación más coordinada y evita la sobresaturación de la maquinaria de replicación. 7. Finalización de la replicación En procariotas, la replicación se completa cuando las dos horquillas se encuentran en el extremo opuesto del origen, en un proceso denominado terminación. En eucariotas, la replicación finaliza en los telómeros, que son secuencias repetitivas en los extremos de los cromosomas. Dado que las DNA polimerasas no pueden replicar los extremos de los cromosomas lineales, la telomerasa extiende los telómeros para prevenir la pérdida progresiva de información genética en cada ciclo celular.
13 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 14 El problema de la replicación de los extremos Sin embargo, en células somáticas adultas, la actividad de la telomerasa está prácticamente ausente o es muy baja. Como resultado, con cada división celular los telómeros se van acortando progresivamente, lo que eventualmente lleva a un estado conocido como senescencia replicativa o envejecimiento celular, en el cual las células pierden su capacidad de dividirse. Este acortamiento de los telómeros está relacionado con el envejecimiento y actúa como un mecanismo de protección contra la proliferación celular descontrolada, como el cáncer.
Sin embargo, la telomerasa sí está activa en tipos específicos de células, como: Células germinales (óvulos y espermatozoides). Células madre embrionarias. Células madre de tejidos específicos en menor medida. Células tumorales: En muchos tipos de cáncer, la telomerasa se reactiva, permitiendo que las células cancerosas eludan el acortamiento de los telómeros y se dividan indefinidamente, lo que contribuye a su inmortalidad. La replicación de los extremos de las moléculas de DNA lineal, como los cromosomas eucariotas, plantea un problema particular que no se observa en los genomas circulares de procariotas y algunos virus.
Este problema surge debido a la necesidad de un cebador de RNA para iniciar la síntesis de DNA. En la hebra retrasada (lagging strand), una vez que el cebador de RNA ubicado en el extremo 5' es eliminado, no hay manera de rellenar el espacio dejado por este cebador, ya que la DNA polimerasa solo puede añadir nucleótidos a un extremo 3'-OH preexistente. Como resultado, en cada ronda de replicación, los cromosomas se acortarían progresivamente, perdiendo parte de su secuencia en cada ciclo replicativo. Este acortamiento sería letal para las células que se dividen repetidamente.
Para evitar este problema, los extremos de los cromosomas eucariotas están protegidos por estructuras especiales denominadas telómeros. Los telómeros consisten en múltiples repeticiones de una secuencia corta de DNA en el extremo 3' de una de las hebras de la doble hélice. En los humanos, esta secuencia repetitiva es 5'-TTAGGG-3' (al contrario de lo que aparece en la imagen). Debido a la naturaleza de esta repetición, la hebra 3' es más larga que la hebra antiparalela, lo que genera un extremo sobresaliente de DNA monocatenario en el extremo del cromosoma.
14 La telomerasa es la enzima responsable de mantener y alargar estas repeticiones teloméricas, evitando el acortamiento progresivo que ocurriría tras cada ronda de replicación. La telomerasa es una ribonucleoproteína, lo que significa que contiene tanto una componente proteica como unRNA asociado. Este RNA actúa como un molde que guía la elongación de la hebra 3' del telómero. En los humanos, la secuencia de RNA contenida en la telomerasa es complementaria a la repetición telomérica, lo que le permite alinear y extender específicamente los telómeros con la secuencia adecuada.
Las secuencias teloméricas y la actividad de la telomerasa están altamente conservadas a lo largo de la evolución, lo que subraya su importancia crítica en la estabilidad genómica y la prevención del envejecimiento celular prematuro. Proceso de elongación de los telómeros El proceso de elongación de los telómeros es un mecanismo especializado que consta de varias etapas: 1.Reconocimiento y alineación: La telomerasa se une al extremo 3' sobresaliente del telómero. El RNA que forma parte de la telomerasa contiene una secuencia complementaria al extremo telomérico, permitiendo que la enzima se alinee correctamente con las repeticiones teloméricas existentes.
2.Extensión del extremo 3': Utilizando el fragmento de RNA como molde, la telomerasa añade nuevos nucleótidos al extremo 3' de la hebra de DNA. La telomerasa sintetiza varias repeticiones del hexanucleótido 5'-TTAGGG-3' a medida que se desplaza a lo largo de la hebra telomérica. Esta elongación asegura que la hebra 3' se extienda aún más allá del extremo del cromosoma. 3.Desplazamiento de la telomerasa: Después de añadir una nueva repetición, la telomerasa se desplaza hacia adelante para alinear su RNA con el siguiente segmento telomérico, y repite el proceso de síntesis de nuevas repeticiones.
4.Síntesis de la hebra complementaria: Una vez que el extremo 3' ha sido extendido por la telomerasa, el extremo sobresaliente sirve como plantilla para que la DNA polimerasa sintetice la hebra complementaria 5'. Aunque la telomerasa no participa directamente en la síntesis de la hebra complementaria, otras enzimas, como las DNA polimerasas y la primasa, son responsables de este proceso. Se sintetiza un cebador de RNA en el extremo recién extendido, permitiendo que la DNA polimerasa complete la hebra retrasada.
14 Mutación del DNA genómico Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 15 Tradicionalmente se considera a una mutación como un cambio de la secuencia de nucleótidos en una región determinada del genoma (mutaciones génicas), aunque también las aberraciones cromosómicas pueden considerarse mutaciones cromosómicas. En realidad, la mutación es un fallo en la fidelidad del almacenamiento de la información, ya que hay un cambio de la información guardada. La mutación puede ocurrir de manera espontánea o inducida por diversos factores externos y puede transmitirse a la descendencia o no, dependiendo del momento del desarrollo y el tipo celular que la sufra.
Aunque la mutación se asocia rápidamente a algo perjudicial (a enfermedad) es la base de la evolución y de la variabilidad interindividual. Además, gran parte de nuestro conocimiento acerca de la función de determinados productos génicos se ha conseguido a través de la existencia de mutaciones: sabemos qué hacen porque vemos lo que falta o está alterado cuando esos genes están mutados. Si la mutación tiene un efecto pernicioso tenderá a eliminarse de la población mediante la selección natural a lo largo de sucesivas generaciones. Si tiene un efecto ventajoso, podrá alcanzar una frecuencia del 100% en la población (se podrá fijar).
Si es neutra, su permanencia en la población será un proceso de puro azar. Cuando una mutación neutral alcanza una frecuencia mayor al 1% del conjunto de alelos presentes en la población, se habla de polimorfismo. Esto indica que en la población habría múltiples formas (alelos) de ese gen. Según las células a las que afecta, las mutaciones pueden ser somáticas o germinales. Las mutaciones somáticas afectan a determinadas células de un organismo, por lo que, salvo que estas den lugar a los gametos, no se transmiten a los descendientes (no son heredables). Sin embargo, sí poseerán la mutación las células que provienen de ellas por mitosis.
Cuanto más precozmente se produzca la mutación en el desarrollo, mayor será el número de células del organismo que tendrá ese cambio. Por el contrario, las mutaciones germinales (o de la línea germinal) se producen en células que producirán gametos. Esto hará que estas mutaciones sí puedan transmitirse a la descendencia, dando lugar a organismos que tendrán dicha mutación en todas sus células. Teniendo en cuenta los efectos fenotípicos sobre el organismo, tendremos que las mutaciones letales o deletéreas son aquellas que provocan la muerte prematura del organismo y las mutaciones condicionales son aquellas cuyos efectos únicamente pueden observarse en ciertas condiciones.
Por otro lado, las mutaciones con pérdida de función producen la ausencia completa o parcial de la función normal del producto del gen, 15 que las mutaciones con ganancia de función dan lugar a una activación constitutiva de la proteína, a la aparición de características nuevas o a la funcionalidad del producto génico en tejidos y momentos inadecuados.
15 Molecular Biology and Cytogenetics, CIFP Manuel Antonio, 24/25 16 16 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 17 Tipos de mutaciones según la secuencia del DNA o Sustituciones Transiciones Transversiones Existen varias clasificaciones de las mutaciones dependiendo de sus efectos sobre la secuencia de DNA, sobre el gen de manera global, sobre las células a las que afecta, sobre el fenotipo del organismo y, finalmente, también se pueden clasificar según su origen.
Así, teniendo en cuenta la secuencia de DNA, las mutaciones pueden ser sustituciones o cambios de un nucleótido por otro (denominándose transiciones cuando el cambio es de una purina por purina o pirimidina por pirimidina, o transversiones cuando el cambio es de purina por pirimidina o viceversa). 17 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 18 Tipos de mutaciones según la secuencia del DNA o Sustituciones Transiciones Transversiones o Inserciones o Deleciones o Inversiones Cambio de fase Las inserciones y deleciones pueden desencadenar mutaciones con cambio de fase (frameshift, en inglés), en las cuales se produce un corrimiento del marco de lectura.
18 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 19 Tipos de mutaciones según los efectos sobre el gen o proteína codificada o Silenciosas o sinónimas (sense o silent) o Cambio de sentido (missense) o Sin sentido (nonsense) Teniendo en cuenta los efectos sobre el gen (o sobre la proteína que codifica), las mutaciones pueden ser silenciosas o sinónimas (sense, en inglés), cuando no provocan cambios en el aminoácido codificado, o con cambio de sentido (missense, en inglés), cuando sí provocan un cambio en el aminoácido codificado (que podría ser conservadora o no dependiendo de si el aminoácido sustituido tiene propiedades fisicoquímicas semejantes o no) o sin sentido (nonsense, en inglés), cuando dan lugar a un codón de parada que provoca la terminación prematura de la traducción dando lugar a una proteína truncada.
Este último efecto también puede ser el inverso si la mutación convierte un codón de parada en un codón codificante que provocaría la terminación retrasada de la traducción. 19 Molecular Biology and Cytogenetics, CIFP Manuel Antonio, 24/25 20 Nomenclatura de mutaciones La nomenclatura de mutaciones de la Human Genome Variation Society (HGVS) es un sistema estandarizado que describe variantes genéticas de manera precisa y consistente. Este sistema permite a los científicos y clínicos comunicar de forma clara y uniforme las alteraciones en el DNA, RNA y proteínas. A continuación, detallo los principales elementos de este sistema y cómo interpretarlo.
Estructura General de la Notación La nomenclatura HGVS se compone de varios elementos básicos, que incluyen: 1.Prefijo de tipo de secuencia: Indica si la variante se refiere a DNA genómico, cDNA, RNA o proteína. g.: DNA genómico (genomic DNA) c.: cDNA (complementary DNA, secuencia de la región codificante basada en el mRNA) n.: RNA nuclear (refiere al pre-RNA o RNA que no ha pasado por splicing) m.: DNA mitocondrial (mitochondrial DNA) p.: Proteína (protein, se utiliza para describir cambios en la secuencia de aminoácidos) 2.Número de posición: Define el nucleótido o aminoácido afectado, utilizando una numeración basada en la secuencia de referencia.
En el caso del cDNA (indicado por "c."), el primer nucleótido de la región codificante (normalmente el codón de inicio ATG) se numera como c.1. Para el genómico (g.) y otros tipos, se basa en la numeración de la secuencia completa de referencia del genoma o del gen. 3.Símbolo de cambio: Describe el cambio específico que ocurre en la secuencia. >: Sustitución de un nucleótido por otro (por ejemplo, "c.76A>G" indica que una adenina en la posición 76 es reemplazada por una guanina). del: Deleción de uno o más nucleótidos (por ejemplo, "c.76_78del" indica la eliminación de los nucleótidos en las posiciones 76 a 78).
ins: Inserción de uno o más nucleótidos (por ejemplo, "c.76_77insT" indica la inserción de una timina entre los nucleótidos 76 y 77). dup: Duplicación de uno o más nucleótidos (por ejemplo, "c.76dup" indica la duplicación del nucleótido en la posición 76). delins: Deleción seguida de inserción, es decir, un reemplazo de una secuencia por otra (por ejemplo, "c.76_78delinsTT" indica que los nucleótidos de la posición 76 a 78 han sido eliminados y 20 reemplazados por "TT").
Ejemplos Comunes de Notación Veamos algunos ejemplos y su interpretación para entender mejor los elementos de esta nomenclatura: 1.Sustitución: c.76A>G Significa que en el cDNA, en la posición 76, una adenina (A) se ha cambiado por una guanina (G). 2.Deleción: c.76_78del Indica que los nucleótidos en las posiciones 76 a 78 han sido eliminados en la secuencia del cDNA. 3.Inserción: c.76_77insT Muestra que se ha insertado una timina (T) entre las posiciones 76 y 77 del cDNA. 4.Duplicación: c.76dup Aquí, el nucleótido en la posición 76 está duplicado en la secuencia del cDNA.
5.Deleción e inserción (delins): c.76_78delinsTT Indica que los nucleótidos en las posiciones 76 a 78 han sido eliminados y reemplazados por una secuencia "TT". 6.Mutaciones Intrónicas: c.1392+754T>G Esto indica una mutación en el intrón, a 754 nucleótidos del inicio del intrón que sigue al exón cuya última posición es 1392. La timina (T) en esa posición se ha sustituido por una guanina (G). c.76-2A>G Se refiere a una mutación en la región intrónica antes del exón 76, a dos nucleótidos del inicio del exón. En este caso, una adenina (A) es reemplazada por una guanina (G).
Notación para Mutaciones en la Secuencia de Proteínas Para describir cambios en la secuencia de aminoácidos, se utiliza el prefijo p. y una nomenclatura específica: 1.Sustitución de aminoácido: p.Arg76Gly: Arginina (Arg) en la posición 76 de la proteína ha sido reemplazada por glicina (Gly). 2.Deleción de aminoácido: p.Arg76del: La arginina en la posición 76 ha sido eliminada. 3.Inserción de aminoácidos: p.Arg76_Gly77insSer: Indica que se ha insertado una serina (Ser) entre la arginina en la posición 76 y la glicina en la posición 77.
4.Cambio de marco de lectura (frameshift): p.Arg76Glyfs*15: Un cambio en el marco de lectura ha comenzado en la posición 76, reemplazando arginina por glicina, y genera un codón de parada 15 posiciones después. 5.Mutación sin sentido (nonsense): p.Arg76* o p.Arg76Ter*: La arginina en la posición 76 ha sido reemplazada por un codón de parada, resultando en una proteína truncada.
20 Transcripción y maduración del RNA Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 21 21 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 22 Dogma central de la biología molecular Las células contienen en su genoma las instrucciones necesarias para la síntesis de las biomoléculas que determinan su tamaño, forma, función y comportamiento. Estas instrucciones se organizan en unidades de información llamadas genes, que no solo codifican para proteínas, sino que también incluyen secuencias que regulan la expresión génica y producen diferentes tipos de RNAs no codificantes con funciones biológicas importantes.
Un gen se define clásicamente como un segmento de DNA que contiene la información necesaria para la síntesis de una molécula biológicamente activa, ya sea un RNA funcional o una proteína. La información contenida en los genes está codificada en la secuencia de nucleótidos del DNA. Este código es transcrito en una molécula de RNA mediante el proceso de transcripción, llevado a cabo por la RNA polimerasa. En algunos casos, como en los genes que codifican para RNAs no codificantes (por ejemplo, tRNA, rRNA, miRNA), el RNA transcrito es el producto final y cumple funciones estructurales, regulatorias o catalíticas.
Sin embargo, en la mayoría de los casos, especialmente en genes que codifican para proteínas, la información contenida en el RNA es utilizada para la síntesis de polipéptidos en un proceso denominado traducción. Este flujo de información desde el DNA al RNA y luego a la proteína, junto con la replicación del DNA, es conocido como el dogma central de la biología molecular. Tradicionalmente, el dogma describe este flujo unidireccional, pero investigaciones recientes han ampliado la comprensión de la regulación y la complejidad de estos procesos.
Por ejemplo, se ha descubierto que algunos RNAs no codificantes y otros productos del proceso de transcripción pueden regular la expresión génica, controlar la estabilidad de otras moléculas de RNA o influir en la traducción. En este sistema, el RNA mensajero (mRNA) sigue desempeñando un papel fundamental como intermediario entre la información original (la secuencia de nucleótidos del DNA) y el producto final (la secuencia de aminoácidos de una proteína). Sin embargo, el RNA tiene otras funciones críticas, ya que además del mRNA, hay múltiples tipos de RNA que no son traducidos en proteínas, pero que regulan la actividad genética y el metabolismo celular.
Antes de que el mRNA sea traducido, este experimenta modificaciones post-transcripcionales durante un proceso llamado maduración del RNA. En los eucariotas, este proceso incluye el capping en el extremo 5' del RNA, la adición de una cola poli-A en el extremo 3' y el splicing o corte de intrones (secuencias no 22 codificantes), dejando únicamente los exones (secuencias codificantes). Además, algunas moléculas de RNA sufren edición en la que se modifican las bases nucleotídicas, alterando la secuencia final del RNA.
Estas modificaciones son esenciales para la funcionalidad y estabilidad del RNA, y también permiten la regulación alternativa de genes, como ocurre en el splicing alternativo, que permite a un solo gen producir múltiples variantes de proteínas. Es importante destacar que el metabolismo del RNA ha adquirido una relevancia creciente en la investigación, no solo por su papel en la fisiología celular, sino también por su implicación en múltiples condiciones patológicas. Alteraciones en la transcripción, maduración o estabilidad del RNA están asociadas a diversas enfermedades, como el cáncer, enfermedades neurodegenerativas y trastornos autoinmunes.
Además, las tecnologías emergentes, como los RNA terapéuticos (como los miRNA), están comenzando a aprovechar estas vías para el tratamiento de enfermedades genéticas. En este apartado, se abordarán las características básicas de los procesos de transcripción y maduración del RNA, así como ejemplos que ilustran la importancia del metabolismo del RNA en situaciones tanto fisiológicas como patológicas, destacando el impacto de estas vías en la salud y la enfermedad.
22 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 23 Expresión diferencial de genes en los tejidos Todas las células del organismo comparten un mismo genoma, en el que están codificadas todas las instrucciones para su desarrollo, diferenciación y funcionamiento. Sin embargo, una determinada célula, en un momento concreto, solo utiliza una pequeña fracción de los aproximadamente 25.000 genes del genoma humano. El proceso mediante el cual la célula transforma la información de un gen en un elemento funcional se denomina expresión génica. El primer paso en la expresión de un gen es la síntesis de una molécula de RNA.
Las funciones que debe desempeñar una célula, así como las condiciones ambientales en las que se encuentra, van a determinar qué genes se expresan en un momento dado; por ello, la transcripción de un gen está sometida a un estricto control. Este control se lleva a cabo a través de secuencias reguladoras, denominadas promotores, que se localizan al comienzo del gen (Figura). 23 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 24 Relación DNA y RNA Cada una de las hebras del DNA cumple un papel diferente en la transcripción.
La RNA polimerasa utiliza una de ellas como molde, de tal manera que la secuencia de nucleótidos del RNA sintetizado es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la hebra molde del DNA, también conocida como hebra no codificante o antisentido. La otra hebra del DNA se denomina hebra no molde, codificante o sentido. La secuencia de bases del transcrito de RNA es idéntica a la secuencia de la hebra sentido (Figura), con la diferencia de que el RNA contiene uracilos en lugar de timinas y grupos hidroxilo en el carbono 2' de las pentosas. Esta última característica hace que las moléculas de RNA se hidrolicen más fácilmente que las moléculas de DNA.
24 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 25 Tipos de RNA - mRNA - rRNA - tRNA - snRNA - snoRNA - miRNA - siRNA - lncRNA Las cadenas de RNA de hebra sencilla tienden a plegarse sobre sí mismas, dando lugar a una diversidad estructural mucho mayor que la observada en el DNA y, por lo tanto, a una mayor diversidad funcional. Entre las funciones desempeñadas por las moléculas de RNA destacan las relacionadas con la transmisión de la información génica entre el DNA y las proteínas.
En ella intervienen distintos tipos de RNA, siendo los tres principales: - RNA mensajero (mRNA): transporta la información contenida en el DNA desde el núcleo hasta los ribosomas, los orgánulos celulares donde se produce la síntesis de las cadenas polipeptídicas (las proteínas). - RNA ribosómico (rRNA): es el tipo de RNA más abundante. Forma parte de la estructura de los ribosomas. - RNA de transferencia (tRNA): transporta los aminoácidos necesarios para la síntesis de las proteínas en los ribosomas.
Además de estos tres tipos principales, existen otros tipos de RNA con funciones reguladoras y de procesamiento: RNA pequeño nuclear (snRNA): Participa en el procesamiento del pre-mRNA (splicing) en el núcleo. Los snRNAs son componentes esenciales de los complejos de espliceosomas que eliminan intrones del pre- mRNA. RNA pequeño nucleolar (snoRNA): Interviene en la modificación química y el procesamiento del rRNA. MicroRNA (miRNA) y RNA de interferencia pequeño (siRNA): Estos RNAs pequeños regulan la expresión génica mediante la degradación de mRNA o la inhibición de la traducción.
RNA largo no codificante (lncRNA): Son secuencias de RNA más largas que no codifican proteínas pero juegan roles reguladores en la expresión génica, la modificación de la cromatina y la estructura del genoma. 25 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 26 miRNA: biosíntesis y función Premio Nobel 2024 Los microRNAs (miRNAs) son pequeñas moléculas de RNA no codificante, generalmente de 20-24 nucleótidos de longitud, que juegan un papel crucial en la regulación post-transcripcional de la expresión génica.
Su principal función es regular la estabilidad y la traducción de los mRNAs, controlando la expresión de genes en diversos procesos biológicos como el desarrollo, la proliferación celular, la apoptosis y la respuesta al estrés. Biogénesis de los microRNAs La biogénesis de los miRNAs sigue un proceso altamente regulado que implica varios pasos clave: 1.Transcripción: Los miRNAs se transcriben a partir de genes específicos en el genoma por la RNA polimerasa II o III, generando un pri-miRNA (precursores primarios de miRNA), que es una molécula larga con estructura de horquilla.
2.Procesamiento nuclear: El pri-miRNA es procesado en el núcleo por la enzima Drosha, una endonucleasa tipo RNasa III, y su cofactor DGCR8 (Pasha en algunos organismos). Este procesamiento produce un pre- miRNA, una molécula de RNA con doble cadena y horquilla de aproximadamente 70 nucleótidos. 3.Exportación al citoplasma: El pre-miRNA es exportado al citoplasma a través de la proteína Exportin-5, que reconoce la estructura de horquilla y facilita su transporte. 4.Maduración en el citoplasma: Una vez en el citoplasma, el pre-miRNA es procesado por otra endonucleasa RNasa III llamada Dicer, que lo corta en un miRNA dúplex de unos 22 nucleótidos.
5.Incorporación en el complejo RISC: El dúplex se separa en dos cadenas. Solo una de ellas, conocida como la cadena guía (o miRNA maduro), es incorporada en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC, RNA- induced silencing complex), mientras que la otra cadena, llamada "cadena pasajera" o miRNA, es degradada. Mecanismo de acción El complejo RISC, junto con el miRNA maduro, se une de manera complementaria a la región 3' no traducida (3'UTR) de los mRNAs diana. El grado de complementariedad entre el miRNA y el mRNA objetivo determinará si el mRNA es degradado o si su traducción es simplemente inhibida.
En organismos de vertebrados, la complementación parcial es común, y la inhibición de la traducción suele ser el principal mecanismo. Sin embargo, en plantas, donde la complementación es casi perfecta, el miRNA induce la degradación del mRNA. 26 Funciones biológicas de los miRNAs Los miRNAs son fundamentales en muchos procesos celulares y fisiológicos: Desarrollo: Los miRNAs juegan un papel clave en la regulación del desarrollo embrionario y la diferenciación celular, como se ha demostrado en modelos animales. Cáncer: Muchos miRNAs actúan como oncogenes (oncomiRs) o supresores de tumores.
Alteraciones en la expresión de miRNAs están asociadas con varios tipos de cáncer, lo que los convierte en biomarcadores potenciales y en dianas terapéuticas. Respuesta inmunológica: Los miRNAs también están implicados en la regulación de la respuesta inmune innata y adaptativa, controlando la diferenciación y activación de linfocitos, así como la expresión de citoquinas y otros factores inflamatorios. Enfermedades cardiovasculares: En este contexto, varios miRNAs han sido identificados como reguladores clave de la homeostasis cardiovascular, incluyendo el control de la proliferación y migración de células musculares lisas vasculares y la apoptosis de células cardiacas.
Implicaciones clínicas El descubrimiento de miRNAs ha abierto nuevas oportunidades en la investigación biomédica. Su expresión alterada se ha relacionado con diversas enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares e infecciones virales. Debido a su estabilidad en fluidos biológicos como la sangre y su capacidad para modular múltiples genes a la vez, los miRNAs son candidatos prometedores como biomarcadores para el diagnóstico precoz y el pronóstico de diversas enfermedades.
Además, se están desarrollando estrategias terapéuticas basadas en miRNAs, como el uso de miRNAs miméticos (para restaurar la función de un miRNA perdido) o inhibidores de miRNAs (antimiRs, para bloquear un miRNA sobreexpresado), con potencial para tratar diversas patologías. 26 Molecular Biology and Cytogenetics, CIFP Manuel Antonio, 24/25 27 Resumiendo: 27 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 28 La RNA polimerasa es la principal enzima implicada en la transcripción. Esta enzima cataliza la síntesis de una molécula de RNA simple (de una sola hebra) a partir de un gen, el cual está constituido por un segmento de DNA de cadena doble.
El mecanismo molecular de la transcripción es similar al de la replicación. Sin embargo, existen importantes diferencias entre ambos procesos, así como entre las polimerasas que intervienen en ellos En eucariotas, los tránscritos son predominantemente monocistrónicos, es decir, cada unidad de transcripción codifica una única cadena polipeptídica. Esta característica contrasta con los organismos procariotas, donde los transcritos frecuentemente son policistrónicos. Dentro de las unidades de transcripción eucariotas, se encuentran secuencias codificantes conocidas como exones, interrumpidas por secuencias no codificantes llamadas intrones.
La regulación de la transcripción en eucariotas es más compleja en comparación con los procariotas y requiere de elementos adicionales. Las regiones reguladoras de la transcripción se ubican tanto delante como dentro y, en algunos casos, detrás de la unidad de transcripción. Por ejemplo, en el caso de la RNA polimerasa III, estas regiones se encuentran principalmente delante y dentro de la unidad de transcripción. En cambio, para la RNA polimerasa II, se localizan delante, dentro y detrás de la unidad.
A diferencia de la RNA polimerasa bacteriana, las RNA polimerasas eucariotas necesitan la asistencia de factores de transcripción, que son proteínas auxiliares específicas para cada tipo de RNA polimerasa. Estos factores se unen a secuencias reguladoras en el DNA y son esenciales para el ensamblaje correcto de las RNA polimerasas y la iniciación de la transcripción. Los genes en eucariotas están constituidos por varias secuencias de DNA. Estas incluyen la unidad de 28 transcripción propiamente dicha, que es un segmento continuo de DNA que codifica la secuencia del tránscrito primario. Esta unidad abarca la secuencia codificante (exones), los intrones, y las secuencias líder 5' y 3'.
Además, los genes poseen secuencias mínimas necesarias para iniciar la transcripción, como el promotor, y elementos para la formación del extremo 3' del mRNA maduro. Es fundamental la regular de la tasa de iniciación. Esta regulación es mediada por elementos de secuencia específicos ubicados en el DNA, que pueden encontrarse tanto en regiones cercanas al sitio de inicio de la transcripción (como promotores y potenciadores) como en regiones más distales. Estos elementos incluyen secuencias de DNA que sirven como sitios de unión para factores de transcripción y otras proteínas reguladoras. Su función es modular la accesibilidad y la actividad de la RNA polimerasa.
Estos elementos reguladores desempeñan un papel clave en la inducción o represión de la transcripción, así como en la especificidad de la expresión génica en términos temporales, celulares y tisulares. Por ejemplo, ciertos factores de transcripción se activan en respuesta a señales específicas, induciendo la transcripción de genes relacionados con esa señal. De manera similar, otros factores pueden actuar como represores, bloqueando la transcripción en ausencia de ciertas condiciones. Esto permite que la célula ajuste finamente la expresión génica en respuesta a su entorno y estado fisiológico, asegurando así la síntesis adecuada y regulada de macromoléculas esenciales para su funcionamiento.
28 Molecular Biology and Cytogenetics,CIFP Manuel Antonio, 24/25 29 Estructura del promotor de los genes de clase II Seen here is a four-step diagram depicting the usage of an enhancer. Within this DNA sequence, protein(s) known as transcription factor(s) bind to the enhancer and increase the activity of the promoter. 1.DNA; 2.Enhancer; 3.Promoter; 4.Gene; 5.Transcription Activator Protein; 6.Mediator Protein; 7.RNA Polymerase La transcripción en eucariotas comienza con la unión de la RNA polimerasa II al promotor del gen. El promotor se localiza en la región 5' (upstream) de la hebra molde.
Esta región promotora abarca desde decenas a cientos de bases antes del sitio de inicio de la transcripción (TSS, Transcription Start Site) y puede extenderse ligeramente más allá de este punto. La secuencia del promotor influye en la expresión basal del gen y su regulación, siendo esta influencia modulada por secuencias consenso y elementos específicos. Los promotores de los genes de clase II (transcritos por la RNA polimerasa II) contienen varios elementos clave que son esenciales para la iniciación y regulación de la transcripción. Estos elementos sirven como sitios de unión para factores de transcripción generales y específicos que controlan la expresión del gen.
A continuación, se describen los principales elementos clave de estos promotores: 1. Caja TATA (TATA box) La caja TATA es una secuencia rica en adenina y timina, típicamente ubicada a unos 25-35 pares de bases (pb) corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción (+1). Se encuentra en muchos, pero no en todos los promotores de genes de clase II. Funciona como un sitio de anclaje para el factor de transcripción TFIID, que contiene la proteína TBP (TATA-binding protein). TBP reconoce y se une específicamente a la caja TATA, lo que facilita la posterior reclutación de otros factores de transcripción generales y la RNA polimerasa II.
Secuencia típica: TATAAA Función: Facilitar el ensamblaje del complejo de pre-iniciación (PIC, pre-initiation complex). Promover la orientación correcta de la RNA polimerasa II hacia el sitio de inicio de la transcripción. 2. Elemento iniciador (Inr) El elemento iniciador es una secuencia conservada que abarca el sitio de inicio de la transcripción (+1). Puede actuar de manera independiente o en combinación con la caja TATA. Ayuda a posicionar la RNA polimerasa II correctamente en el punto donde debe comenzar la síntesis del pre-mRNA. El Inr es reconocido por factores de transcripción generales, como el complejo TFIID.
Secuencia típica: YYANWYY (donde Y es pirimidina, A es adenina, W es adenina o timina, y N es cualquier 29 nucleótido). Función: Facilitar la determinación precisa del sitio de inicio de la transcripción. Participar en el reconocimiento del promotor por los factores de transcripción generales. 3. Elemento promotor aguas abajo (DPE, Downstream Promoter Element) El DPE es un elemento conservado que se encuentra aproximadamente entre +28 y +32 pb desde el sitio de inicio de la transcripción. Está presente en promotores sin caja TATA, en los que DPE colabora con el Inr en la activación de la transcripción.
El DPE es reconocido por el subcomplejo TFIID, específicamente por el dominio de unión de la proteína TAFII (TATA-binding associated factors). Gracias a esto, el DPE contribuye a la transcripción basal de muchos genes al complementar la acción del Inr. Secuencia típica: RGWYV (donde R es purina, G es guanina, W es adenina o timina, Y es pirimidina, y V es A, C o G). Función: Actuar como un elemento regulador aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción. Ayudar en el reconocimiento del promotor y la unión del complejo de pre-iniciación en genes sin caja TATA. 4.
Secuencias proximales de activación (o elementos promotores proximales) Estas son secuencias situadas a unos 50-200 pb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Contienen sitios de unión para factores de transcripción específicos que regulan la tasa de transcripción. Estas secuencias permiten una regulación más fina de la expresión génica. Estos factores de transcripción pueden ser activadores o represores, y su interacción con los elementos promotores proximales permite modular la actividad de la RNA polimerasa II. De este modo, estos elementos determinan la tasa de transcripción basal, controlando cuán frecuentemente un gen es transcrito.
Ejemplos de secuencias: GC box: sitio de unión para el factor de transcripción Sp1. CAAT box: secuencia con un motivo CAAT, reconocida por varios factores de transcripción como NF-Y. Función: Modulan la eficiencia de la transcripción y permiten la activación o represión de genes en respuesta a señales específicas. Facilitar la interacción entre factores de transcripción específicos y el complejo de pre-iniciación. 5.
Elementos reguladores distales (enhancers y silencers) Los enhancers (potenciadores) y silencers (silenciadores) son secuencias reguladoras que pueden estar ubicadas a grandes distancias del promotor, ya sea corriente arriba (upstream) o corriente abajo (downstream) del gen, o incluso dentro de intrones. Los enhancers incrementan la tasa de transcripción, mientras que los silencers la disminuyen. Ambos funcionan, al igual que los elementos proximales, mediante la unión de factores de transcripción específicos que interaccionan con el promotor a través del doblamiento del DNA, facilitado por proteínas como las coactivadoras o corepresoras.
Función: Los enhancers aumentan la probabilidad de que el complejo de pre-iniciación se forme correctamente. Los silencers reprimen la transcripción, bloqueando la unión de la maquinaria transcripcional o facilitando la formación de estructuras represivas de cromatina. 29 Molecular Biology and Cytogenetics, CIFP Manuel Antonio, 24/25 30 Característica Elementos promotores proximales Enhancers Silenciadores Ubicación Cerca del sitio de inicio de la transcripción (+1), generalmente dentro de 200 pb. Lejos del promotor, pueden estar a miles de pares de…