Técnicas de Laboratorio en Bioquímica Clínica: Métodos Ópticos y Espectrometría

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CFGS UD1: TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA 1 RA1: Aplica las técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica clínica, identificando los equipos y sus aplicaciones ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTO DE MÉTODOS DE MEDICIÓN ÓPTICOS (ESPECTROFOTOMÉTRICOS) 2.1 NATURALEZA DE LAS REM 2.2 INTERACCIÓN DE LA ENERGÍA RADIANTE CON LA MATERIA 3. EQUIPOS EMPLEADOS EN ESPECTROMETRÍA O ESPRECTROFOTOMETRÍA 4. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN 4.1 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR 4.2 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA 5. ESPECTROFOTOMETRÍA DE EMISIÓN 5.1 ATÓMICA 5.2 MOLECULAR 6. E. DE DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN 6.1 TURBIDIMETRÍA 6.2 NEFELOMETRÍA 7.

FOTOMETRÍA DE REFLECTANCIA. Química seca 8. MÉTODOS INSTRUMENTALES NO EMPLEAN REM 8.1 ESPECTROMETRÍA DE MASAS 8.2 OSMOLALIDAD CFGS 2 1INTRODUCCIÓN La bioquímica clínica es la especialidad de las ciencias de la salud que estudia los procesos metabólicos y moleculares que tienen lugar en nuestro organismo con el propósito de suministrar información para la prevención, el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento de las enfermedades. Aplicando diferentes técnicas y métodos, determina las magnitudes bioquímicas.

Estas magnitudes permiten detectar alteraciones en los valores de los analitos respecto a los considerados normales y asociarlos con cambios fisiológicos, con procesos patológicos o con variaciones inducidas por actuaciones terapéuticas. Las pruebas de bioquímica clínica miden concentraciones o actividades de sustancias muy variadas que se obtienen de diferentes muestras. Sustancias: Orgánicas: Proteínas, Carbohidratos, Lípidos, Enzimas, Hormonas, urea, ácido úrico, creatinina, bilirrubina…. Inorgánicas: Na, K, Mg…. Puede incluir estudio de elementos formes (cristales, células…) Muestras: Líquidos corporales: sangre, orina, LCR, amniótico, saliva, pericárdico, peritoneal….

Aunque algunos métodos de análisis clásicos (métodos de separación, volumétricos, gravimétricos…) siguen utilizándose, la bioquímica clínica actual está basada en los métodos instrumentales de análisis. Estos utilizan técnicas basadas en la medida de propiedades químicas y físicas para la separación (cromatografía), detección y cuantificación (métodos ópticos) e identificación (espectrometría de masas) de metabolitos con interés clínico. Son más rápidos y sensibles que los clásicos. Permiten la automatización lo que mejora los tiempos de respuesta, reproductibilidad, sensibilidad y especificidad de los mismos.

Dentro de este grupo están: -Métodos ópticos de análisis, incluyéndose bajo su denominación las técnicas espectrométricas o CFGS 3 espectrofotométricas: Técnicas que implican la medida de la radiación electromagnética (REM) emitida por la materia (átomos, moléculas, iones) o que interacciona con ella. Estos a su vez se clasifican en espectroscópicos y no espectroscópicos. -Métodos que no utilizan ningún tipo de radiación: espectrometría de masas, cromatografía, osmometría, electroforesis, potenciometría.

2 FUNDAMENTO DE ESPECTROFOTOMETRÍA 2.1NATURALEZA DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNÉTICAS (REM) La radiación electromagnética puede describirse según: -La teoría ondulatoria: como ondas consistentes en campos eléctricos y magnéticos que están en fase y que oscilan sinusoidalmente de manera perpendicular entre sí y respecto a la dirección de propagación. -La teoría corpuscular: como paquetes discretos de energía llamados fotones o cuantos, no tienen ni carga ni masa. Por lo tanto, es una forma de energía que se transmite por el espacio a gran velocidad sin soporte de materia.

Toda REM, se caracteriza por una serie de parámetros: - Longitud de onda (λ): distancia entre dos puntos de la onda que han pasado un ciclo completo. Se expresa según el SI en nm. - Frecuencia: es el número de oscilaciones completas (ciclos) que una partícula realiza en una unidad de tiempo, generalmente un segundo. (s-1 o Hertz =HZ; 1HZ=1 ciclo por segundo) - Intensidad (amplitud): número de fotones emitidos. CFGS 4 - Periodo: Es el tiempo en segundos (s) que tarda una partícula en realizar una vibración completa. - Velocidad de propagación (v): velocidad a la que un frente de onda se desplaza. Es el resultado del producto de la frecuencia y la longitud de onda.

Se mide en metros por ciclo (m/ciclo). - La Energía del haz de radiación (transportada por el fotón) que llega hasta un área determinada en la unidad de tiempo (un segundo). Se mide en julios o electrovoltios. Según la ecuación: Esta ecuación de muestra que la energía de un fotón es inversamente proporcional a la longitud de onda y directamente proporcional a la frecuencia: Cuando λ aumenta, disminuye la energía y frecuencia del fotón Se denomina espectro electromagnético a la distribución energética del conjunto de las ondas electromagnéticas. Según su λ recibe diferentes nombres (IR, UV, Visible…).

Abarca desde la radiación de menor λ y por tanto más energía (rayos gamma) a las ondas de radio, que se propagan con la λ más larga y que son las menos energéticas. La luz visible, que, representa solamente una pequeña parte del espectro desde 350-400 a 700-750 nm. es la única perceptible por el ojo humano, aunque la instrumentación del laboratorio permite CFGS 5 realizar mediciones tanto en las regiones del espectro de menor longitud de onda como en las del de mayor longitud de onda. En el laboratorio de bioquímica clínica, la longitud de onda que se suele utilizar en las técnicas de espectrometría son las correspondientes a luz visible, la ultravioleta y la infrarroja.

2.2 INTERACCIÓN DE LA ENERGÍA RADIANTE CON LA MATERIA Cuando un haz de radiación incide sobre la materia (átomos, moléculas) se pueden producir diferentes fenómenos. Absorción. Se produce cuando parte de los fotones de la REM incidente se utiliza para que los electrones, que en condiciones normales se encuentran en su nivel energético más bajo (estado fundamental), pasen a un estado de energía más alto (estado excitado), es decir, los electrones de los átomos de la partícula pasan a órbitas superiores de mayor energía.

Para que un átomo o molécula absorba la radiación, la energía del fotón excitante (incidente) debe ser igual a la diferencia de energía entre el estado fundamental y uno de los estados excitados de la especie absorbente. Cuando la REM interacciona con átomos, las transiciones energéticas solo se pueden producir entre niveles electrónicos bien definidos, obteniéndose espectros de líneas. Cuando la REM interacciona sobre moléculas, las transiciones electrónicas se producen entre los distintos niveles vibracionales (debido al movimiento de átomos enlazados) contenidos en cada nivel electrónico, obteniéndose espectros de bandas.

Las moléculas solo pueden absorber energía radiante a determinadas λ. En general, cada sustancia sólo absorberá de una manera significativa una radiación monocromática concreta y, en consecuencia, CFGS 6 La medición de la intensidad de radiación que es absorbida, transmitida, dispersada, reflejada, etc., mediante las técnicas de espectrometría permite identificar y cuantificar los analitos. se pueden usar para identificarla. (Ej. La glucosa presenta una absorción máxima a una λ de 500 nm). Emisión.

Se produce cuando los átomos o moléculas que se encuentran en un estado electrónico excitado (inestable), vuelven al estado fundamental emitiendo radiación electromagnética: Cuando se trata de átomos, la diferencia de energía entre los niveles electrónicos es igual a la energía de la radiación electromagnética emitida. En el caso de moléculas, antes de la emisión, parte de la energía se pierde en forma de calor debido al movimiento de vibración de los átomos enlazados, con lo que la energía de la luz emitida es siempre menor (mayor λ) que la diferencia de energía entre los niveles electrónicos. Transmisión.

Se produce cuando la radiación incide sobre una sustancia sin producirse pérdida de energía ni cambios de dirección. Dispersión. Parte de la luz (fotones) incidente cambia de dirección sin variar su energía al recorrer el espacio existente hasta el receptor, generalmente porque choca con partículas en suspensión. Reflexión. Parte de la luz incide sobre una superficie antes de llegar al receptor y se produce un efecto de rebote y regresan al medio del que salieron formando un ángulo igual al de la radiación incidente. Difracción. El haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar una rendija. Refracción.

Cambio de dirección y velocidad que experimenta la onda al pasar de un medio a otro de diferente naturaleza (con diferente índice refractivo). 3. EQUIPOS EMPLEADOS EN ESPECTROFOTOMETRÍA o ESPECTROMETRÍA CFGS 7 En el Laboratorio de bioquímica, el material en estudio es generalmente una solución. Los diferentes métodos de espectrometría se pueden clasificar según el tipo de interacción radiación- muestra de la siguiente manera: 1. Métodos espectroscópicos: existe un intercambio de energía entre la REM y la materia. Se producen transiciones entre distintos niveles energéticos a nivel atómico o molecular. Son los más utilizados.

Métodos de absorción: Espectrofotometría de absorción molecular: UV-visible, IR, microondas Espectrofotometría de absorción atómica. Absorción atómica, Rayos x Métodos de Emisión: Espectrofotometría de emisión atómica: fotometría de llama Espectro fotometría de emisión molecular: Luminiscencia 2.Métodos no espectroscópicos: se basa en la interacción entre la REM y la materia cuyo resultado es un cambio en la dirección o en las propiedades físicas de la REM: Dispersión: Turbidimetría. Nefelometría.

Reflexión: Fotometría de reflectancia Refracción: Refractometría Difracción Rotaciónóptica Básicamente, un equipo para el análisis químico convierte una señal analítica que no es detectable ni comprensible directamente para un ser humano en otra que sí lo es. A pesar de que su diseño puede variar mucho según la técnica específica, todos presentan unos elementos comunes: - Fuentes de luz: Proporciona la REM que va a incidir sobre la muestra. Esta tiene que ser CFGS 8 suficientemente intensa. Las hay de potencia constante (que no dependa de la fuente de alimentación de la lámpara) y en línea. Existen diferentes tipos de lámparas según la REM que emiten.

- Rendija de entrada y salida Se emplean para concentrar la luz en un punto, evitando la luz difusa. La de entrada controla la cantidad de luz que entra al selector. - Espejos y/o lentes colimadoras: A través de ellos se consigue focalizar el haz de luz para que incida sobre la muestra o para que llegue al sistema de detección. Convierte el haz de radiacción divergente de las rendijas en un haz paralelo. - Sistema selector de longitud de onda Para seleccionar la λ a partir del espectro de REM producida por una fuente de luz, se pueden utilizar dos tipos de dispositivos: o Filtros: están compuestos por un material que transmite selectivamente una longitud de onda y absorbe todas las demás.

Los aparatos que utilizan filtros se denominan Fotómetros empleados en Fotometría o fotocolorímetría. Éstos solamente pueden realizar medidas en la región visible del espectro. Los más empleados son los de interferencia, la banda de longitudes de onda que puede atravesarlos recibe el nombre de "paso de banda". o Monocromadores: empleados en Espectrofotometría, es capaz de trabajar, con la luz visible, ultravioleta e infrarroja. CFGS 9 Están compuestos por un elemento dispersante que descompone la luz blanca que le llega en varios colores (distintas longitudes de onda).

Existen dos tipos: Prisma de refracción, consiste en un prisma en el que, cuando incide la REM sobre las dos superficies transparentes, se produce una doble refracción, descomponiéndose la REM. En la espectrofotometría visible suelen utilizarse prismas de vidrio, aunque para las determinaciones en la región ultravioleta se necesitan de cuarzo. Red de difracción: consiste en una placa metálica con gran número de estrías que reflejan la luz en todas las direcciones. El tamaño de las estrías determina el intervalo de λ en que se divide la luz.

La rendija de salida, deja pasar la parte del abanico desplegado por la red o el prisma que corresponde a las longitudes de onda seleccionadas y dirige este haz sobre la cubeta. El prisma puede inclinarse o rotarse con respecto al haz luminoso de forma que la longitud de onda adecuada incida sobre la cubeta y el detector. La desventaja de los fotómetros respecto a espectrofotómetros es que en éstos últimos, con un único sistema dispersivo combinado con lentes y rendijas, se puede seleccionar cualquier λ de trabajo. En cambio, en los fotómetros se necesitan tantos filtros como longitudes de onda con las que se quiera trabajar.

- Detector óptico: convierte la señal luminosa en una señal medible (eléctrica) Deben responder a un amplio rango de longitudes de onda y deben dar respuesta rápida. Los más utilizados son: fototubos (consiste en un cátodo formado por un material fotosensible que es capaz de liberar un electrón por cada fotón que incide sobre él), fotomultiplicador, fotodiodo, fotocélula o célula fotoeléctrica. CFGS 10 - Procesador de señal, transforman la señal eléctrica en dígitos numéricos que nos pueden indicar la absorbancia o la transmitancia del analito en la muestra o su concentración. - Registrador o sistema de lectura de datos. Hoy en día, todos los aparatos incorporan la lectura digital. 4.

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN 4.1 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR: APLICACIONES En bioquímica clínica, el análisis por espectrometría de absorción molecular puede ser: Análisis cualitativo. Se realiza con radiaciones de IR y se usa principalmente para análisis de la composición de cálculos urinarios. Análisis cuantitativo. Para realizarlo se trabaja en la región del espectro correspondiente a radiación UV-VIS. Es el que vamos a estudiar. ANÁLISIS CUANTITATIVO POR ABSORCIÓN MOLECULAR (UV-VIS) Consiste en determinar la concentración o actividad de una sustancia en una muestra biológica problema, siempre que se cumplan las condiciones de la Ley de Lambert- Beer. LEY DE LAMBERT-BEER.

Como se estudió en el apartado 2.2, Si un haz de REM con una energía de intensidad P0, incide sobre una de las superficies laterales de un cuerpo semitransparente que contiene una solución del analito de interés, se puede producir absorción de dicha REM. CFGS 11 Debido a la absorción experimentada por el analito, se produce una pérdida de intensidad de la radiación al atravesar la sustancia, dicha disminución de intensidad puede ser cuantificada utilizando diversas magnitudes: La absorbancia (A): Es la cantidad de energía que la sustancia toma (absorbe) para pasar a un estado más excitado. Es la atenuación de la intensidad de la radiación cuando ésta incide sobre un amuestra.

A=log1/T=-logT=-logIt/Io. No tiene unidades y sus valores oscilan entre 0 e infinito. La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la intensidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, P, y la cantidad de luz que incidió sobre ella, P0. Indica la proporción de radiación no absorbida ni dispersada se representa normalmente en tanto por ciento: % T = P/P0 x 100 El valor de esta magnitud no tiene unidades, está comprendido entre 0 y 1 (0% y 100%) La transmitancia disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentración o el ancho de cubeta.

CFGS 12 La Ley de L-B Indica la relación directamente proporcional que existe entre la absorbancia de una muestra y su concentración al ser constante el trayecto óptico, longitud de onda y absortividad. Si T=0 (o 0%): no se transmite luz; por tanto, la absorción es total. (A=100) Si T=1 (o 100%): se transmite toda la luz; por tanto, no existe absorción. (A=0).

Para relacionar esta teoría con la utilización de la espectrofotometría como método cuantitativo se emplea la leyde Lambert-Beer: expresa la relación matemática existente entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un analito en solución Donde: -A= Absorbancia; (Densidad óptica (DO)) No tiene unidades. -a: cte de proporcionalidad. El coeficiente de extinción molar o coeficiente de absorción (unidadesL/cm·g,si c=g/L) Si la concentración c viene expresada en mol/L, la cte de proporcionalidad se denomina absortividad molar y se representa por Es característica de cada especie a una λ determinada, depende de la composición química de la molécula.

-b: longitud del camino que recorre la radiación a través del medio absorbente (ancho del recipiente que contiene la disolución) suele darse en cm. -C: es la concentración de la disolución y se expresa en mol/L,g/l…. Puesto que el coeficiente de extinción molar es constante para un compuesto dadas unas características establecidas, la ley de Beer (en el intervalo de linealidad) permite: A a·b·c A ·b·c CFGS 13 Conociendo el compuesto y, por tanto, su coeficiente de extinción molar, obtenerla concentración a partir de la medición de la absorbancia. Conociendo la concentración y midiendo la absorbancia, calcular el coeficiente de extinción molar y, por tanto, identificar la sustancia.

LINEALIDAD Y DESVIACIONES DE LA LEY DE LAMBERT-BEER Recuerda: Límite de detección (LOD): El límite de detección de una técnica se refiere a la menor concentración o cantidad de analito detectable por el procedimiento analítico. Dicho de otra forma, es la concentración que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de una muestra blanco. Límite de cuantificación (LOQ): Indica la mínima concentración de analito con que se puede realizar medidas precisas. Límite de linealidad (LL) (Límite de respuesta lineal): se refiere a la concentración de analito a partir de la cual la curva de calibración no presenta un comportamiento lineal con respecto a la señal analítica.

Es el valor máximo de concentración para el que la señal registrada por el instrumento de medida y la concentración son directamente proporcionales. Intervalo lineal (intervalo de concentración aplicable): señala el intervalo útil de trabajo de un método analítico y va desde el límite de cuantificación al límite de respuesta lineal. Es el intervalo de concentraciones entre las cuales existe una relación lineal entre la concentración y la absorbancia (es decir, se cumple la ley de Beer).

La lectura de una absorbancia fuera de los límites de linealidad proporciona concentraciones falsas; ante esta situación, hay que diluir la muestra para poder interpolar su valor que su concentración quede dentro de los límites de linealidad y tener en cuenta el factor de dilución en el cálculo de la concentración de la muestra problema. Por tanto, al trabajar debemos asegurarnos de que nos encontramos en el rango de concentraciones que presentan una relación lineal con la absorbancia (intervalo lineal) CFGS 14 Teniendo en cuenta lo anterior, existen limitaciones a la L-LB que pueden ser: Técnicas: Desviaciones instrumentales Alteraciones en la luz incidente. La cubeta.

El material de fabricación y su grosor, estado de mantenimiento (si está limpia, si tiene rayaduras o golpes, etc.) Dependientes de las características del analito Si su concentración es relativamente pequeña y además, existen en la muestra concentraciones elevadas de electrolitos que son capaces de alterar, su absortividad molar. Cuando existen impurezas en la muestra que presentan absorción o emisión de la radiación a la longitud de onda del análisis. A elevadas concentraciones se producen interacciones moleculares que hacen que la absorción varíe. El intervalo de concentraciones que guardan la linealidad con la absorbancia varía con cada sustancia.

C1 y C2 son las concentraciones límite en las que se cumple la ley de Beer en dos compuestos diferentes. Limitaciones químicas Cuando, por las características de la técnica o del analito, se produce una interacción química (asociación, disociación o reacción) de éste con otras sustancias de la muestra o de los reactivos, resultando un compuesto que presenta un espectro de absorción distinto al del analito. Es necesario controlar el pH de la solución, ya que a diferentes pH se absorben diferentes longitudes de onda. CFGS 15 Los reactivos comerciales están preparados para que las distintas técnicas de análisis se realicen dentro del rango lineal de la ley de Lamben Beer.

Cuando, por las características de la muestra o del analito, la técnica se encuentre fuera del rango lineal, se indica en el protocolo el sistema de corrección. EQUIPO-INSTRUMENTACIÓN De forma general, El instrumento que se emplea es el espectrómetro de absorción molecular. Los espectrofotómetros miden físicamente la transmitancia y efectúan un cálculo matemático para obtener los valores de absorbancia. Convirtiendo la transmitancia en absorbancia se consigue una relación lineal y positiva. Responde al esquema general visto en el apartado 3.

Elementos específicos para absorción molecular en UV-Visible: Por lo tanto el análisis cuantitativo mediante método de absorción molecular (UV-V) Se basa en la capacidad de absorber, de captar selectivamente ciertas frecuencias de la radiación electromagnética por la especie a determinar o por un producto de la transformación de dicha especie siempre que se cumplan las condiciones de la Ley de Lambert- Beer. Se mide la disminución de la potencia de la radiación electromagnética producida como consecuencia de esa absorción selectiva.

La ley de L-Beer sólo se cumplirá si: - La radiación incidente sobre la sustancia de interés es monocromática (una única λ) Esto implica que siempre hay que utilizar un sistema de selección de λ antes de que la luz interaccione con la muestra. La elección de la λ que se va a utilizar en el análisis depende fundamentalmente del espectro de absorción del analito. - La absorción del solvente es insignificante en comparación con la absorbancia del soluto. La concentración de éste se mantiene dentro de "límites lineales".

No es aplicable para concentraciones superiores a 0,01M ya que la relación entre absorbancia y concentración deja de ser lineal - No se produce una reacción química entre la molécula de interés y otro soluto o molécula de solvente. CFGS 16 Dependede (λ) UTILIZADA Región UV Región Visible - Fuentede energía radiante Lámpara de deuterio (H2) Lámpara de wolframio o Tungsteno (W) También se puede emplear como fuente Dispositivo láser.(de línea) - Celdas o Cubetas Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo.

Suelen tener ancho 1 cm.(b) Cuarzo, plástico Vidrio, Plástico - Detector Fotomultiplicadores, ya que son más sensibles Según la disposición de los componentes, se pueden clasificar en espectrofotómetro de haz simple y o de doble haz: -Espectrofotómetro de haz simple La muestra se coloca en línea recta entre la lámpara y el detector Espectrofotómetros de doble haz - Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo. Permiten estudiar a la vez dos muestras, la muestra problema y el blanco.

Para hacerlo, la luz proveniente de la fuente es dividida en dos haces después de salir del monocromador gracias a un dispositivo con capacidad reflectante (chopper), Una de ellas atraviesa la cubeta en que se deposita el blanco y la otra atraviesa la cubeta en que está la muestra. A continuación, las radiaciones separadas son reorientadas mediante espejos para que lleguen al mismo detector, que mide alternativamente las intensidades de ambas. - Espectrofotómetros de doble haz en el espacio. Todos los componentes están duplicados menos la lámpara; dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los componentes separados en el espacio.

CFGS 17 De este modo tenemos una medida de blanco por cada medida de la muestra. También se pueden emplear fotocolorímetros, pero éstos solo permiten mediciones en la región del visible. METODOLOGÍA CUANTITATIVA DE LA E. DE ABSORCIÓN MOLECULAR Se basa en la medida, a una λ fija (monocromática), de la A selectiva de una disolución del analito contenida en una cubeta transparente de camino óptico b cm. 1- Selección de la longitud de onda Para obtener máxima sensibilidad, de forma general, realizar las medidas de A a una λ que corresponda a un máximo de absorción λ max.

Espectro de absorción: Un espectro de absorción es una representación gráfica de la absorbancia de un analito(o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación λ (o de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada). El máximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un analito, nos dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto será la que se utilizará en el análisis espectrofotométrico de dicho analito. Ocasionalmente, se realizan determinaciones a una λ que no coincide con el máximo para reducir así la posibilidad de interferencias debidas a otras sustancias.

CFGS 18 Si una solución absorbe luz entre 400 y 480 nm (azul), tendrá un color amarillo. Por tanto., el amarillo es el color complementario del azul. Igualmente, si absorbe el color verde, la solución presentará un color púrpura 2- Efectuar la medida del "blanco" Blanco: formado por todos los elementos que intervienen en la reacción excepto por la sustancia a cuantificar (tampones, reactivos, etc.). Miden la respuesta del procedimiento analítico a las impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos o, simplemente, a las especiales características del instrumento de medida.

Su empleo es necesario porque algunos de estos elementos pueden reaccionar inespecíficamente o bien sean capaces de absorber en la misma banda del espectro en la que vamos a medir. Si ocurriera esto, la absorbancia medida en la cubeta de la muestra problema se debería no solo a la sustancia a valorar, sino también a esta interferencia. Por ello, si se mide la absorbancia del blanco, podemos restarla (a la de la muestras y patrones), dejando únicamente la que se debe al compuesto que nos interesa. Algunos equipos lo hacen directamente.

3- Determinación de la relación entre la absorbancia A y la concentración c: calibración Calibración externa (método de estándar externo) Método de las adiciones estándar a) El método de un solo punto b) El método de las adiciones múltiples Calibración externa (método de estándar externo) La matriz debe ser la misma en muestra problema y en muestras patrón, Por tanto si se determina un mismo analito en dos muestras con diferente matriz, cometeremos un error. Mediante factor de calibración: Se emplea un solo patrón Patrón (estándar): Solución que contiene una cantidad conocida, exactamente medida, de un analito.

Se CFGS 19 emplea como referencia en el análisis para cuantificar las muestras problemas. FACTOR DE CALIBRACIÓN: FACTOR NUMÉRICO POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR UNA INDICACIÓN PARA OBTENER EL VALOR MEDIDO CORRESPONDIENTE. PUEDE SER CONSTANTE O VARIAR CON EL VALOR DE LA INDICACIÓN. El factor de calibración es la inversa del coeficiente de absorción molar, si b = 1 cm: Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (operador, instrumental, lote de reactivos, etc.) requiere, al igual que ocurría con las curvas de calibración, el cálculo de un nuevo factor.

Construyendo la curva de calibrado: (ver procedimiento práctica) Se lleva a cabo la comparación de señal de analito en la muestra con las obtenidas al medir una serie de patrones preparados. TIPOS DE MÉTODOS Campo de aplicación Cuando se emplea la espectrofotometría de absorción molecular en la región del espectro correspondiente a la luz visible se habla de métodos colorimétricos, con ellos se pueden determinar: Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición.

Especies no absorbentes: La mayoría de los analitos de interés bioquímico no absorben luz y hay que utilizar métodos indirectos o colorimétricos, se basan en convertir dichos analitos en productos coloreados que absorban y se puedan medir por espectrofotometría. Para ello hay que acoplar una reacción en la que el compuesto que queremos determinar origina un producto que o bien absorbe en el espectro visible, o bien vuelve a participar en otra reacción cuyo producto sí es capaz de absorber.

Reactivo de trabajo: transforma el compuesto a determinar en un compuesto estable que absorbe a una determinada longitud de onda Esto se puede lograr con 2 tipos de métodos: Métodos colorimétricos no enzimáticos: El analito reacciona con un compuesto específico (reactivo comercial) para formar un complejo coloreado, de manera que la absorbancia del producto final es proporcional a la cantidad de analito CFGS 20 que contenía la muestra. Ejemplo: Determinación de proteínas totales mediante el método de Lowry. Métodos colorimétricos enzimáticos: En este caso, se usa como reactivo una enzima. El analito en cuestión sería el sustrato (S) de esa enzima (E).

El sustrato se une al sitio activo de la enzima y se forma un complejo ES. El sustrato es transformado en un producto coloreado (P) por acción de la enzima y este producto es liberado y medido espectrofotométricamente. Ejemplo: TIPOS DE MEDICIONES Cabe destacar 3 grupos de técnicas, en función del momento de la reacción en el que se lleve a cabo la medida de la absorbancia: Técnicasdepuntofinal Se añade el reactivo o la enzima a la muestra y se espera a que finalice la reacción (formación del color), dejándoles el tiempo necesario para que la reacción se complete del todo, proceso que recibe el nombre de incubación.

Cuando finaliza el proceso se determina la absorbancia del producto obtenido y a partir de ésta se calcula la concentración utilizando un factor de concentración adecuado. Por lo tanto se considera solo un valor de absorbancia y ésta es la que presenta el cromóforo una vez acabada totalmente la reacción. (Muchas veces, al reacción química que ha dado lugar al color es estable durante un cierto tiempo, ½ hora, una hora, etc. que indica el prospecto de los reactivos) Técnicadedospuntos Se determina la absorbancia en distintos momentos del tiempo total que dura la reacción (A1 y A2).

El intervalo de tiempo que, en cada caso, se escoge para las dos lecturas de absorbancia permite eliminar gran parte de las interferencias en la técnica empleada. CFGS 21 Se calcula la concentración mediante la fórmula: Cx = [(A2 – A1 ) problema / (A2 – A1 )patrón ]. Cp Técnicascinéticas Las técnicas basadas en la medición de la absorción en el espectro UV, se utilizan casi siempre para la determinación de enzimas séricas. No son métodos colorimétricos. Utilizan el incremento de la absorbancia respecto al tiempo, es decir, la velocidad de formación del producto de la reacción o la velocidad de desaparición del sustrato.

Se utilizan en pruebas enzimáticas (determinación de la actividad de un enzima) y en pruebas mediadas por enzimas. En este caso, la ley de Lambert-Beer se modifica, de forma que se mide la variación de la absorbancia ( A) por unidad de tiempo (generalmente por minuto): A/min = a b C El esquema más habitual de este tipo de reacciones es la medición del consumo de NADH o NADPH (en ocasiones su generación). El NADH y el NADPH son coenzimas de enzimas deshidrogenasas, que se caracterizan por absorber en el UV, de modo que se puede seguir el desarrollo de la reacción en función del consumo o generación de NADH y, por tanto, del aumento o disminución de la absorción a 340 nm.

4.2 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA UV-Visible UTILIDAD CLÍNICA Medir la concentración en los líquidos biológicos de metales como cadmio, calcio, cobre, cromo, hierro, magnesio, en concentraciones a nivel de traza ( cuando las concentraciones que se van a medir son de partes por millón (ppm). FUNDAMENTO La absorción no se lleva a cabo en disolución, sino sobre los átomos en estado de vapor, ya que es cuando están en su estado fundamental. Esto implica que la muestra se tiene que someter a una etapa de atomización donde se calienta hasta formar el vapor atómico. Sobre el vapor atómico originado se hace incidir la radiación electromagnética produciéndose la absorción.

La cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración de átomos absorbentes, por lo tanto también se aplica la ley de Lambert-Beer. También se trabaja en la zona del espectro UV-visible. La longitud de onda a la cual es absorbida es específica para cada elemento en particular.

EQUIPO - INSTRUMENTACIÓN El espectrofotómetro de absorción atómica es similar al descrito para la espectrofotometría de absorción molecular, puesto que dispone de monocromador, detector y sistema de registro, pero CFGS 22 tienen características propias en cuanto a la fuente de radiación y al tratamiento de la muestra (Atomización) o Fuente de radiación: Se utilizan las lámparas de cátodo hueco: es una lámpara de vidrio que contiene en su interior un gas inerte, como argón o neón, y el electrodo de trabajo. El cátodo es del material del mismo elemento que se pretende analizar en la muestra (analito), por lo tanto se debe emplear una lámpara distinta según el elemento que se quiera estudiar.

Los átomos del cátodo se excitan al chocar con los átomos del gas emitiendo la radiación característica del elemento que se analiza. Existen lámparas con varios cátodos que permiten la medida de varios elementos atómicos a la vez. o Sistema de atomización: Según el mismo se distinguen dos métodos (técnicas) diferentes: - Espectrometría de absorción atómica con llama: La atomización se consigue por llama: Se emplea un mechero de flujo laminar para producir la atomización. El sistema está constituido por un nebulizador, la cámara de premezcla y el quemador. La muestra líquida es aspirada por un capilar hasta el nebulizador donde se produce la transformación de la misma en un aerosol.

A continuación se mezcla con los gases en la cámara de premezcla y en el quemador se somete a la llama. Durante la combustión los átomos de los elementos de interés de la CFGS 23 muestra son reducidos a átomos elementales, en estado basal no excitado, pudiendo de este modo absorber. La luz pasa a través de la llama, los átomos absorben y el detector registra la intensidad de luz transmitida, siendo el paso óptico, en este caso, la longitud de la llama. Las características de cada llama (forma, temperatura, velocidad de combustión) dependen de la mezcla de gases que la componen. Por ejemplo, la mezcla de oxígeno con acetileno origina temperaturas de 3.000 ºC.

- Espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica: El sistema de atomización es un horno de grafito. Este horno está formado por: Un tubo de grafito sujeto por dos electrodos. El tubo tiene un orificio central por donde se introduce la muestra. Los electrodos dan lugar a una corriente que va calentando el tubo y así se atomiza rápidamente la muestra. Se emplea menos volumen de muestra, que pueden ser viscosas e incluso sólidas. Un sistema de refrigeración por agua y gas Medición y calibrado Método de estándar externos. Método de adiciones estándar 5.

MÉTODOS DE EMISIÓN: Miden la radiación electromagnética emitida por los átomos o moléculas del analito cuando éste es excitado por energía térmica, eléctrica o radiante. Generalmente la energía necesaria para la excitación es tan alta que las especies moleculares se disocian, con lo cual se emiten espectros atómicos o iónicos característicos de cada elemento excitado. 5.1 ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA: FOTOMETRÍA DE LLAMA Técnica que utiliza el calor aplicado mediante llama para producir la atomización y tb la excitación atómica, carece de la fuente de luz. Indicaciones: metales alcalinos y los alcalinotérreos.

No obstante, en la actualidad ha sido sustituida por técnicas de electrodo selectivo. CFGS 24 5.2 ESPECTROFOTOMETRÍA DE EMISIÓN MOLECULAR: Dentro de esta se encuadran los fenómenos de Luminiscencia. Luminiscencia todo fenómeno de emisión de luz que no está asociado a altas temperaturas. Es la llamada luz fría. En la mayoría de los casos, la vuelta al estado fundamental de una molécula excitada se lleva a cabo mediante la emisión de energía térmica. Sin embargo, hay moléculas que se desactivan emitiendo luz además de calor. La energía del haz de radiación emitida es menor (por lo tanto tiene mayor λ) que el haz incidente o de excitación.

En estos métodos de emisión molecular se mide la luz fluorescente emitida por moléculas denominadas fluorocromos siendo el fluoróforo la parte del fluorocromo responsable de emitir la fluorescencia. Con frecuencia, se trata de compuestos aromáticos. Según el origen de la excitación molecular, los fenómenos luminiscentes se clasifican en: Fotoluminiscencia. La más empleada. La excitación tiene lugar por absorción de fotones. Puede ser: Fluorimetría, se emite durante un corto periodo, ronda los 10-8 segundos. Fosforimetría, se emite durante un largo periodo, incluso horas. Medición y calibrado Método de estándar externos con un solo patrón.

Se denomina rendimiento cuántico o eficacia cuántica de fluorescencia o de fosforescencia de una molécula a la relación entre relación entre fotones emitidos y fotones absorbidos. Puede variar de 0 (sustancia no fluorescente) a 100 (fluoróforos óptimos). La emisión de fluorescencia se puede relacionar con la cantidad de moléculas que emiten: IF=I0.K.C IF=Intensidad de fluorescencia; I0=Intensidad de excitación; C=Concentración molar. CFGS 25 La intensidad de fluorescencia emitida es directamente proporcional a la concentración dela sustancia, por lo que es aplicable la ley de Lambert-Beer, pero hay que tener en cuenta que: Esta ecuación solo se cumple si la absorbancia (A) es < 0,05.

De acuerdo con la ley de Lambert Beer (A = λ. b. C) como λ y b son constantes, para que la absorbancia sea baja, se tiene que trabajar con muestras diluidas. EQUIPOS - INSTRUMENTACIÓN Los dispositivos empleados se llaman fluorímetros o espectrofluorímetros. Básicamente presentan los mismos elementos que los espectrofotómetros de absorción molecular (punto 3) aunque con algunas diferencias: Fuente de excitación o de energía radiante son lámparas de arco de xenón. Para tener una señal de fluorescencia aceptable, es necesario excitar el mayor número posible de moléculas, para ello se utilizan lámparas capaces de emitir luz de alta intensidad, como es el caso de éstas.

Tienen dos monocromadores: Uno para seleccionar la λ de entrada, de excitación (entre la lámpara y la muestra) y otro para seleccionar la λ de salida, de emisión (entre la muestra y el detector). Detectores: se coloca en un ángulo de 90°conrespecto a la luz incidente de forma que solo detecta la luz emitida y no la luz incidente residual que pasa directamente a través de la muestra. Cubeta. Son de cuarzo, (el plástico puede causar fluorescencia adicional). Todas las caras transparentes, ya que la detección se hace perpendicularmente a la excitació. Deben estar termostatizadas, ya que la fluorescencia depende fuertemente de la temperatura. Utilidades clínicas: -Medida de proteínas.

Los aminoácidos que poseen grupos aromáticos son Triptófano, Tirosina y Fenilalanina. La determinación de fenilalanina para dg precoz de la fenilcetonuria puede realizarse por fluorometría. -Detección de fármacos y drogas y a que gran parte de ellos poseen grupos aromáticos -Medida de vitaminas (las vitaminas A, B2, B12 y E presentan fluorescencia nativa; la vitaminas C y D pueden ser tratadas para presentar fluorescencia secundaria) CFGS 26 -Medidas de hormonas (estrógenos, corticoides, catecolaminas) y de porfirinas. El fluoroinmunoanálisis (FIA) en el que se emplean anticuerpos específicos de la sustancia a estudiar, marcados con una sustancia fluorescente.

Quimioluminiscencia La energía de excitación proviene de una reacción química de tipo oxidativo. La reacción química que se produce es la oxidación de un compuesto orgánico luminiscente (luminol, isoluminol, éster de acridinio) por un oxidante (peróxido de hidrógeno, hipoclorito, oxígeno) y la luz es emitida por el producto formado en la reacción de oxidación. Aplicación en el campo de la inmunoquimioluminiscencia. 6. MÉTODOS DE DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN Se basan en la formación de partículas insolubles, que provocan una turbidez, la cual dispersa la energía radiante, interfiriendo con el paso de la luz a través de la solución.

Para formarse las partículas el analito debe reaccionar con un reactivo o anticuerpos anti analito que se añade. La dispersión y cantidad de luz dispersada depende fundamentalmente de la λ de la radiación incidente y del tamaño y la cantidad de partículas. Estos factores, se relacionan entre sí mediante fórmulas matemáticas complejas que constituyen la ley de Rayleigh, que expone que la dispersión de la luz es: Directamente proporcional a: La concentración de las partículas de la muestra Al peso molecular de las partículas de la muestra Inversamente proporcional a: La longitud de onda CFGS 27 Al cuadrado de la distancia entre el detector y la cubeta.

La espectrometría de dispersión incluye dos técnicas analíticas que permiten la determinación de la concentración de partículas en suspensión son: TURBIDIMETRÍA Técnica que determina la concentración de la sustancia que compone las partículas de una suspensión mediante la medición de la disminución de la intensidad del haz de luz (transmitancia) que atraviesa la cubeta que contiene la suspensión, una vez que fue dispersada. (Recuerda: en el caso de la absorción molecular la disminución de la intensidad era una vez absorbida la REM).

La turbidez es directamente proporcional a la concentración de partículas dispersantes (analito): Cuanto mayor es la concentración de las partículas en suspensión, mayor la turbidez que hay en ella y un mayor bloqueo al paso de la luz o, lo que es lo mismo, mayor cantidad de luz se dispersa y por tanto menor cantidad de luz se transmite y puede emerger de ella en la misma dirección que el rayo incidente. En ocasiones se habla de absorbancia aparente en lugar de dispersión. Se cumple la ley de Beer, Sustituyendo el coeficiente de absorción por una constante "k" que depende del tamaño y la forma de las partículas y de la longitud de onda.

Aa= K.C EQUIPO Las medidas se pueden realizar empleando: Espectrofotómetros ordinarios: VIS-UV, ya que el detector se coloca en línea directa con la luz incidente. NEFELOMETRÍA Cuando la luz incide en una suspensión homogénea de partículas, una parte de ella es dispersada en todas las direcciones. Determina la concentración de la sustancia que compone las partículas en suspensión mediante la medida de la cantidad de luz que éstas dispersan en un determinado ángulo, respecto a la luz incidente. Requiere un aparato especial, el nefelómetro, en los que encontramos a los detectores están situados en ángulos que oscilan entre 15º y 90º respecto a la dirección del rayo incidente de radiacción.

A bajas concentraciones, Is=Ks I c Donde: - Is es la radiación dispersada. - Ks es una constante que se obtiene a partir de una curva de calibración. - I es la radiación de fuente incidente. - c es la concentración. CFGS 28 APLICACIÓN TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA Las principales aplicaciones en laboratorio clínico son la medida de proteínas plasmáticas específicas como la albúmina, las apolipoproteínas, etc y para ensayos cuantitativos que usan complejos antígeno anticuerpo. La elección del método depende de la concentración de la suspensión. La turbidimetría suele elegirse cuando las partículas son más grandes o las suspensiones están más concentradas.

(para medir las muestras densas y visiblemente turbias). En general, la nefelometría tiene mayor sensibilidad que la turbidimetría y se utiliza cuando la muestra contiene pocas partículas dispersantes y/o su tamaño es pequeño, su aplicación por excelencia es la cuantificación de las reacciones Ag-Ac. 7. ESPECTROMETRÍA DE REFLECTANCIA (REFLEXIÓN). QUÍMICA SECA Química seca: Técnica que consiste en el empleo de reactivos previamente deshidratados estabilizados y fijados en una matriz porosa, se denominan como "reactivos de unidad" ya que son preparados para una determinación única (son específicos del analito de interés). Un mismo sistema reactivo puede incorporar varias determinaciones.

La muestra que tiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, líquido cefalorraquídeo u orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida, aquí comienza a difundirse en la matriz disolviendo los reactivos en el proceso, ocurriendo consecuentemente la reacción que permitirá cuantificar el analito. Actualmente los sistemas reactivos son: Tiras reactivas: usadas en el análisis de orina y en pruebas de diagnóstico rápido a la cabecera del paciente (POCT). Películas multicapa (slides): usadas en autoanalizadores en los laboratorios de bioquímica clínica. Permite determinar la mayoría de magnitudes biológicas.

CFGS 29 La lectura de ésta técnica se realiza por inspección visual o la reacción es cuantificada por medio de espectrofotometría de reflectancia, empleando un espectrofotómetro de reflexión. Slides: Es una lámina que contiene los reactivos que permiten la determinación del analito que se va a estudiar. Está constituida por las siguientes capas: Soporte. Es la capa sobre la que se construye todo el reactivo en fase sólida. Generalmente es una lámina de plástico transparente que deja pasar la luz que permitirá medir la reacción. Capa reflectante. Su función es reflejar la luz.

Puede tener distintas composiciones (sulfato de bario, óxido de titanio, etc.), pero la condición fundamental es que el material elegido para construirla tenga una absorbancia prácticamente nula a la longitud de onda de trabajo para asegurar una alta sensibilidad en la lectura. Capa reactiva o analítica. Contiene, en forma deshidratada, todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para que se produzca la reacción. Los reactivos son reconstituidos mediante la rehidratación por el agua de la muestra. Capa difusora. Es una capa porosa.

Su función es hacer que, tras la aplicación de la muestra, esta difunda rápidamente hacia los laterales para conseguir una distribución uniforme de volumen de muestra por unidad de reactivo. También actúa como filtro evitando entrada de células.. Tiras reactivas Básicamente están constituidas por: -Soporte de plástico -Matriz de celulosa que contiene los reactivos -Algunas pueden tener capas que funcionan como filtro para evitar que pasen determinadas moléculas…

Fundamento de la espectrometría de reflectancia Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, se produce un efecto de rebote o cambio de dirección, es decir, el haz experimenta una reflexión, por lo que para poder usar esta técnica para determinar analitos en muestras biológicas (líquidas), se tienen que utilizar reactivos en fase sólida (química seca). CFGS 30 Ahora bien, no toda la radiación incidente es reflejada y una parte de ésta puede ser absorbida por la superficie.

El resultado de dividir el flujo de luz reflejada entre el flujo de luz incidente recibe el nombre de reflectancia: R= Ir/I0 El haz de luz que se hace incidir sobre la superficie sólida (tira o el slide), tras producirse la reacción química, tiene una longitud de onda que será absorbida por los productos de la reacción que interesa conocer. El resto de la radiación será reflejado en múltiples direcciones (reflexión difusa). La fotometría de reflectancia mide la intensidad de la luz reflejada y la relacionan con la concentración del analito de interés. La intensidad de este rayo será menor y proporcional a la intensidad del color de la tira en cuestión. EQUIPO.

El instrumento que se utiliza en la espectrometría de reflectancia es el espectrofotómetro de reflexión, cuya estructura es similar al espectrofotómetro de absorción: Fuente de luz. Se utilizan las lámparas de haluro de tungsteno o de xenón. Sistema óptico. Reactivos de fase sólida (química seca). tiras reactivas o reactivos multicapa sobre los que se aplica la muestra. Detector, procesador de datos. Permiten obtener un espectro de luz reflejada que se corresponde con la concentración del analito reactante. Sistema de lectura. La medida se realiza directamente sobre el reactivo en fase sólida sobre el que se deposita la muestra.

La reflectancia se puede medir: Sobre la superficie, en el caso de los sistemas que emplean las tiras reactivas. Sobre el reverso de la superficie, en el caso tiras reactivas de los reactivos multicapa. El espectrofotómetro irradia en la cara inferior del slide y la luz reflejada es recogida por el detector para su cuantificación y lectura. CFGS 31 8. TÉCNICAS INSTRUMENTALES NO EMPLEAN REM 8.1 ESPECTROMETRÍA DE MASAS (EM, MS en inglés) Fundamento Es una técnica compleja y especializada para determinar cualitativa y cuantitativamente una determinada sustancia.

Se basa en obtener iones en estado gaseoso a partir de las moléculas de una muestra y en la posterior separación de los iones en función de su relación masa/carga (m/z) en un sistema vacío. Finalmente se obtiene un espectro de masas que es una representación gráfica de la relación masa/carga de cada ión frente a la cantidad del mismo. Se denomina por esta razón "huella digital de la sustancia". De esta forma, el espectro de masas permite la identificación inequívoca de las moléculas. La espectrofotometría de masas no se puede considerar una técnica espectrofotométrica puesto que no utiliza ningún tipo de REM.

Los procesos que se originan en los espectrómetros de masas son químicos, esto significa que la muestra no se va a poder recuperar (se destruye), porque además de quedar modificada químicamente, los iones se destruyen al ser detectados. (en el caso de la espectrofotometría los procesos son físicos y no producen destrucción de las moléculas). Sin embargo presenta características muy ventajosas como: Especificidad, al poder medir la masa molecular de un analito y de sus fragmentos iónicos, puede detectar y diferenciar cualquier molécula. Sensibilidad, Pueden detectarse concentraciones muy pequeñas del analito.

Versatilidad Es aplicable a todo tipo de muestras, volátiles, no volátiles, polares y apolares, sólidos, líquidos y gases. Además, se emplea en combinación con técnicas de separación cromatografía y electroforesis. Es especialmente potente cuando se acopla a una técnica de separación previa como la cromatografía. CFGS 32 Equipo: espectrómetro de masas: Componentes del espectrómetro de masas: Elementos de Espectrofotómetro de masas Fase de la técnica Fuente de ionización 1. Volatilizar la muestra problema: se obtienen las moléculas a estudio neutras en estado gaseoso. 2. Ionizar las moléculas (disociarlas en iones cargados eléctricamente) en estado gaseosos formándose una nube de iones.

Analizador de masas 3. Acelerar los iones: se someten a un campo eléctrico adquiriendo movimiento. 4. Separar los iones: La nube acelerada se somete a un potente campo magnético de forma que los iones se separan. Por tanto separan las moléculas en función de su relación masa/carga mediante campos eléctricos y magnéticos en cámaras de vacío para facilitar la movilidad y dirigirlas hacia el detector. Detector de iones y procesador de datos Recoge y caracteriza los fragmentos iónicos que salen del analizador. Mide exactamente el grado de desviación de cada ion y, a partir de ese dato, se calcula el cociente masa por unidad de carga.

De la misma manera que en los espectrofotómetros, esta señal es amplificada, registrada y digitalizada. Con esta información es posible determinar la composición química de la muestra original. Aplicaciones de la espectrometría de masas La espectrometría de masas es una técnica de amplia utilización en la determinación de compuestos orgánicos. Algunas de sus aplicaciones son: CFGS 33 En las técnicas de screening neonatal para la detección de enfermedades metabólicas hereditarias. se suele utilizar la espectrometría de masas en tándem acoplada a cromatografía líquida. En toxicología es el método de referencia para la detección de cocaína, marihuana, etc.

En la monitorización de fármacos con el objeto de personalizar tratamientos. 8.2 OSMOMETRÍA Ósmosis: fenómeno que tiene lugar cuando en un proceso de difusión interfiere la presencia de una membrana semipermeable en el desplazamiento de las moléculas o partículas dispersas.

Esta, solo deja pasar libremente el agua y algunas moléculas habitualmente no cargadas, retiene a la mayoría de los solutos, estos se consideran osmóticamente activos porque generan una presión (presión osmótica) La presión osmótica producida por la diferencia de concentraciones electrolitos entre ambos medios produce un flujo de agua del compartimento más diluido al más concentrado para mantener equilibrada las concentraciones a ambos lados de la membrana. El paso de las moléculas a través de la membrana es la ósmosis y la fuerza con que se manifiesta es la presión osmótica.

"osmol", unidad de actividad osmótica, define el nº de moles de un compuesto químico que contribuyen a la presión osmótica de una disolución. Un osmol es un mol de partículas osmóticamente activas. Existen dos formas de expresar la concentración de soluto en una solución: CFGS 34 Osmolalidad = nº de partículas de soluto soluto por Kg de disolvente. Una solución que contiene 1 osmol de soluto por kilogramo de solvente tiene una concentración 1 osmolal Osmolaridad= nº de partículas de soluto (moles) por unidad de volumen de solución (l). Una solución que contiene 1 osmol de soluto por litro de solución tiene una concentración 1 osmolar.

Osmolalidad: nº osmoles/ Kg de disolvente Osmolaridad: nº osmoles/l de disolución Para las soluciones acuosas de concentraciones bajas, por ejemplo, líquidos corporales, la diferencia entre osmolalidad y osmolaridad resulta insignificante, por lo que normalmente se utilizan miliosmoles por litro (1osmol = 1.000 mosmol). La osmolaridad plasmática es la concentración molar de todas las partículas osmóticamente activas en un litro de plasma. La osmolalidad plasmática es la concentración molar de todas las partículas osmóticamente activas pero referida a 1 Kg. de agua.

El equipo empleado para medir la osmolalidad de una solución se calcula con un aparato llamado osmómetro, se basa en las propiedades coligativas de las disoluciones. En clínica el más utilizado es el osmómetro de descenso de punto de congelación o crioscópico: Es la disminución del punto de congelación que experimenta una disolución respecto al disolvente puro como consecuencia de los solutos que contiene. (1 osmol de cualquier soluto disminuirá el punto de congelación de 1 Kg de agua en 1,86 °C) Cuando aumenta la osmolalidad se produce una disminución del punto de congelación. El descenso crioscópico es registrado y convertido en una medida de osmolalidad.

En el LAB, la utilidad de estas medidas es el estudio del equilibrio hidroelectrolítico (UD 7), la capacidad de producir y concentrar orina, detectar toxinas en cuerpo.